专利名称：一种水稻DREBs类转录因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻DREBs类转录因子及其应用。
背景技术：
植物在生长过程中会遭遇到各种各样的自然环境，其中有些自然灾害常造成农作物大量减产，如干旱、滞涝和病虫害等。培育抗逆性作物品种是农业科学技术研究的重要目标之一。当前一个重要的育种手段是将各种抗逆基因对农作物进行基因工程改造，以获得抗逆农作物新品种。为抵抗不良的外界环境的胁迫，植物体细胞感受外界环境的变化并将信号传递到细胞内，会诱导细胞表达各种应答基因共同来抵御不良环境对植物体的伤 #。 DREBs (Dehydration—responsive element binding)AP2/ EREBP (APETALA2/ethlene responsive element binding protein, APETALA2/ Zs^^L·^· 元件结合蛋白)家族的一类成员，参与植物对干旱、高盐和低温等非生物胁迫的应答与响应。DREBs类转录因子可特异地识别并结合DRE(Dehydration-responsive element，干旱应答元件)，进而参与逆境信号的传递，调控下游逆境应答基因的表达，从而对植物抗性进行综合改良。Yamaguchi-Siinozakiaib等于1994年首次在拟南芥的核抽提物中检测到能够与 DRE 作用的蛋白质因子 DRBFl (Yamaguchi-Shinozakiaib K, Shinozaki K. Plant Cell. 1994,6(2) :251-264)。随后多个该类基因的克隆与研究发现，DRE/CRT顺式作用元件普遍存在于胁迫应答相关基因的启动子中，DREBs转录因子能够特异地识别并结合该顺式作用元件，进而参与调控相关基因的表达及功能行使。但人们发现该基因家族是一个大家族，在水稻中就存在196个成员，不仅与植物的非生物胁迫响应有关，而且调控植物的生长发育和果实成熟。发现该基因家族中新的成员在植物的生长发育和生物胁迫反应中的作用，寻找既能提高植物的抗逆性又能改善植物生长的基因，将对培育高产稳产的植物新品种具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于发现新的DREBs类转录因子及其核酸序列，以拓展当前植物生物技术中的可应用于提高植物抗旱能力的基因，获得新型转基因抗旱植物品种。为此，本发明公开了一种水稻DREBs类转录因子在制备转基因抗旱植物品种中的应用，其特征在于(a)其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；或(b)其氨基酸序列为至少与SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列90%同源性且具有提高植物的抗逆性的氨基酸序列。在具体实施例中，上述(a)DREBs类转录因子由如SEQ ID NO. 1所示核酸序列编码生成。
另一方面，本发明公开了一种含有上述核酸序列的重组载体。在一实施例中，所述核酸序列为如SEQ ID NO. 1所示。另一方面，本发明还公开了一种含有上述重组载体的转化体。在一些实施例中，所述转化体为植物细胞或生物体，所述生物体为转基因抗旱植物，为水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、大豆、高粱、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、甘蔗、或甜菜中之一，其中优选为水稻。本发明所述DREBs类转录因子及其基因，具有在抗渗透胁迫具有明显的作用，因此可将本发明所述基因与任何逆境诱导启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。
图1.采用ClustalW软件将OsDREB 1基因预测的蛋白序列与DREB同源蛋白序列进行比对图；图2.表达载体pCAMBIA1300-0sDREBl的构建示意图；图3. real-time PCR方法检测OsDREBI基因在水稻四叶期叶片在NaCl和ABA处理下的表达水平。图4.在干旱胁迫下非转基因植株和两个超表达转基因植株(Tl)的生长状况的比较。
具体实施例方式在本文，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。本发明还包括能编码具有OsDREBI相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’ 端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，还包括具有与OsDREB 1相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。 这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20 个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在 C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)确定，其 43^ gap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时， GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分CN 102373217 A
说明书
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析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。本发明所分离出的多核苷酸，包括但不限于SEQ ID NO. 1编码OsDREB 1基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第532-1404位的核苷酸序列杂交；或者其功能相当于SEQ ID NO. 1所示序列的亚片段。可以采用已经克隆的OsDREBI基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样也可以采用PCR(polymerase chainreaction)技术，从基因组、cDNA中扩增得到本方面的OsDREBI基因以及任何一段DNA或其同源的一段DNA。用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(ffeissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition)。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’ -凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端 DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA 或 UAG)。如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的
