专利名称：一株反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌H-hrb01及筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程、环境工程技术领域，涉及一种反硝化聚磷菌株，同时提供这种菌株的筛选方法和应用。
背景技术：
随着“水体富营养化”问题的日渐突出，污水排放标准的日趋严格，如何经济、高效的去除氮磷污染成为水体污染防治领域的研究热点。生物脱氮除磷工艺因其经济、环保等优点而得到了广泛应用，但其本身也存在一些问题亟待解决，如脱氮和除磷过程存在底物竞争和污泥龄等矛盾，使得生物脱氮除磷工艺的去除效能难以提高。反硝化聚憐菌(denitrifyingphosphorus removal bacteria, DPB)以 N03—N 作为电子受体吸收磷，在缺氧条件下同时实现脱氮和除磷的双重目的。反硝化除磷菌在缺氧条件下，利用硝酸盐作为电子受体氧化胞内贮存的PHB，并从环境中摄磷，实现同时反硝化和过量摄磷。与传统的脱氮除磷相比，反硝化除磷技术在保证脱氮除磷效果的同时，可减少系统对COD和氧气的消耗，污泥产量也可降低。到目前为止，反硝化聚磷菌株主要集中在Pseudomonas菌属和Rhodococcus菌属，菌种较为单一，且研究多集中在降解基因和降解机理方面，实际应用研究有限。
发明内容
本发明的目的是从自然界筛选出具有高效反硝化除磷效能的菌株Bacilluscereus H_hrb01，为污水生物脱氮除磷工艺的生物强化提供高效的菌制剂，对氮、磷等污染物进行生物处理。本发明的技术解决方案是一种反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌H-hrbOl，其特征在于菌株为Bacillus cereus H_hrb01,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年3月27日，保藏号为CGMCC NO. 5939。菌株Bacillus cereus H_hrb01是稳定运行的SBR反应器缺氧段末的活性污泥中分离得到，具体筛选步骤如下
取SBR反应器运行稳定时某周期缺氧段末的活性污泥作为分离用泥，将所取活性污泥制成菌悬液，加入到反硝化培养基中，待培养基凝固后倒置培养皿于30°C恒温培养箱中培养2 3天后，选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在反硝化固体培养基上进行三区划线分离，重复3 4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用，所有操作均在无菌条件下进行；对己分离出来的菌株在富磷培养基中进行吸磷试验，同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)和PHB颗粒染色(苏丹黑染色法)检验；对于硝酸还原性为阳性并产气，菌体内又含有聚磷颗粒或PHB颗粒，在好氧或缺氧条件下能过量吸磷的细菌即为试验所需的反硝化聚憐囷种属。
反硝化培养基配制如下柠檬酸钠5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. Og/L,琼脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 调节培养基 pH 值至 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌20min。富磷培养基配制如下(PO广-P为 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer8. 5g/L,微量元素2ml/L，琼脂15g/L，用NaOH或者HCl调节培养基pH值至7. 2，121 °C高压蒸汽灭菌20min。微量元素的组成如下(IL)=FeCl3 O. 90g, H3BO3 O. 15g，KI O. 18g，CuSO4 · 5H200. 03g, MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g,EDTA 10.OOg0该菌株H-hrbOl为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，在pH 5. 0-11.0U0-45°C条件下生长，菌株宽度为I. 0_1· 2 μ m，长为3-5 μ m，无鞭毛； H-hrbOl杆菌在固体培养基上生长为白色不规则菌落，表面光滑，边缘呈波浪状，能以多种有机物为碳源，具有良好的反硝化除磷效能，能在污水污染物生物降解中应用，可用于污水生物脱氮除磷工艺。通过扩增该菌株的16S rDNA,得到了长度为1518 bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用细菌通用引物 BA101F 5，-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3，和 BA534R5’-ATTACCGCGGCTGCTGCTGCTGG-3’。用 PCR 仪进行扩增反应。PCR 反应体系(25 μ L)2. 5μ L10XPCR Buffer,2y L dNTPs (浓度为 2. 5mmol/L)，2 种引物各 0· 5 μ L，0· 5 μ L DNA 模板，0. 5μ L rTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，无菌去离子水18. 5 μ L。PCR扩增程序为95 °C预变性5min，94°C变性lmin，58°C复性30s，72°C延伸3min，共30个循环，最后72°C延伸10min，l%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过程序进行同源性比较，表明该菌株与腊样芽孢杆菌(Bacillus sp.)的相似性为99%,本发明提供的腊样芽孢杆菌属H_hrb01杆菌属于芽孢杆菌属。本发明所达到的有益效果是本发明提供的菌株Bacillus cereus H_hrb01能以多种有机物为碳源，有极强的反硝化菌磷能力，将菌株cereus Η-hrbOl投加到SBR生物强化装置,反应器出水各项指标均优于未投加菌株cereus H-hrb01的对照系统，投加菌株cereus H-hrb01的反应器经16天的运行,对污水中COD、氨氮和可溶性磷的去除率分别达到93. 90%, 97. 70%和96. 25%。
