专利名称：一种毛蠓新种及其coⅰ基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一毛蠓，具体涉及ー种毛蠓新种及其CO I基因序列。
背景技术：
毛蠓是城市緑化带和园林中常见的微型昆虫，属双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)毛蠓亚科。据目前所知，毛蠓亚科仅包含毛蠓属iDasyhelea Kieffer,1911) I属。因毛蠓是非吸血蠓类，对人畜无害，往往不被重视。但毛蠓在传播植物花粉以及环境无害化反应中的作用已逐渐被人们所关注。长期以来，对毛蠓等蠓类的鉴定主要依靠形态学特征来实现，但近几年，随着DN A测序等技术的进步，人们陆续采用分子生物学方法对蠓类的特征DNA进行研究，以期建立新的分类方法，与传统分类方法相互作证。线粒体CO I基因是蠓类鉴定研究中应用最为广泛的分子标记，目前主要应用于吸血蠓的分子鉴定研究，已成功地鉴定灰黑库蠓和不显库蠓等多个种团中的物种，同样可以应用于毛蠓的分子鉴定中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛蠓新种及其CO I基因序列。该新种的发现丰富了世界物种的多祥性，其CO I基因序列的获得，可为该物种的快速鉴定提供科学依据。为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现
将所得标本制成玻片，在生物显微镜下进行观察，绘制形态特征图，并查阅国内外有关文献，根据标本的形态特征，进行物种鉴定。该蠓种属于毛蠓属，命名为雄壮毛蠓(.Dasyhelea arrhena Wang, Guan and Yu, sp. nov.)。模式标本保存于军事医学科学院医学昆虫标本馆。所述毛蠓新种具有如下形态鉴定特征
a、t翅长 O. 75 mm,宽 O. 24 mm ；
b、体棕色，小型；
C、两复眼相接，无间距。小眼面间柔毛细小而密；
d、额片呈梭形；
e、触角鞭节刻纹明显，轮毛稀疏，第15节无端突，各节相对比长为19:10:10:10:10:10:10:10:12:22:23:19:21；AR I. 08 ；
f、触须各节相对比长为5:6:15:10:6；
g、唇基片近上缘有鬃2根，每侧各3根；
h、尾器第9背板后缘侧突发达，抱肢端节呈细臂状，阳茎中叶结构复杂，其中突粗壮，一对侧突的端部细而向内弯曲；阳基侧突中细短。采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增该毛蠓新种的CO I基因，PCR产物序列送由专业生物公司測定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性捜索，确保所得序列为目标序列。所述毛蠓新种的CO I基因序列SEQ ID No. I如下所不(不含引物)
tttaatatta ggagcccccg atatagcttt tcctcggata aataatataa gattttgaat60
actccccccc tctttatctt tattactaat tagtagctta gtcgaaaatg gtgccggaac 120 aggatgaact gtttatccac ctttagctag taacatcgct catagcgggg catctgttga 180 tttggctatc ttttctttac atttagctgg tatttcatca attttagggg cagtaaattt240
tattactacc attattaata tacgatcaaa tggaatctct tttgatcgta tacctctatt300
tgtgtgatca gtatttatta cagctatcct tttactgtta tctctaccag ttctagcagg360
agcaattaca atattattaa cagaccggaa tttaaataca tcattttttg accccgctgg 420aggaggtgac cctattttat accaacatct attttgattt tttggacatc ct472。所述毛蠓新种的CO I基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’ ；
反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。本发明所述的毛蠓新种的分子鉴定方法，包括
O从待测的毛蠓新种组织中分离提取DNA ；
2)以该DNA为模板用ー对引物，正向引物5’GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTTCC3’，反向引物5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出该毛蠓新种CO I基因；
3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因用琼脂糖电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统检测，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出524bp的条带，则送生物公司测序；
4)根据测序结果，如果与所述基因序列SEQID NO. I的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为雄壮毛蠓。本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述毛蠓新种进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
图I为本发明的雄壮毛蠓触角图。图2为本发明的雄壮毛蠓触须图。图3为本发明的雄壮毛蠓额片图。图4为本发明的雄壮毛蠓唇基片图。图5为本发明的雄壮毛蠓尾器(去阳茎中叶)图。图6为本发明的雄壮毛蠓阳茎中叶图。图7为本发明的雄壮毛蠓CO I基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下泳道1-2为雄壮毛蠓雄虫的CO I基因，检出大小为524bp的条带。M为DL-2000的DNAmarkerο 图8为未知毛蠓CO I基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下泳道I为未知毛蠓雄虫的CO I基因，检出大小为524bp的条带。M为DL-2000的DNA marker。