5抗性基因，例如新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因npt II、 潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolate reductase)基因dhfr ；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成Sl (5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因 epsps。适当宿主的代表个生 列子包括但不限于原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。目的基因或目的多核苷酸的转化方法一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法， 是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 分离克隆OsDREBI基因通过 Nese Sreenivasulu et al. 2006 年在 The Plant Journal (2006，47， 310-327)发表的大麦籽粒发育macroarray结果，发现表达序列标签BQ469825/BU986453在灌浆成熟期对脱落酸(ABA)和干旱胁迫响应。通过同源搜索水稻同源基因，采用ClustalW 软件(公开使用软件)将OsDREBI基因预测的蛋白序列与DREB同源蛋白序列进行比对 (图 1 中，Ta :GI :84795234,序列来源:Triticum aestivum 小麦；Osl :GI :115476366, 序列来源0ryza sativa 水稻；0s2 :GI :31745669,序列来源0ryza sativa 水稻；Sb GI :242044532,序列来源Sorghum bicolor 高粱；Zm :GI :195626986,序列来源 Jea mays 玉米；Pt :GI :224063209,序列来源Populus trichocarpa 黑杨；At :GI :13877779, 序列来源=Arabidopsis thaliana拟南芥)，发现该基因位于水稻第9染色体正链 12，215，431-12，217，；345，命名为 OsDREBI。采用 TRIzol 试剂(GIBC0 BRL, USA)抽提水稻叶片总RNA。利用反转录酶MLV (Tiangen，China)将其反转录成cDNA。用引物DBF(5，_CCCGCCC ACCATTCCCACTTTCGC-3，)和引物 DBR (5 ‘ -CACAACAATTTTAACAACGACGCTAA-3，)，扩增出基因的全长 cDNA(1914bp)。PCR 反应条件为94°C预变性 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec, 72°C 90sec共35个循环；72°C延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM_T载体(Promega，USA)，筛选阳性克隆并测序，获得OsDREBI基因的全长序列(SEQ ID NO. 1)。实施例2 =OsDREBI基因超表达载体的构建和遗传转化2. 1含目的基因表达载体的构建根据OsDREBI基因的全长序列(SEQ ID NO. 1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真Taq酶pfu酶(Tiangen， China)进行PCR扩增后，将OsDREBI基因cDNA克隆至中间载体(如PBI23)，进一步转化大肠杆菌DH5ci，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，使用EcoRI和HindIII酶切质粒，这样就将基因两头分别加入了转录启动子和终止子，构成了一个完整的表达单元，再装入植物表达载体pCAMBIA1300中，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。2. 2水稻遗传转化2. 2. 1种子消毒成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡l-2min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3_4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L)上，每皿约30 粒，于暗培养。2. 2. 2继代培养经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D 2. 0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2_4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。2. 2. 3农杆菌的培养在转化平板上挑取单菌落在Iml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入Iml上述培养物，200rpm, 培养5_6hr至0D600为0. 6-1. 0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度IOOuM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，lOmin，弃上清，加入MS液体培养基(含AS IOOuM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养》ir，使菌液的 0D600 = 0. 5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS = acetosringone2. 2. 4 共培养将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2，4-D 2. 0mg/L+AS IOOuM)上，28°C暗培养三天。2. 2. 5 洗菌共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。2. 2. 6选择培养将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2，4-D 2. 0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2，4-D 2. 0mg/L+Hyg 50mg/ L+Cef 250mg/L)上，再选择 2 周。
