端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法
【专利摘要】本发明公开了端黑萤(Luciola?praeusta?Kiesenwetter)胚胎的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法，该方法包括端黑萤胚胎的预处理、去壳、与冷冻保护剂混合进行五步平衡处理、平衡处理后的混合物在液氮中冷冻保存、复温和孵育。采用本发明方法冷冻保存端黑萤胚胎，冷冻后的端黑萤存活率高、冻后繁殖率高，能适用于端黑萤不同亚系胚胎的冷冻保存。
【专利说明】端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及端黑萤(Luciola praeusta Kiesenwetter)的冷冻保存方法,是一种在液氮中长期保存萤火虫胚胎的玻璃化冷冻方法，属萤火虫的冷冻保存领域。
【背景技术】
[0002]端黑萤(Luciolapraeusta Kiesenwetter)为銷翅目(Coleoptera)萤科(Lampyridae)昆虫,分布于热带亚热带温带地区,喜栖于温暖潮湿草木繁盛的地方。它们体色为橙黄色，雄虫腹部末端有两节乳白色发光器，雌虫有一节发光器，体形略较雄虫大。成虫夜行性，喜欢在树梢上端飞舞，发橙黄色光，闪烁频率快，但持续时间不长，发生期为6-8月间，也是夏季中值得观赏的萤火虫；幼虫陆生，以蜗牛，蚯蚓，昆虫等为食。卵外观黄色，呈球型。
[0003]我国是一个萤火虫资源较为丰富的国家，但由于近来城市过度开发和环境资源的破坏，由于栖息地的开发与破坏，目前萤火虫的种族数量日渐减少，某些萤火虫资源面临衰退和濒临灭绝。如果不及时采取保护措施，若干年后，在自然界中难以找到许多萤火虫原种、良种的遗传资源。因此，建立重要萤火虫及珍稀萤火虫的品种资源库，将这些萤火虫的品种资源和遗传多样性以活的形式长期保存起来，已成为萤火虫资源保护的重要科技问题。
[0004]由于萤火虫卵和胚胎体积大(直径0.5-7_，哺乳类卵直径多在200μπι以内)，单个胚胎为多量不同种细胞，且含水量多，不同于单细胞和少细胞的哺乳类卵，故冻存上较后者困难，而且，冻存需要大量的萤火虫胚胎，而大量的水生、半水生品种的萤火虫不易获得，人工捕捉后容易迅速死亡，且萤火虫繁殖受时间和空间限制，因此萤火虫胚胎的获取途径较少。迄今，国际上尚未建立萤火虫类胚胎超低温冷冻保存的有效技术。
[0005]根据冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶，冻存方法可分为玻璃化(快速)和非玻璃化(慢速)两种。尽管玻璃化冷冻保存技术在低温生物学研究中起步较晚，但由于其良好的冻存效果和潜在的发展前景，备受关注，因此发展较快。目前玻璃化冷冻保护技术已成功应用于哺乳动物，卵母细胞，淋巴细胞，人卵母细胞和人胚胎，玻璃化冷冻保存也已获得成功。双翅目昆虫如果蝇已有有效的冻存技术。
[0006]玻璃化冻存法是1985年由Rall和Fahy首先提出的一种快速冷冻方法。在玻璃化法超低温保存中起关键作用的是玻璃化保护剂的运用，玻璃化保护剂的浓度和种类对种质资源的保存有着直接的影响，不同保护剂的渗透力和对保存细胞的毒性存在较大的差异。玻璃化冷冻采用的保护剂浓度远高于常规冷冻的浓度，目的是为了使玻璃化液在冷冻过程(由零度以上温度浸入液氮)中，由液态转变为一种类似“玻璃”的非结构状态，但没有冰晶形成，所形成的“玻璃”结构保持着液态时正常的离子分布，维持了正常的超微结构，减少了对胚体及细胞损害，提高了冷冻复苏率和繁殖率。可见，提高保护剂的浓度能够促进玻璃化的形成，减少冰晶的损伤，但是过高的保护剂浓度又会对胚体造成渗透损伤，毒性致死。因此，必须在二者之间寻求到一种平衡，使得胚胎在该浓度的处理下冷冻效果最佳。
【发明内容】
[0007]本发明目的在于提供端黑萤胚胎玻璃化冷冻保存。本发明不仅能用于萤火虫稀有种类保护，还可以使萤火虫的繁殖不再受季节限制。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案来实现，包括以下步骤:
[0009]A:选择卵 期在10-20天之间的的端黑萤胚胎；
[0010]B:端黑萤胚胎灭菌处理:用自制萤火虫胚胎灭菌液对选择的端黑萤胚胎进行表面清洁、消毒、杀菌和灭真菌；
[0011]C:端黑萤胚胎的去卵壳处理；去卵壳处理使用溶液为2-15%次氯酸钠、异丙醇、丁烷、正己烷、石蜡油和DPBS，并进行两次干燥。
[0012]D:端黑萤胚胎与冷冻保护液平衡:将端黑萤胚胎置于20% (室温)、30% (室温)、50% (4°C ),70% (40C )和100% (4°C )冷冻保护液依次进行五步平衡处理；
[0013]E:平衡处理后的端黑萤胚胎与冷冻保护液混合物装入麦管或置于铜箔片上，投入液氮中冷冻保存:若用麦管冻存时，麦管中装入培养液，卵在培养液中，每段培养液之间间隔一段空气，再对于装入卵的麦管密封处理，若用铜箔片则需要将卵平铺并完全包裹。将平衡后的卵与平衡液一起按一定比例装入麦管。将麦管在液氮上方预冷1-2分钟后迅速投入液氮。
[0014]F:从液氮中取出置于复温液中复温；10分钟内完成复温过程。
[0015]G:26°C -28°C>80% -90%湿度的条件下进行孵育。
[0016]本发明其中所述的萤火虫胚胎灭菌液对虫卵完全无毒，含醋酸、双氧水、多粘菌素B、亚胺硫霉素、氣康唑、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、两性霉素B、制霉囷素、木糖醇酷和泊洛沙姆中的两种以上。其中抗生素含量不超过5%。
[0017]本发明其中所述的冷冻保护液由基础液、小分子抗冻剂和玻璃化保护剂组成。复温液由基础液和小分子复温剂组成。基础液为改进的Grace培养液，其中酵母提取物占
0.1-1.0%，水解酪蛋白占0.1-0.8%。抗冻剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇中的两种或两种以上，玻璃化保护剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、胎牛血清、白蛋白中的两种或两种以上。复温剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或两种。
[0018]本发明整个过程均在无菌条件下操作，所有试剂和耗材均无菌或进行无菌处理。
[0019]本发明所述的冷冻保护剂品种均经过筛选，对萤火虫胚胎的毒性相对较小或完全
母O
[0020]本发明具有的优点在于:
[0021]自然界萤火虫卵存活率约10%，采用玻璃化冻存技术，虫卵存活率可达50 %以上，萤火虫卵的存活率提闻，有利于虫种保护；
[0022]玻璃化技术操作简单方便快捷；
[0023]本发明不仅能用于萤火虫稀有种类保护，还可以使萤火虫的繁殖不再受季节限制。
【专利附图】
【附图说明】[0024]图为挑选的拟冻存胚胎(已去除卵壳)的普通光镜照片【具体实施方式】
[0025]下面以本发明的实施例为基础详细说明本发明，但本发明并不局限于此。
[0026]实施例1:
[0027]A:选择卵期在10-20天之间的的端黑萤胚胎或将早期的胚胎培养至10-20天，试剂耗材灭菌处理。无菌操作间和无菌操作台紫外照射30分钟。 [0028]B:在无菌操作间用含5%泊洛沙姆、0.5%亚胺硫霉素、I %两性霉素B和2%环丙沙星的双氧水萤火虫胚胎灭菌液(加氯化钠至等渗)对选择的端黑萤胚胎进行清洗灭菌。
[0029]C:无菌操作台内将干燥后的200颗卵分别用2.6%和8%的次氯酸钠作用3分钟，用80目的筛网捞取胚胎，放入异丙醇中20秒，取出胚胎干燥2分钟，放入正己烷中40秒，取出胚胎干燥2分钟，移入DPBS中清洗。
[0030]D:无菌操作台内将将端黑萤胚胎置于20%、30%、50%、70%和100%冷冻保护液依次进行五步平衡处理。培养基，基础液为改进的Grace培养液，酵母提取物占0.3%，水解酪蛋白占0.5 %，抗冻剂为15 %海藻糖和20 %乙二醇，玻璃化保护剂为5 %聚乙烯吡咯烷酮、5%聚乙二醇、2%葡聚糖和10%胎牛血清。
[0031]E:无菌操作间将平衡后的胚胎和平衡液一起与空气成1:1的比例进行装管，装好后用PVP封管，将麦管紧卡在支撑条上。将支撑条在液氮上方停留1-2分钟，迅速投入液氮。