具体实施例方式 实施例I
I、标本的采集与保存
采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。2、玻片标本制作
取出保存于75%酒精中的标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片。标本制作參照《中国蠓科昆虫》(虞以新主編，2005)所描述的方法进行。标本剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管ー只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有剩余组织部位的PCR管置于_20°C冰箱冻存。3、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取雄壮毛蠓DNA (文礼章主編.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京科学出版社，2010. 278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用。4、引物合成
本实施例所用引物如下
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’
5、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表I所示。表I为雄壮毛蠓CO I基因PCR反应体系(50uL体系)
权利要求
1.ー种毛蠓新种，其特征在于该蠓种属于毛蠓属，命名为雄壮毛蠓arrhena Wang, Guan and Yu, sp. nov.)。
2.权利要求I所述的毛蠓新种，其特征在于具有如下形态鉴定特征a、t翅长 O. 75 mm,宽 O. 24 mm ； b、体棕色，小型； C、两复眼相接，无间距，小眼面间柔毛细小而密； d、额片呈梭形； e、触角鞭节刻纹明显，轮毛稀疏，第15节无端突，各节相对比长为19:10:10:10:10:10:10:10:12:22:23:19:21；AR I. 08 ； f、触须各节相对比长为5:6:15:10:6； g、唇基片近上缘有鬃2根，每侧各3根； h、尾器第9背板后缘侧突发达，抱肢端节呈细臂状，阳茎中叶结构复杂，其中突粗壮，一对侧突的端部细而向内弯曲；阳基侧突中细短。
3.权利要求I所述的毛蠓新种的COI基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID No. I tttaatatta ggagcccccg atatagcttt tcctcggata aataatataa gattttgaat60 actccccccc tctttatctt tattactaat tagtagctta gtcgaaaatg gtgccggaac 120 aggatgaact gtttatccac ctttagctag taacatcgct catagcgggg catctgttga 180 tttggctatc ttttctttac atttagctgg tatttcatca attttagggg cagtaaattt 240 tattactacc attattaata tacgatcaaa tggaatctct tttgatcgta tacctctatt 300 tgtgtgatca gtatttatta cagctatcct tttactgtta tctctaccag ttctagcagg 3d0 agcaattaca atattattaa cagaccggaa tttaaataca tcattttttg accccgctgg 420 aggaggtgac cctattttat accaacatct attttgattt tttggacatc ct 472 。
4.权利要求3所述毛蠓新种的COI基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’ ；反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。
5.一种毛蠓新种的分子鉴定方法，包括 1)从待测的毛蠓新种组织中分离提取DNA； 2)以该DNA为模板用ー对引物，正向引物5’GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTTCC3’，反向引物5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出该毛蠓新种CO I基因； 3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因用琼脂糖电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统检测，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出524bp的条带，则送生物公司测序； 4)根据测序结果，如果与所述基因序列SEQID NO. I的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为雄壮毛蠓。
全文摘要
本发明公开了一种毛蠓新种及其COⅠ基因序列，该蠓种属于毛蠓属，命名为雄壮毛蠓(DasyheleaarrhenaWang,GuanandYu,sp.nov.)。通过形态鉴定和序列分析等方法对该蠓种进行了研究，结果表明该蠓种属于毛蠓属的一个新种。同时，获取了该新种的COⅠ基因序列，为该蠓的分子鉴定提供依据。
文档编号C12N15/12GK102687707SQ201210153248
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者史灵梅, 张建庆, 房长天, 方义亮, 王光辉, 王飞鹏, 肖武, 黄恩炯 申请人:福建国际旅行卫生保健中心