专利名称：一种毛蠓新种及其特异dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种毛蠓，具体涉及ー种 毛蠓新种及其特异DNA序列。
背景技术：
毛蠓是城市緑化带和园林中常见的微型昆虫，属双翅目(Diptera)蠓科(Ceratopogonidae)毛蠓亚科。据目前所知，毛蠓亚科仅包含毛蠓属iDasyhelea Kieffer,1911) I属。因毛蠓是非吸血蠓类，对人畜无害，往往不被重视。但毛蠓在传播植物花粉以及环境无害化反应中的作用已逐渐被人们所关注。长期以来，对毛蠓等蠓类的鉴定主要依靠形态学特征来实现，但近几年，随着DNA测序等技术的进步，人们陆续采用分子生物学方法对蠓类的特征DNA进行研究，以期建立新的分类方法，与传统分类方法相互作证。线粒体CO I基因是蠓类鉴定研究中应用最为广泛的分子标记，目前主要应用于吸血蠓的分子鉴定研究，已成功地鉴定灰黑库蠓和不显库蠓等多个种团中的物种，同样可以应用于毛蠓的分子鉴定中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种毛蠓新种及其特征DNA序列。该新种的发现丰富了世界物种的多祥性，其特征DNA序列的获得，可为该新种的快速鉴定提供科学依据。为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现
将所得标本制成玻片，在生物显微镜下进行观察，绘制形态特征图，并查阅国内外有关文献，根据标本的形态特征，进行物种鉴定。该蠓种属于毛蠓属，命名为林子毛蠓{Dasyhelea silvatica Wang, Zhang and Yu, sp. nov.)。模式标本保存于军事医学科学院医学昆虫标本馆。所述毛蠓新种具有如下形态鉴定特征
a、t翅长 I. 15 mm,宽 O. 35 mm ；
b、体棕褐色，中型；
C、两复眼间的距离约为小眼面直径的1/3，小眼面间柔毛细小而密；
d、额片呈心形；
e、触角鞭节刻纹明显，轮毛长而密，第15节端突明显，各节相对比长为21:14:15:15:15:16:16:16:16:36:31:26:36 ；AR I. 13 ；
f、触须各节相对比长为9:10:17:11:14；
g、唇基片盾形，近上缘有鬃2根，每侧各3根；
h、尾器第9背板后缘侧突发达，抱肢端节呈细臂状，阳茎中叶无中突，一对侧突的顶端呈鸟首状；阳基侧突中叶柳叶状。采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增该毛蠓新种的CO I基因，PCR产物序列送由专业生物公司測定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性捜索，确保所得序列为目标序列。所述毛蠓新种的CO I基因序列如SEQ ID No. I所不(不含引物)
cttaatgcta ggagcccctg atatagcttt tcctcgaata aataatataa gattctggat60
actcccacct tctttaaccc ttctactggt aagttcacta gttgaaaatg gggctgggac120
aggatgaaca gtttaccctc cattggccag caatatcgcc cacggaggat cttcagttga 180 cttagcaatt ttttccttac atttagcagg tatttcatct attttaggag ccgtaaattt240
cattacaact attattaata tgcgatcaaa tgggattaca tttgatcgaa tacctttatt300
tgtttgatct gttttaatta ctgctatttt actcctttta tctcttcctg tcttagcagg360agctattact atactattaa ctgatcgaaa tttaaataca tcattttttg accctgctgg420
gggaggagat cctattttat accaacattt attctggttt tttggccacc ca472。所述的毛蠓新种的DNA标准检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为 正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’ ；
反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。本发明所述的毛蠓新种的分子鉴定方法，包括
O从待测的毛蠓新种组织中分离提取DNA ；
2)以该DNA为模板用ー对引物，正向引物5’GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTTCC3’，反向引物5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出该毛蠓新种CO I基因；
3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因用琼脂糖电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统检测，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出524bp的条带，则送生物公司测序；
4)根据测序结果，如果与所述基因序列SEQID NO. I的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为林子毛蠓。本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述毛蠓新种进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。
图I为本发明的林子毛蠓触角图。图2为本发明的林子毛蠓触须图。图3为本发明的林子毛蠓额片图。图4为本发明的林子毛蠓唇基片图。图5为本发明的林子毛蠓尾器(去阳茎中叶)图。图6为本发明的林子毛蠓阳茎中叶图。图7为本发明的林子毛蠓CO I基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下泳道1-2为林子毛蠓雄虫的CO I基因，检出大小为524bp的条带。M为DL-2000的DNAmarker。图8未知毛蠓CO I基因PCR扩增产物电泳鉴定图。编号说明如下泳道I为未知毛蠓雄虫的CO I基因，检出大小为524bp的条带。M为DL-2000的DNA marker。
具体实施例方式实施例I
I、标本的采集与保存
采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。2、玻片标本制作
取出保存于75%酒精中的标本，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片。标本制作參照《中国蠓科昆虫》(虞以新主編，2005)所描述的方法进行。标本剩余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管ー只，并进行唯一性编号，用于DNA提取。若需较长时间保存，则应将装有剩余组织部位的PCR管置于_20°C冰箱冻存。 3、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取林子毛蠓DNA (文礼章主編.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京科学出版社，2010. 278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用。4、引物合成
本实施例所用引物如下
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’
5、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表I所示。表I为林子毛蠓CO I基因PCR反应体系(50uL体系)
成分_体积(uL)
模板10.
