专利名称：水稻miR399d 及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻MT 淑从/ m写为0smiR399d)及其应用。
背景技术：
水稻是世界上主要的粮食作物之一。我国水稻土壤地域主要集中在长江中下游平原、四川盆地、珠江三角洲和台湾省西部平原地区。这些地区多为酸性和微酸性土壤，土壤中磷素形态主要是磷酸铁，水稻土的磷酸铁含量一般可达非闭蓄态部分的50-80% (中国土壤，1978)，此种形态的磷难于被作物吸收。水稻土磷肥短缺的现状，大大限制了水稻产量，因而改善水稻磷营养特性，对于提高水稻产量意义重大。MicroRNA是由19-25个核苷酸组成的一类内源性编码单链小RNA(Dreyfuss等， 2002 ；Gebauer和Hentze, 2004 ；Ambros, 2004)。这类内源性小分子RNA通过喊基互补配对原则结合于靶基因mRNA的侧翼区域或编码区域，从而调控靶基因的表达(Dreyfuss等，2002 ；Gebauer等，2004 ；Ambros等，2004)。低磷养分下，miR399在拟南芥和水稻中都被证实大量诱导表达(Chiou等，2006 ；Bari等，2004)。此家族在拟南芥和水稻中分别有6个(Sunkar等，2004; Jones等，2004)和11个拷贝(Lopez等，2004)。报道表明在拟南芥中miR399参与了磷素短缺反应。miR399作用于泛素结合酶(UBC24)，进而调控磷酸转运蛋白，在磷素动态平衡中起着重要作用(Fujii等，2005; Chiou等，2006; Bari等，2006)。目前关于miRNA399与磷素胁迫的研究多集中于拟南芥中，对于水稻，单子叶模式作物的研究知之甚少，因此有进一步深入研究的必要性。 miR399不仅和低磷响应相关，还受到盐胁迫的诱导。芯片数据表明，白杨和玉米经过盐处理后，心没的表达上调(Ding等，2009 ；Jia等，2009)。而拟南芥中的心的表达在盐处理前后没有明显变化(Fujii等，2005)，说明不同物种中，microRNA的调控存在差异。水稻的是否受盐胁迫调控，还没有报道。本实验室通过设计引物成功从日本晴全基因组序列中首次获得水稻miR399d (以后简写为从/)的前体基因，并将其转入日本晴，获得了过表达植株，过表达植株中磷含量过高，表现出磷中毒，说明AsmTP1/在水稻磷动态平衡调控中有一定作用。本实验室还通过半定量和定量PCR研究了缺磷和盐胁迫对flsfiuTPJP从/表达的影响，二者都能诱导
从/前体的表达，说明0smiR399d可能不仅参与磷动态平衡调控，还与盐胁迫反应有关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从水稻种克隆出的GsmTPl/前体基因及其应用。具体包括在水稻中表达的microRNA，从/基因的克隆，克隆及检测表达模式所需的引物序列，表达载体的构建，转基因植株的获得，基因水稻中磷含量的测定，对fiwTPJP从/基因在缺磷胁迫和盐胁迫处理后表达模式变化进行分析鉴定所用的方法，及其作用的靶基因的验证。本发明首先提供一种分离出的DNA分子，该DNA分子为首次从水稻中克隆出的从/前体基因，全长428bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。本发明研究水稻miR399d对非生物胁迫例如缺磷胁迫、盐胁迫的响应，表明水稻miR399d对非生物胁迫例如缺磷胁迫、盐胁迫的响应，诱导效果明显。本发明通过将水稻GsmTP1/前体基因在水稻中过表达，获得转基因植株，并验证水稻miR399d的功能。本发明提供用于从日本晴全基因组序列中，根据miR399d前体茎环两端特异性区域设计的扩增0smiR399d基因的引物对
miR399d 正向GCAGATCTGTAGGAAGACAAGAGGCAAGT (SEQ ID NO. 2)miR399d 反向GCGGTGACCGGGGCTAAACTCCTAAACA (SEQ ID NO. 3)
本发明提供用于RealtimePCR定量检测0smiR399d表达的根据0smiR399d前体茎环区域设计的引物对
miR3"d 正向ATCGGTTGGTTATGTGC (SEQ ID NO. 4)miR3"d 反向CAGGCCGTTTTGGTGAA (SEQ ID NO. 5)
本发明提供一种检测水稻基因从/响应缺磷胁迫的方法，利用引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，对缺磷处理的水稻cDNA样品进行半定量PCR，检测该基因在茎叶中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下