图I是菌株Bacillus cereus H-hrbOl的透射电镜观察图。图2是菌株Bacillus cereus H-hrbOl的个体和群体原子力照片。图3是菌株H-hrbOl的生长曲线。图4是菌株H-hrb01对COD的降解净化效能。图5是菌株H-hrb01对氨氮的降解净化效能。图6是菌株H-hrbOl对可溶性磷的降解净化效能。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一取SBR反应器运行稳定时某周期缺氧段末的活性污泥作为分离用泥。将所取活性污泥制成菌悬液，加入到反硝化培养基中，待培养基凝固后倒置培养皿于30°C恒温培养箱中培养2 3天后，选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在平板培养基上进行三区划线分离，重复3 4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用，所有操作均在无菌条件下进行。对己分离出来的菌株在富磷培养基中进行吸磷试验，同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)和PHB颗粒染色(苏丹黑染色法)检验。对于硝酸还原性为阳性并产气，菌体内又含有聚磷颗粒或PHB颗粒，在好氧或缺氧条件下能过量吸磷的细菌即为试验所需的反硝化聚磷菌种属。反硝化培养基配制如下柠檬酸钠5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. Og/L,琼脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 调节培养基 pH 值至 7. 2，121°C高压蒸汽灭菌20min。
富磷培养基配制如下(PO广-P为 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer
8.5g/L,微量元素2ml/L，琼脂15g/L。用NaOH或者HCl调节培养基pH值至7. 2。121°C高压蒸汽灭菌20min。微量元素的组成(IL)=FeCl3 O. 90g，H3BO3 O. 15g，KI O. 18g，CuSO4 · 5H20 0. 03g，MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g, EDTA
10.OOg0菌株H-hrbOl为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，在ρΗ5· 0-11. O、10-45O条件下生长，菌株宽度为I. 0-1. 2 μ m，长为3-5 μ m，无鞭毛；H-hrbOl杆菌在固体培养基上生长为白色不规则菌落，表面光滑，边缘呈波浪状，能以多种有机物为碳源，具有良好的反硝化除磷效能，可用于污水生物脱氮除磷工艺。
具体实施方式
二
通过扩增该菌株的16S rDNA,得到了长度为1518 bp的16S rDNA序列。PCR 引物采用细菌通用引物 BA101F 5，-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3，和 BA534R5’-ATTACCGCGGCTGCTGCTGCTGG-3’。用 PCR 仪(GeneAmp, PCR System 9700)进行扩增反应。用 PCR 仪(GeneAmp, PCR System 9700)进行扩增反应。PCR 反应体系(25 μ L):2. 5 μ L10XPCR Buffer,2y L dNTPs (浓度为 2. 5mmol/L)，2 种引物各 O. 5 μ L，O. 5 μ L DNA 模板，0. 5yL rTaq DNA聚合酶(5U/μ L)，无菌去离子水18. 5 μ L。每次PCR反应中设置阴性样品作为参照，即以无菌超纯水代替DNA模板。PCR扩增程序针对16S rRNA全序列的PCR扩增程序为95°C预变性5min，94°C变性lmin, 58°C复性30s，72°C延伸3min，共30个循环，最后72°C延伸10min，l%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过程序进行同源性比较，表明该菌株与蜡样芽孢杆菌sp.)的相似性为99%，序列如下所示。I attagagttt gatcctggct caggatgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 61 agcgaatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg
121 ggtaacctgc acataagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatactggataatat181 tttggacctc atggttcaaa attgaaaggc ggcttcggct gtcacttatg gatggacccg241 cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg tagccgacct301 gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggcccagactcctacgggaggcagca361 gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtgagtgatgaag421 gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag tgctagttga ataagctggc481 accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctactacgt gccagcagcc gcggtaatac541 gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa601 gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgggagacttgag661 tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaatgcgtagagatatggaggaa721 caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac tgaggcgcgaaagcgtgggg781 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag841 agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg901 ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgcacaagcggtggagcatgtggt961 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgat aaccctagag1021 atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1081 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccatcatt1141 aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccggaggaaggtggggatgacgtca 1201 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaaagagc1261 tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc tcagttcgga ttgtagactg1321 caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat1381 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt1441 cggtggggta acctttttgg agccagccgc ctaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt1501 cgtaacaagg taaccaat具体实施方式
三
制备菌株cereus H-hrbOl的休眠细胞将培养好的菌株cereusH-hrbOl于8000 r/min,4°C下离心10 min,用磷酸缓冲液洗漆3次,用同样的缓冲液重悬该沉淀，使得休眠细胞浓度为10 mg/ ,于4°C冻存，备用，即制得菌株feci/AAs· cereusH-hrbOl的休眠细胞。
具体实施方式
四
菌株Bacillus cereus H_hrb01生长曲线测定。按照测定细菌生长曲线的标准方法对菌株cereus H-hrbOl的生长曲线进行测定,每隔2h取培养液,采用光电比池法，在600nm波长处测定菌液的OD6tltl(Optical Density),然后经O. 22 μ m微孔滤膜过滤,检测滤液PO广-P, pH值等指标。获得菌株cereus H-hrbOl生长曲线如图3所示。从图3中可以看出，菌株cereus H-hrbOl的生长曲线比较典型,潜伏期较短,为2h左右，这可能是因为菌株feci/AAs· cereus H-hrbOl的活性较强,且接种前后的培养条件相似，接入后在较短时间内即可适应新的环境。菌株的对数生长期约为14 16h，18h以后开始进入稳定期和衰亡期。从图中还可得知菌株接入培养液中后就开始吸磷，但主要发生在对数生长期，在这个时期，微生物生长代谢最旺盛，吸磷量随着对数期菌株的生长而逐渐增多。吸磷率在菌株进入稳定期后达到最大，接着出现了释磷现象，但释磷量很小。
具体实施方式
五菌株ifeciBiAs cereus H-hrbOl脱氮除磷效能测定将菌株cereus H_hrb01按照具体实施方案三方法处理后投加到人工废水中混合后进入SBR生物强化装置。采用连续投菌方式，在每日某周期初始的进水时投加菌株，并保持反应系统内的MLSS在3000mg/L以上。在污泥培养的全过程当中，均按照周期检测进水和出水的COD、NH4+-N、和P0/—-P指标。同时，在同样的运行条件下进行不投加反硝化聚磷菌的不进行生物强化的SBR启动的对照试验，获得结果如下
a . COD的去除菌株cereus H-hrbOl对COD的降解效能如图4所示。从图4中可以看出，进水COD浓度在300 420mg/L之间波动。反应器运行的第一天出水COD浓度为88mg/L,投加菌株cereus H-hrbOl后反应器出水COD浓度降至22mg/L左右，而未投加菌株的对照反应器出水COD浓度则为45mg/L左右。反应器运行第13 16天，投加菌株cereus H-hrbOl反应器的出水COD浓度平均值(23. 72mg/L)明显高于对照出水COD浓度平均值(45. 35mg/L),两者的COD平均去除率分别为93. 90%和88. 35%，相对增幅达5. 55%，说明投加菌株cereus H-hrbOl的系统对污水中所含有机污染物处理效果优于未经生物强化的对照反应器。