引物I_I_
引物2_I_
2 XMastermix 25
ddH20Jl 3
本实施例的反应程序如表2所示。表2为林子毛蠓CO I基因PCR反应程序
步骤I反应温度(°c) ~[时间I循环数
预变性943min一
变性9430s5
退火4590s5
延伸6860s5
变性9430s35
退火5190s35
延伸6860s35
延伸68IOmin一
PCR产物于4°C保存备用。6、PCR扩增产物检测
取5 μ L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳30 min)。溴化こ锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱參见附图7。7、基因序列测定选取2-3个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序(測序所用引物与PCR所用引物相同)，所得基因序列经校正拼接后即为该毛蠓新种的CO I基因序列一SEQ IDNo. I。实施例2
I、标本的采集与保存
采用挥网法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于75%酒精中。2、试样的选取和和前处理
从采集到的蠓类标本中，随机挑选出ー只毛蠓，用解剖针将头、生殖器部分和翅切下，便于制片进行形态鉴定。剰余部分移入PCR管中，95%酒精保存，每管ー只，并进行唯一性编 号，用于DNA提取。3、DNA模板制备
采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取未知毛蠓DNA (文礼章主編.昆虫学研究方法与技术导论[M].北京科学出版社，2010. 278-286)，提取的DNA样品于-20°C保存备用。4、引物合成
本实施例所用引物如下
正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’
反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’
5、PCR扩增
本实施例的PCR反应体系如表3所示。表3为未知毛蠓CO I基因PCR反应体系(50uL体系)
权利要求
1.ー种毛蠓新种，其特征在于该蠓种属于毛蠓属，命名为林子毛蠓silvatica ffang, Zhang and Yuj sp. nov.)。
2.权利要求I所述的毛蠓新种，其特征在于具有如下形态鉴定特征a、さ翅长I. 15 mm，宽 O. 35 mm ; b、体棕褐色，中型； C、两复眼间的距离约为小眼面直径的1/3，小眼面间柔毛细小而密； d、额片呈心形； e、触角鞭节刻纹明显，轮毛长而密，第15节端突明显，各节相对比长为21:14:15:15:15:16:16:16:16:36:31:26:36 ；AR I. 13 ； f、触须各节相对比长为9:10:17:11:14； g、唇基片盾形，近上缘有鬃2根，每侧各3根； h、尾器第9背板后缘侧突发达，抱肢端节呈细臂状，阳茎中叶无中突，一对侧突的顶端呈鸟首状；阳基侧突中叶柳叶状。
3.权利要求I所述的毛蠓新种的DNA标准检测基因，其特征在于，所述毛蠓新种的DNA标准检测基因为CO I基因，具有如下所述的基因序列SEQ ID No. I cttaatgcta ggagcccctg atatagcttt tcctcgaata aataatataa gattctggat60 actcccacct tctttaaccc ttctactggt aagttcacta gttgaaaatg gggctgggac120aggatgaaca gtttaccctc cattggccag caatatcgcc cacggaggat cttcagttga 180cttagcaatt ttttccttac atttagcagg tatttcatct attttaggag ccgtaaattt240 cattacaact attattaata tgcgatcaaa tgggattaca tttgatcgaa tacctttatt300 tgtttgatct gttttaatta ctgctatttt actcctttta tctcttcctg tcttagcagg360 agctattact atactattaa ctgatcgaaa tttaaataca tcattttttg accctgctgg420 gggaggagat cctattttat accaacattt attctggttt tttggccacc ca472
4.权利要求3所述的毛蠓新种的DNA标准检测基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为 正向引物 5’ GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC3’ ； 反向引物 5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’。
5.一种毛蠓新种的分子鉴定方法，包括 O从待测的毛蠓新种组织中分离提取DNA ； 2)以该DNA为模板用ー对引物，正向引物5’GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTTCC3’，反向引物5’ CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC3’，通过聚合酶链式反应扩增出该毛蠓新种CO I基因； 3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应扩增出的COI基因用琼脂糖电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统检测，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出524bp的条带，则送生物公司测序； 4)根据测序结果，如果与所述基因序列SEQID NO. I的同源性在98%以上，即可判断所述的待测组织即为林子毛蠓。
全文摘要
本发明公开了一种毛蠓新种及其特异DNA序列，该蠓种属于毛蠓属，命名为林子毛蠓(Dasyhelea silvatica Wang,Zhang and Yu,sp.nov.)。通过形态特征和序列分析等鉴定方法对该蠓种进行了研究，结果表明该蠓种属于毛蠓属的一个新种。同时，获取了该新种的COⅠ基因序列，为该蠓的分子鉴定提供依据。该新种可在植物花粉的传播及环境无害化反应中发挥一定作用。
文档编号C12N15/12GK102687706SQ20121015241
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者史灵梅, 张建庆, 房长天, 方义亮, 王光辉, 王飞鹏, 肖武, 黄恩炯 申请人:福建国际旅行卫生保健中心