Ca)提取缺磷处理和正常培养水稻的地上部分的总RNA ；
(b)利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA；
(c)利用引物对SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3进行半定量PCR检测。结果显示从/基因的前体受到缺磷胁迫的诱导。本发明提供一种检测水稻基因0smiR399d响应盐胁迫的方法，其步骤如下
Ca)提取盐处理和正常培养水稻的的地上部分和根的总RNA ；
(b)利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA；
(c)利用引物对SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 5进行定量PCR检测。结果显示从/基因的前体受到盐胁迫的诱导。本发明提供一种验证miRNA靶基因的方法，5’ RACE，其步骤如下
Ca)提取淑从/过表达株系叶片的总RNA ；
(b)在mRNA5’端加上接头；
(c)反转录成cDNA；
(d)用基因特异引物和接头引物，扩增目的基因，获得目的基因的5’端序列。结果显不-.OsPHO2的5’端与0smiR399d成熟序列互补，是0smiR399d的祀基因。本发明还提供一种测定水稻叶片中磷含量的方法，其步骤如下
(a)水稻新鲜叶片和根液氮研磨，加入含IOmM Tris> ImM EDTA> IOOmM NaCl、lmMP-巯基乙醇、ImM PMSF, pH8. 0的提取液。(b) IOOu I 样品加入 900 ii I l%HAc，42°C 保温 30min。(c) 13000g 离心 5min。(d)取 300 u I 上清加入 700 ill 含 0. 35% NH4M004、0. 86N H2SO4' I. 4% 抗坏血酸的检测液，42°C保温30min。(e ) 820nm处测吸光度。本发明还包括具有ttsfiuTPJP从/前体基因的水稻转基因植株。转基因植株表型明显，主要为叶边缘发黄，萎蔫，表现为磷中毒(图8)。
图I为半定量PCR检测日本晴在磷充足和磷缺乏处理14d的情况下茎、叶中
的前体、( / 和为憐饥饿诱导基因 phosphorus starvation inducedgenes的简写)的表达。 图2为Real t ime PCR检测不同浓度NaCl处理的日本晴中tniR399d前体的表达。其中，a为shoot中从/前体的表达。CK为对照，数字代表处理的NaCl的浓度。基因表达量计算方式40-A Ct，ACt是从/前体基因与内参基因act in的Ct值之差，单位是cycle ；b为root中则从/前体的表达。CK为对照，数字代表处理的NaCl的浓度。基因表达量计算方式40-A Ct，ACt是从/前体基因与内参基因act in的Ct值之差，单位是cycle。图3为Real t ime PCR检测200mM NaCl处理不同时间的日本晴中miR399d前体的表达。其中，a为shoot中从/前体的表达。CK为对照，数字代表处理时间。基因表达量计算方式40-A Ct，ACt是从/前体基因与内参基因act in的Ct值之差，单位是cycle。b为root中心从/前体的表达。CK为对照，数字代表处理时间。基因表达量计算方式40- A Ct，A Ct是从/前体基因与内参基因act in的Ct值之差，单位是cycle。图4为转0smiR399d的植株的HYG鉴定。其中，WT是野生型，1-8是转基因植株。图5为提取转0smiR399d的Ttl代植株的RNA，逆转录成cDNA，进行定量PCR，检测0smiR399d前体的表达。399d_l 399d_5是0smiR399d过表达的5个株系。图6为5’ RACE验证0sPH02是否是0smiR399的靶基因。其中，箭头所指的位置即5’ RACE扩增出的0sPH02的5’端。图7为WT和转0smiR399d的植株中磷含量的测定。其中，WT是野生型，L7、L9、L12是0smiR399d过表达的3个株系，CK是对照，P是缺磷处理，s代表地上部分，r代表根。图8为转的磷中毒表型。其中，左边为野生型，右边为淑从/过表达株系。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如 Sambrook 等分子克隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例I水稻MT 淑从/的克隆
