专利名称：简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎冷冻解冻方法，特别是用于哺乳动物的胚胎冷冻解冻方法，属胚胎生物技术领域。
1972年Whittingham等首先利用小鼠2～8细胞胚胎冷冻保存(传统冷冻法)成功并移植后获得后代，他们采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide:DMSO)为主体抗冻保护剂，浓度为1.5Mol/L，使用降温冷冻仪，以-0.3℃/min的速度降至-30℃～-35℃，然后再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮中。冷冻解冻后胚胎成活率为50％～70％，妊娠率为65％，产仔率为48％。该技术所使用的降温冷冻仪约4万美元/台，费用昂贵，且整个冷冻程序需3小时，操作时间长、效率低，更不适应于边远牧区的胚胎冷冻。
1985年Rall等又发明了胚胎玻璃化冷冻方法，他们利用DMSO，乙酰胺(Acetamide)丙二醇(Propylene glycol)为主体的抗冻保护剂，配制成浓度高达6Mol/L的玻璃化溶液(VS液)，不使用降温冷冻仪，在室温下对小鼠2细胞、8细胞和桑椹胚进行冷冻保存，该方法需要分三步降温(22℃下胚胎于25％VS液中平衡15min，4℃下于50％VS液中平衡10min，4℃下于100％VS液中平衡10min)，整个程序需要35min。该技术由于所用抗冻保护剂对胚胎的化学毒性较大，冷冻后胚胎的成活率不稳定(46％～95％)，产仔率较低(22％～38％)。
本发明的目的是要提供一种速度快、成本低、操作简单、效率高的胚胎冷冻解冻方法。
为了达到本发明的目的，本发明者首先对几种抗冻保护剂进行筛选，通过对胚胎的毒性试验及胚胎细胞膜的通透性测定，证明乙二醇(Ethylene glycol:EG)的化学毒性最小且通透性强，其次是丙三醇(Glycerol:GL)、丙二醇、DMSO、乙酰胺。为此，发明者以乙二醇(或丙三醇)为主体抗冻保护剂，添加大分子物质聚蔗糖和蔗糖配制成EFS(或GFS)液，其浓度大于7.0Mol/L。为避免其对胚胎的化学毒性伤害，冷冻前将胚胎在浓度为10～20％EG(或GL)溶液中预处理5～10min，再移入EFS(或GFS)溶液中平衡30s～1min后直接投入液氮即二步法冷冻保存。目的是既能使抗冻保护剂乙二醇(或丙三醇)较为缓和地透入胚胎细胞内部，又能在冷冻的瞬间形成玻璃化状态。本方法冷冻保存的小鼠原核胚～孵化囊胚，其成活率均能达到95％左右，并获得了较高的移植妊娠率(60～75％)。本方法对其他家畜如兔、牛和绵羊胚胎的冷冻保存也获得了基本相同的效果。
本发明的具体技术解决方案是(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇相应按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％EG溶液中预处理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
上述技术解决方案中所采用的抗冷冻保护剂乙二醇(EG)可由丙三醇(GL)代替，则其技术方案为(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％GL溶液中预处理5～l0min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s中解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
在上述的技术解决方案中，其步骤(3)的冷冻过程中所用的细管为0.25ml塑料细管。
下面是本发明简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，的两个具体事实例例1(1)配制10％乙二醇(EG)溶液取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成21％和0.35Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％EG溶液中预处理5min，然后移入含有EFS30或EFS40即玻璃化溶液的细管中平衡30s，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
例2(1)配制10％丙三醇(GL)溶液取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％GL溶液中预处理5min，然后移入含有GFS50玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
本发明具有如下优点(1)速度快改变传统冷冻方法的时间长、速度慢，即由一个冷冻程序3h缩短为30s；(2)降低成本、操作简单传统方法中使用降温冷冻仪(约4万美元/台)冷冻胚胎，改为室温(20～25℃)下徒手操作；(3)无冰晶传统冷冻方法有冰晶生成，本方法无冰晶生成，即呈玻璃化状态，主要是使用了高分子物质聚蔗糖(WF:70,000)，可避免冰晶对胚胎的物理性损伤；(4)适用范围广传统的方法需要在实验室内进行，本方法可在现场操作，特别是在无电和边远牧区更为实用；(5)效率高与传统的方法相比，本方法用EFS冷冻后胚胎成活率(94％～100％)、移植妊娠率(66％～75％)和产仔率(56％～66％)可提高5％～10％。用GFS冷冻后胚胎成活率为92％，移植妊娠率为60％，产仔率高达74％。
图1为本发明的胚胎玻璃化冷冻方法的实施例示意图；图2为本发明的胚胎玻璃化解冻方法的实施例示意图。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
如