2. 2. 7分化培养将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+6-BA 2. Omg/L+Hyg 30mg/L+Cef 200mg/L+琼脂 9g/L+蔗糖 45g/L)上暗培养 10 天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+6-BA 2. Omg/L+Hyg 30mg/L+琼脂 4. 5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。2. 2. 8生根培养约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(l/^MS+Hyg 15mg/L+琼脂 4. 5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。2. 2. 9转基因苗的移栽当幼苗长至IOcm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。实施例3 内源OSDREBI基因在水稻中的表达分析3. 1材料准备水稻品种日本晴发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，分别用50mM浓度的氯化钠和100 μ M脱落酸(ABA)分别处理2分钟、5分钟、 30分钟、2小时和6小时，然后剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。3. 2无DNA的总RNA制备按上海华舜生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman Coulter DU 640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5 μ g，加入IyL DNAaseI (美国hvitrogen公司)禾Π 1 μ LlOX 反应缓冲液，补足体积至10 μ L，常温反应30min，然后每管加入1 μ L 2mmol L-IEDTA终止反应，最后在70°C加热IOmin使DNAase I失活。3. 3第一链cDNA的合成将上述RNA样品各取2 μ L，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加 4yL 25mmol L_lMgC12，2 μ LlO X RT 缓冲液，2 μ L dNTP 混和液和 IyL oligo (dT) 15，加水补足体积到18. 5 μ L，在70°C加热变性IOmin,快速在冰上冷却。然后加0. 5 μ L RNase inhibitor 和 1 μ L AMVRTase，在 42°C水浴 60min，70°C下加热 IOmin 终止反应。3. 4 定量 PCR根据基因OsDREBI 的序列设计特异性引物 RF :5，-CCGTGCAGATGGGATTTTAGAC-3，， RR :5，-CTGCCGGTAGCATCGGCGTC-3，用于荧光定量 PCR,根据 Actin (GenBank accession No. AY212324)基因的 cDNA 序列设计特异性引物 AF :5，-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3，， AR :5，-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3，用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国 ABI PRISM 7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含SYBR Premix
ExTaq (2X)10 μ L，正反向引物各0. 5 μ L，各种处理的cDNA模板1 μ L，加水补足体积至 25 μ L0反应程序为95°C 30s，然后在95°C 10s,60°C 35s下循环40次，设定在每个循环中 600C 35s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品， 各取IyLRNA作为模板进行PCR，方法同上。
3. 5分析方法Ct是通过7000system SDS Versionl. 2. 3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为 0. 2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2_Δ Δετ，然后利用 EXCEL表作表达差异柱状图。3. 6分析结果50mM氯化钠处理5分钟后该基因的表达量明显提高到2倍，随后表达量逐步升高； 100 μ MABA处理5分钟后，其表达量的升高迅速达到6倍左右，30分钟后表达趋于稳定，符合转录因子在基因的早期表达的特征。说明该基因是依赖ABA的，在渗透和离子胁迫条件下逐步增强表达(见图3)。实施例4 =OsDREBI基因超量表达转基因T代家系植株在干旱条件下的生长状况选取了 2个实施例2中OsDREBI基因超量表达转基因Tl代家系植株进行了穗期干旱胁迫实验。具体步骤如下每份材料种植3行，每行7株，当群体内大部分材料进入幼穗分化时期(水稻对水分最敏感时期)，开始排空田间水分，干旱胁迫2个星期以上，然后观察转基因植株的生长状况。结果表明，本发明克隆的OsDREBI基因超表达的2个转基因植株的生长在正常条件下与对照没有明显的差别，但在逆境胁迫处理后其生长要明显地优于对照。在干旱处理3星期后观察，发现转基因植株的成活率(平均82%)明显高于未转基因植株(36%)，结实率(平均73%)也明显高于未转基因植株(32%)。对这3份材料进行拷种试验，发现每穗实粒数、结实率和收获指数的提高达到极显著水平，其增产也达到了显著水平，比非转基因植株增产200% -300%，尽管干旱处理下株高变矮(图4，对照表示非转基因植株，0X1和0X2表示超表达转基因植株1和2。有效穗、每穗实粒数和每穗颖花数的单位为个，结实率和收获指数的单位为百分比，株高单位为厘米，经济学产量和地上部生物学产量的单位为克。**表示P <0.001，*表示P <0.05)。说明OsDREBI基因的表达可以缓解水稻在进入生殖生长后干旱胁迫造成的植株生长受阻，提高了植株的结实率和种子灌浆，增强转基因水稻对非生物逆境的抗性而提高水稻产量。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
权利要求
1.一种水稻DREBs类转录因子在制备转基因抗旱植物品种中的应用，其特征在于(a)其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；或(b)其氨基酸序列为至少与SEQID NO. 2所示氨基酸序列90%同源性且具有提高植物的抗逆性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述转基因抗旱植物为水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、大豆、高粱、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、甘蔗、或甜菜中之一。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻DREBs类转录因子及其应用。本发明公开了一种水稻DREBs类转录因子在制备转基因抗旱植物品种中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或其氨基酸序列为至少与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列90％同源性且具有提高植物的抗逆性的氨基酸序列。本发明所述DREBs类转录因子及其基因，在抗渗透胁迫具有明显的作用，因此可将本发明所述基因与任何逆境诱导启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失。
文档编号C12N15/29GK102373217SQ20101025106
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者余舜武, 吴金红, 杨智军, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心