I.水稻品种 Nipponbare (Oryza sativa Japonica)在培养箱(SPX-250-GB, Shanghai, China)中培养生长条件为光周期 16h /8h (L/D)，28°C。2.基因组DNA提取。取0.05§嫩叶片，加入500111 65°C预热的提取缓冲液，快速混匀；65°C水浴20min (期间倒置混匀1_2次)，冷却至室温；加入500 氯仿异戊醇(24:1),轻柔混勻，静置l-2min ;12000rpm、室温离心IOmin,上清转移至新管；加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置l-2min ;同上离心，上清转移至新管；加入1/10体积3M NaAC(pH5. 2)、2倍体积冰冷的无水乙醇(_20°C )，轻柔混匀，_20°C静置40min ;同上离心，弃上清，沉淀用70%乙醇(4°C预冷)洗涤2次；室温凉干，25 UlTE (含1% (V/V) RNA酶)充分溶解沉淀；65°C水浴消化RNA Ih ;取5 ill用于0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。3.基因的克隆。根据已知0smiR399d如体基因莖朴两端的序列，设计水稻引物如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3。对水稻基因组序列进行特异性PCR扩增，获得基因全长，具体序列信息参见SEQ ID NO. I。实施例2 miR399d的表达与缺磷处理的关系
20d的日本晴苗，缺磷处理14d后，分别提取水稻植株的茎、叶的总RNA，反转录。以特异引物对(SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3)，进行半定量PCR。淑从/的前体受缺磷诱导，而0smiR399d的高表达导致Osm)2 mRNA水平的下降(图I)。实施例3 0smiR399的表达与盐处理的关系
(I)不同盐处理浓度下的\>Ye-0smiR399d的表达
日本晴培养20d的苗，分别用50、100、150、200mM NaCl处理24h, shoot、root分别提取RNA，逆转录成cDNA,以特异引物序列如SEQ ID NO. 4和和SEQ ID NO. 5，进行real-timeRT-PCR检测miR399d前体的表达。结果显示，Shoot中，miR399d的表达开始随NaCl浓度的增加而升高，在150mM达到最高，200mM时，略有降低(图2a)。Root中，则7 淑从/前体的表达随浓度的增加而上升(图2b)。(2)同一盐处理浓度下，不同处理时间pre-miR399d的表达
日本晴培养20d 的苗，200mM NaCl 处理0h、2h、4h、8h、16h、24h后，shoot、root 分别提取RNA，逆转录成cDNA，利用特异引物序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，进行realtimePCR检测shoot、root中》27 淑从/前体的表达。结果显示，Shoot中，miR399d的表达先上升4h后基本不变(图3a) ；root中，miR399d在表达最高，随后表达量下降(图3b)。实施例4沒从/表达载体构建，转基因
I、将ttsfiuTPJP从/序列的5’端和3’端分别加上Bglll限制酶切位点和勿I酶切位点。然后以正义连入植物表达载体PCAMBIA1304。2、将重组载体以冻融法转入农杆菌EHA105，侵染日本晴愈伤组织，经过筛选、分化、生根后得到转基因植株。实施例5 转基因植物0smiR399d的鉴定
取野生型和Ttl代转基因植株的新鲜叶片为样品，抽提基因组DNA，用潮霉素引物进行特异性PCR，检测到潮霉素基因的存在，说明转基因成功(图4)。取野生型和Ttl代转基因植株的鲜叶片为样品，进行RNA抽提，反转录获得cDNA，以SEQ ID NO. 4和和SEQ ID NO. 5为引物对GswiTPJ划￠/进行定量PCR，验证转GswiTPJ划￠/植株中0smiR399d的表达量。结果显示，这5个株系中miR399d前体的表达都大大增加(图5 )。 实施例6 验证0SH102和0smiR399d的关系
取Ttl代转基因植株的鲜叶片为样品，进行RNA抽提，用RNA连接酶在mRNA 5’端加上接头，反转录获得cDNA，以基因特异反向引物和接头引物进行PCR扩增，获得的序列测序，发现其5’端断裂位置的序列恰好与0smiR399d的成熟序列互补(图6)，说明0sH102是从/的靶基因。实施例7 培养20d的野生型日本晴和/过表达株系，缺磷处理14d，取新鲜的地上部分和根，液氮研磨，提取磷，检测磷的含量(图7)。转基因植株中，地上部分磷含量明显高于野生型，根中则略低于野生型。实施例8表型观察(图8)。《57^7 ^过表达株系表现出磷中毒的现象，叶片边缘发黄，萎蔫。参考文献