图1所示，将胚胎于PBS液中洗净，用巴氏吸管将胚胎移入10％的EG(或GL)液中，在20～25℃室温下预处理5min，然后将胚胎移入含有EFS(或GFS)液和蔗糖溶液的0.25ml塑料细管的EFS(或GFS)液段中平衡30s，用封口粉封口即投入液氮，移入液氮罐中保存。
如图2所示，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎，并将回收的胚胎移入新鲜0.5Mol/L蔗糖溶液中，再将胚胎移入PBS液中洗净后培养。以上冲洗、回收、移入步骤在5min内完成。
权利要求
1．一种简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其具体技术解决方案是(1)配制10％～20％乙二醇(EG)溶液取1～2ml乙二醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成21％～18％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.35Mol/L～0.3Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇相应按7∶3～6∶4的比例(V/V)混合后制成EFS30～EFS40玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％EG溶液中预处理5～10min，然后移入含有EFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s钟解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
2．根据权利要求1所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其中所采用的抗冷冻保护剂乙二醇(EG)可由丙三醇(GL)代替，则其技术方案为(1)配制10％～20％丙三醇(GL)溶液取1～2ml丙三醇溶液+9～8ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成30％(FS液中聚蔗糖的含量，W/V)和0.5Mol/L(FS液中蔗糖的含量，W/V)浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％～20％GL溶液中预处理5～l0min，然后移入含有GFS玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s中解冻后，用0.3～1.0Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
3．根据权利要求1或2所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其步骤(3)的冷冻过程中所用的细管为0.25ml塑料细管；
4．根据权利要求1所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其具体技术解决方案可以是(1)配制10％乙二醇(EG)溶液取1ml乙二醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制EFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成21％和0.35Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与乙二醇按7∶3的比例(v/v)混合后制成EFS30玻璃化溶液。(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％EG溶液中预处理5min，然后移入含有EFS30即玻璃化溶液的细管中平衡30s，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约l0s钟解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
5．根据权利要求2所述的简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法，其特征在于，其具体技术解决方案可以是(1)配制10％丙三醇(GL)溶液取1ml丙三醇溶液+9ml PBS充分混合即成；(2)配制GFS玻璃化溶液将聚蔗糖(Ficoll 70,000)和蔗糖(Sucrose)用PBS稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液即FS液，然后将FS液与丙三醇(GL)按5∶5的比例(V/V)混合后制成GFS50玻璃化溶液；(3)冷冻在室温(20～25℃)下，将胚胎移入10％GL溶液中预处理5min，然后移入含有GFS50玻璃化溶液的细管中平衡30s～1min，封口即投入液氮中冷冻保存；(4)解冻需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10s解冻后，用0.5Mol/L蔗糖溶液冲洗管中内容物，在显微镜下回收胚胎。
全文摘要
本发明公开了一种简易高效胚胎玻璃化冷冻解冻方法,属胚胎生物技术领域。本方法速度快、成本低、操作简单、效率高。本发明采用乙二醇(EG)或丙三醇(GL)为主体抗冻保护剂配制成EFS或GFS玻璃化溶液,浓度大于7.0mol/l,在室温(20～25℃)下,将胚胎于10～20%EG(或GL)溶液预处理5～10min,然后移入EFS(或GFS)液中平衡30s～1min后直接投入液氮。本方法冷冻保存的小鼠原核胚～孵化囊胚,其成活率均能达到95%左右,并获得了较高的移植妊娠率(60～75%)。本方法对其他家畜如兔、牛和绵羊胚胎的冷冻保存也获得了基本相同的效果。
文档编号A61D19/02GK1302590SQ9912188
公开日2001年7月11日 申请日期1999年10月22日 优先权日1999年10月22日
发明者朱士恩, 曾申明, 张忠诚, 田见晖 申请人:朱士恩