[0032]F:将支撑条从液氮中取出，在液氮上方停留1-2分钟，将麦管剪短，将胚胎迅速放入37°C复温液中复温2分钟。复温剂为0.5M海藻糖。
[0033]G:将复温后的胚胎放入基础液中洗涤2-3分钟。将洗涤后的胚胎挑出培养，260C下用花泥保湿直至孵化，环境湿度90%。观察到的胚胎存活率达52%。
[0034]实施例2:
[0035]A:选择卵期在10-20天之间的的端黑萤胚胎或将早期的胚胎培养至10-20天，试剂耗材灭菌处理。无菌操作间和无菌操作台紫外照射30分钟。
[0036]B:在无菌操作间用含10%木糖醇酯、0.5%亚胺硫霉素、2%氟康唑、1%庆大霉素和I %链霉素的双氧水萤火虫胚胎灭菌液(加氯化钠至等渗)对选择的端黑萤胚胎进行清洗灭菌。
[0037]C:无菌操作台内将干燥后的200颗卵分别用2.6%，8%和10%的次氯酸钠作用2分钟，用80目的筛网捞取胚胎，放入异丙醇中20秒，取出胚胎干燥2分钟，放入正己烷中40秒，取出胚胎干燥2分钟，移入DPBS中清洗。
[0038]D:无菌操作台内将将端黑萤胚胎置于20%、30%、50%、70%和100%冷冻保护液依次进行五步平衡处理。培养基，基础液为改进的Grace培养液，酵母提取物占0.3%，水解酪蛋白占0.3%，抗冻剂为20%海藻糖和20%乙二醇，玻璃化保护剂为3%聚乙二醇、3%海藻酸钠、I %葡聚糖和15%胎牛血清。
[0039]E:无菌操作间将平衡后的胚胎和平衡液一起与空气成1:1的比例进行装管，装好后用PVP封管，将麦管紧卡在支撑条上。将支撑条在液氮上方停留1-2分钟，迅速投入液氮。[0040]F:将支撑条从液氮中取出，在液氮上方停留1-2分钟，将麦管剪短，将胚胎迅速放入37载药层复温液中复温2分钟。复温剂为0.5M蔗糖。
[0041]G:将复温后的胚胎放入基础液中洗涤2-3分钟。将洗涤后的胚胎挑出培养，26°C下用花泥保湿直至孵化，环境湿度90%。观察到的胚胎存活率达57%。
[0042]实施例3:
[0043]A:选择卵期在10-20天之间的的端黑萤胚胎或将早期的胚胎培养至10-20天，试剂耗材灭菌处理。无菌操作间和无菌操作台紫外照射30分钟。
[0044]B:在无菌操作间用含2.5%醋酸、5%泊洛沙姆、0.5%亚胺硫霉素、I %两性霉素B、I %庆大霉素、I %链霉素的和I %环丙沙星的超纯水萤火虫胚胎灭菌液(加氯化钠至等渗)对选择的端黑萤胚胎进行清洗灭菌。
[0045]C:无菌操作台内将干燥后的200颗卵分别用2.6%和10%的次氯酸钠作用3分钟，用80目的筛网捞取胚胎，放入异丙醇中20秒，取出胚胎干燥2分钟，放入正己烷中40秒，取出胚胎干燥2分钟，移入DPBS中清洗。
[0046]D:无菌操作台内将将端黑萤胚胎置于20%、30%、50%、70%和100%冷冻保护液依次进行五步平衡处理。培养基，基础液为改进的Grace培养液，酵母提取物占0.3%，水解酪蛋白占0.5%，抗冻剂为20%海藻糖和20%乙二醇，玻璃化保护剂为5%聚乙烯吡咯烷酮、1%海藻酸钠、3%聚乙二醇、2%葡聚糖、10%白蛋白和5%胎牛血清。
[0047]E:无菌操作间将平衡 后的胚胎和平衡液一起与空气成1:1的比例进行装管，装好后用PVP封管，将麦管紧卡在支撑条上。将支撑条在液氮上方停留1-2分钟，迅速投入液氮。
[0048]F:将支撑条从液氮中取出，在液氮上方停留1-2分钟，将麦管剪短，将胚胎迅速放入37 °C复温液中复温2分钟。复温剂为0.5M蔗糖。
[0049]G:将复温后的胚胎放入基础液中洗涤2-3分钟。将洗涤后的胚胎挑出培养，280C下用花泥保湿直至孵化，环境湿度90 %。观察到的胚胎存活率达61 %。
[0050]实施例4:
[0051]A:选择卵期在10-20天之间的的端黑萤胚胎或将早期的胚胎培养至10-20天，试剂耗材灭菌处理。无菌操作间和无菌操作台紫外照射30分钟。
[0052]B:端黑萤胚胎灭菌处理:在无菌操作间用含2.5%醋酸、3%泊洛沙姆、3%木糖醇酷、0.5%亚胺硫霉素、I制霉囷素、I庆大霉素、I链霉素的和I环丙沙星的超纯水?火虫胚胎灭菌液(加氯化钠至等渗)对选择的端黑萤胚胎进行清洗灭菌。