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8.Lopez de Heredia, M. and Jansen, R. P. (2004) mRNA localization and thecytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 16，80 - 85
9.Sunkar, R. and Zhuj J-K. (2004) Novel and stress-regulated microRNAs andother small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell 16，2001 - 2019。
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，为从水稻中克隆出的从/前体基因，全长428bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I。
2.一种基因组中含有如权利要求I所述DNA分子的转基因水稻植株。
3.一对用于调取水稻基因组中mTPJP从/前体基因的引物，其特征在于，根据权利要求I所述基因茎环两端区域设计，序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
4.一对RealtimePCR定量检测水稻mTPJP从/前体基因表达的引物，其特征在于，根据权利要求I所述基因茎环区域设计，序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。
5.一种检测水稻基因0smiR399d响应缺磷胁迫的方法，其特征是利用引物SEQ IDNO. 2和SEQ ID NO. 3，对缺磷处理的水稻cDNA样品进行半定量PCR，检测该基因在茎叶中的表达；样品为水稻的RNA经过逆转录后所得cDNA ;其步骤如下 Ca)提取缺磷处理和正常培养水稻的总RNA ； (b)利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA； (c)利用引物对SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3，进行半定量PCR检测。
6.一种检测水稻基因0smiR399d响应盐胁迫的方法，其特征在于盐处理的水稻分别提取根和茎叶的总RNA，利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，利用引物对SEQ IDNO. 4和SEQ ID NO. 5对cDNA样品进行定量PCR，检测该基因在根和茎叶中的表达，结果显示基因的前体受到盐胁迫的诱导。
7.一种验证miRNA靶基因的方法，5’RACE，其特征在于在mRNA 5’端加上接头，反转录成cDNA，用基因特异引物和接头引物，扩增目的基因，获得目的基因的5’端序列，结果显示-.0sPH02的5’端与GswiTP淑从/成熟序列互补，是0smiR399d的靶基因。
8.一种测定水稻叶片中磷含量的方法，其特征在于提取根和茎叶中的可溶性磷，利用磷与钥酸铵形成络合物，然后被抗坏血酸还原成钥蓝，根据在820nm有吸收峰的原理，测定根和茎叶中的磷含量。
9.如权利要求I所述的基因0smiR399d在植物品种改良中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为水稻miR399d及其应用。本发明通过过表达水稻miR399d(简写为OsmiR399d)的转基因水稻植株验证水稻miR399d基因的功能。本发明包含水稻miR399d前体基因的克隆、含有该基因的表达载体构建、引物序列、OsmiR399d过表达植株、基因OsmiR399d对缺磷胁迫和盐胁迫的响应及其靶基因的验证。半定量和定量PCR检测结果显示，缺磷处理以及盐处理均能提高其在根和茎叶中的表达。通过5’RACE证明OsmiR399d的靶基因是OsPHO2。本发明还公开基因OsmiR399d在水稻中过表达后，明显提高了转基因植株茎叶中磷的含量，使植株表现出磷中毒。该基因OsmiR399d可用于植物品种改良。
文档编号C12N15/11GK102676525SQ20121015329
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者吕波, 张璇, 张睿, 明凤, 金津 申请人:复旦大学