b.氨氮的去除菌株cereus H_hrb01对氨氮的去除效能如图5所示。从图5中可以看出，进水NH/-N浓度在60 80mg/L之间波动。反应器运行的第一天出水NH4+-N浓度为31. 64mg/L,经投加菌株cereus H-hrbOl后反应器出水NH4+_N浓度降至0. 56mg/L,在反应器运行第13 16天,投加菌株cereus H-hrb01的反应器出水NH/-N浓度平均值(I. 65mg/L)明显低于于对照出水NH4+_N浓度平均值(3. 70mg/L)，两者的NH4+-N平均去除率分别为97. 70%和94. 88%，相对增幅达2. 82%，说明投加菌株BaciIlus cereus H-hrbOl的系统对污水中所含氨氮的处理效果较好。c.可溶性磷的去除菌株cereus H-hrb01对可溶性磷的去除效能如图6所示。从图6中可以看出，进水Ρ043_-Ρ浓度在8 12. 18mg/L之间波动。反应器启动运行的第一天出水PO广-P浓度为8. 42mg/L,经投加菌株cereus H-hrbOl后反应器出水Ρ043_-Ρ浓度降至0. 24mg/L左右。在反应器启动第13 16天，投加菌株cereus H-hrb01的反应器出水Ρθ/__Ρ浓度平均值(0. 39mg/L)明显低于对照出水Ρθ/__Ρ浓度平均值(I. 91mg/L)，两者的Ρ043_-Ρ平均去除率分别为96. 25%和81. 64%，相对增幅高达
14.61%,说明经投加菌株cereus H-hrb01的系统对污水中所含磷酸盐的处理效果明显提升。结合反应器对C0D、氮和磷的去除情况可知，由于投加了菌株cereusH-hrbOl，出水各项指标均优于未投加菌株的对照组，尤其是对磷的去除和反硝化功能方面，投加菌株cereus H-hrbOl的系统经过短时间的启动运行获得了极好的脱氮除憐效果。
权利要求
1.一种反硝化聚磷菌腊样芽孢杆菌H-hrbOl,其特征在于菌株为Bacillus cereusH-hrbOl，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年3月27 日，保藏号为 CGMCC NO. 5939。
2.根据权利要求I所述的芽孢杆菌H-hrbOl，其特征在于经鉴定为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，在pH 5.0-11.0、10-45°C条件下生长，菌株宽度为I. 0_1. 2 μ m，长为3-5 μ m,无鞭毛；H-hrb01杆菌在固体培养基上生长为白色不规则菌落，表面光滑，边缘呈波浪状。
3.根据权利要求I或2所述反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌H-hrbOl的筛选方法，其特征在于菌株Bacillus cereus H_hrb01是稳定运行的SBR反应器缺氧段末的活性污泥中分离得到，具体筛选步骤如下 取SBR反应器运行稳定时某周期缺氧段末的活性污泥作为分离用泥，将所取活性污泥制成菌悬液，加入到反硝化培养基中，待培养基凝固后倒置培养皿于30°C恒温培养箱中培养2 3天后，选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在反硝化固体培养基上进行三区划线分离，重复3 4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用，所有操作均在无菌条件下进行；对己分离出来的菌株在富磷培养基中进行吸磷试验，同时辅助进行硝酸盐还原产气试验及异染颗粒染色(亚甲基蓝染色法)和PHB颗粒染色(苏丹黑染色法)检验；对于硝酸还原性为阳性并产气，菌体内又含有聚磷颗粒或PHB颗粒，在好氧或缺氧条件下能过量吸磷的细菌即为试验所需的反硝化聚憐囷种属； 反硝化培养基配制如下柠檬酸钠5. Og/L, K2HPO4 I. Og/L, KH2PO4 I. Og/L,MgSO4 ·7Η20 O. 2g/L, KNO3 2. 0g/L,琼脂 15g/L，用 NaOH 或者 HCl 调节培养基 pH 值至 7. 2，12111C高压蒸汽灭菌20min ； 富磷培养基配制如下(PO广-P 为 8mg/L) =CH3COONa · 3H20 3. 23g/L, KH2PO4 35mg/L, NH4Cl 305. 52mg/L, MgSO4 · 7H20 91. 26mg/L, CaCl2 · 2H20 25. 68mg/L, PIPES buffer8. 5g/L,微量元素2ml/L，琼脂15g/L，用NaOH或者HCl调节培养基pH值至7. 2，121 °C高压蒸汽灭菌20min ；微量元素的组成如下(IL) =FeCl3 0. 90g, H3BO3 0. 15g，KI 0. 18g，CuSO4 · 5H20 0. 03g，MnCl2 · 4H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 12g, CoCl2 · 7H20 0. 15g, Na2MoO4 · 2H20 0. 06g, EDTA10. OOg0
4.根据权利要求I所述的反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌H-hrbOl，其特征在于菌株Bacillus cereus H_hrb01在污水生物脱氮除磷工艺中的应用。
全文摘要
一种反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌属H-hrb01杆菌，属于生物工程、环境工程技术领域，经鉴定属于蜡状芽孢杆菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年3月27日，保藏号为CGMCC NO.5939，蜡样芽孢杆菌属菌株H-hrb01能以多种有机物为碳源，具有良好的反硝化除磷效能，可用于污水生物脱氮除磷工艺，将菌株H-hrb01进行活化培养后，投加到人工废水中混合后进入SBR生物强化装置，反应器出水各项指标均优于未投加菌株的对照系统，对污水中COD、氨氮和可溶性磷的去除率分别达到93.90%，97.70%和96.25%。
文档编号C12N1/02GK102827787SQ20121015319
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者马放, 张晓昕, 李昂, 孙移鹿, 张斯 , 杜丛, 庞长泷, 崔迪 申请人:哈尔滨工业大学宜兴环保研究院