[0053]C:无菌操作台内将干燥后的200颗卵分别用2.6%，8%，10%的次氯酸钠作用2分钟，用80目的筛网捞取胚胎，放入异丙醇中20秒，取出胚胎干燥2分钟，放入正己烷中40秒，取出胚胎干燥2分钟，移入DPBS中清洗。
[0054]D:无菌操作台内将将端黑萤胚胎置于20%、30%、50%、70%和100%冷冻保护液依次进行五步平衡处理。培养基，基础液为改进的Grace培养液，酵母提取物占0.3%，水解酪蛋白占0.5%，抗冻剂为30%海藻糖和20%乙二醇，玻璃化保护剂为0.5%海藻酸钠、5%聚乙二醇、3%聚乙烯吡咯烷酮、1%羟丙基甲基纤维素、2%葡聚糖和20%胎牛血清。
[0055]E:无菌操作间将平衡后的胚胎和平衡液一起与空气成1:1的比例进行装管，装好后用PVP封管，将麦管紧卡在支撑条上。将支撑条在液氮上方停留1-2分钟，迅速投入液氮。
[0056]F:将支撑条从液氮中取出，在液氮上方停留1-2分钟，将麦管剪短，将胚胎迅速放入37°C复温液中复温2分钟。复温剂为0.5M海藻糖。 [0057]G:将复温后的胚胎放入基础液中洗涤2-3分钟。将洗涤后的胚胎挑出培养，280C下用花泥保湿直至孵化，环境湿度90%。观察到的胚胎存活率达74%。
【权利要求】
1.端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，整个过程均在无菌条件下操作，包括以下步骤:(I)选择卵期在10-20天之间的的端黑萤胚胎；(2)端黑萤胚胎灭菌处理:用萤火虫胚胎灭菌液对选择的端黑萤胚胎进行表面清洁、消毒、杀菌和灭真菌；(3)端黑萤胚胎的去卵壳处理；(4)端黑萤胚胎与冷冻保护液平衡:将端黑萤胚胎置于20%、30%、50%、70%和100%冷冻保护液依次进行五步平衡处理；(5)平衡处理后的端黑萤胚胎与冷冻保护液混合物装入麦管或置于铜箔片上，投入液氮中冷冻保存；(6)从液氮中取出置于复温液中复温；(7)26°C -28°C,80% -90%湿度的条件下进行孵育，其中所述的冷冻保护液由基础液、小分子抗冻剂和玻璃化保护剂组成，复温液由基础液和小分子复温剂组成。
2.根据权利要求1所述的端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于:萤火虫胚胎灭菌液对虫卵完全无毒，含醋酸、双氧水、多粘菌素B、亚胺硫霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、氟康唑、两性霉素B、制霉菌素、木糖醇酯和泊洛沙姆中的两种以上，其中抗生素含量不超过5%。
3.根据权利要求1所述的端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于:去卵壳处理使用溶液为2-15%次氯酸钠、异丙醇、丁烷、正己烷、石蜡油和DPBS，并进行两次干燥。
4.根据权利要求1所述的端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于:冷冻保护液由基础液、抗冻剂和玻璃化保护剂组成，基础液为改进的Grace培养液，其中酵母提取物占0.1-1.0%，水解酪蛋白占0.1-0.8%，抗冻剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇中的两种或两种以上，玻璃化保护剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、葡聚糖、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、胎牛血清、白蛋白中的两种或两种以上。
5.根据权利要求1所述的端黑萤胚胎的玻璃化冷冻保存方法，其特征在于:复温液由基础液和复温剂组成，基础液为改进的Grace培养液，其中酵母提取物占0.1-1.0%，水解酪蛋白占0.1-0.8%，复温剂为蔗糖、`葡萄糖、海藻糖中的一种或两种。
【文档编号】A01N1/02GK103651334SQ201310750187
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】陈绚丽, 李雪, 贾怡, 李燕燕 申请人:湖北医药学院