专利名称：磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法。
背景技术：
固定化酶允许酶的重复或是连续使用，易于底物和产物的回收、易于纯化，在一定、程度上改进了生物催化剂的性能。近年来，纳米材料如纳米粘土作为固定化酶的载体引起了人们很大的关注，原因在于其成本低、粒径小，且具有独特的插层性质；另外ー个重要原因是粘土表面的硅羟基经过不同官能团活化后，可作为生物大分子的附着位点。然而，在这些研究中存在的最大问题就是固定化酶完成催化反应后载体很难被分离，而磁性材料的多相催化可以满足生物催化剂的高效分离和催化过程的持续进行，因此，磁性纳米材料改性的粘土有望成为固定化酶的优良载体材料。已经有文献报道过磁性氧化铁/粘土纳米复合材料,然而，以往的这些研究结果显示，磁性纳米颗粒往往被固定在粘土表面，那么作为固定化酶附着位点的硅羟基便可能会被掩盖，这就限制了磁性纳米粘土材料在固定化酶领域的应用。此外，所制备这些磁性纳米材料的磁强度也非常低，不易分离，这也大大限制了其应用。就酶固定化而言，在吸附、交联、包埋和共价偶联四种主要的载体固定化酶方法中，除吸附法外其它三种方法所制备的固定化酶，其载体都不能再生，随着酶的失活而被丢弃，这就造成了环境污染、资源浪费以及生产成本増加。虽然传统的吸附法所制备的固定化酶其载体可以再生，但载体与酶结合不牢固、酶的损失比较严重，这也就限制了它的应用。因此，设计、开发和制备可再生的载体材料就成为本课题的研究重点之一，目前有关这方面的工作罕有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供ー种磁性纳米粒子对粘土表面影响较小的磁性纳米粘土载体固定化酶。本发明所要解决的另一个技术问题是提供该磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法。本发明所要解决的第三个技术问题是提供该磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法。为解决上述问题，本发明所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成，其特征在于所述载体为磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料,该磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成，且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。所述磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料是指首先将FeCl3 · 6H20以I :2(Tl :50的料液重量体积比溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到所述澄清溶液中，超声分散I飞h，得到混合液；最后将所述混合液加入到聚四氟こ烯衬里的不锈钢反应釜中，維持16(T210°C反应5 24h即得；其中所述NaAc与所述澄清溶液的重量体积比为I :7 1 18 ;所述聚こニ醇与所述澄清溶液的重量体积比为I :2(Tl :50 ;所述盐酸活化的纳米粘土与所述澄清溶液的重量体积比为I :60 1 :150。
所述盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按I :2(T30的料液重量体积比放入浓度为广3 M的HCl溶液中，在2(T40°C温度下超声0.5 2 h进行活化后，经离心分离并洗涤至上清液呈中性，再离心分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重后研磨、过3(T60Mm筛子即得。如上所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，其特征在于所述纳米粘土为凹凸棒、高岭土、蒙脱土中的任意ー种。如上所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤
⑴将磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料以I :4(Tl :80的料液重量体积比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加热回流，且队保护下反应6 15h，反应结束后こ醇洗涤三次，经磁分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重，得到改性的磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，记为Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基硅烷与所述ニ甲苯溶液的重量体积比为I :8 1 12 ；
⑵在质量浓度为2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,于室温下反应2 8h ；然后进行磁分离，得到沉淀物，该沉淀物经蒸馏水洗涤数次去除未反应的戊ニ醛；最后用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤沉淀物，并将该沉淀物记作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2与所述戊ニ醛溶液的重量体积比为I :30飞0 ；
⑶将所述Fe3O4O粘土 -GA载体按I :10 20的料液重量体积比加入到浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液中，在2(T40°C反应2 8小时进行酶的固定化；固定化后经离心分离并经浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤两次后，即得固定化酶；
⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。如上所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶；
②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超声半小吋，然后在8(Tl00°C下煮沸20 60分钟，得到预处理的载体；所述预处理的载体用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤数次后，按I :30飞0的料液重量体积比加入到质量浓度为2 10%的戊ニ醛溶液或环氧氯丙烷溶液中，于室温下反应2 8h，即得再生载体；
③所述再生载体用浓度为50mM、pH值为5.5的醋酸缓冲溶液洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. fO. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在2(T40°C空气浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生载体与所述糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比为I :10 20。用下述制备方法代替所述步骤②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且浓度为0. 5^10 mg/ml的Cu2+/Zn2+离子，室温下震荡0. 5飞h后，经离心分离即得再生载体。本发明与现有技术相比具有以下优点
I、由于本发明采用溶剂热法制备纳米磁性粘土，因此，磁性纳米粒子对粘土表面影响较小，且所制备的磁性纳米粘土具有较高磁強度。2、由于本发明考虑到酶是ー种蛋白质，其是由氨基酸组成，因此，其侧链以及端基有大量的反应性基团(如氨基、羧基、巯基以及咪唑基等)，因而固定化酶失活后，以共价键连接的载体还可以再生，载体再生方法简单易行，并具有广谱适用性。3、由于本发明采用溶剂热法制备纳米磁性粘土，因此，磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料相对于以往的研究而言在特定位点改性粘土可以减少外界材料对粘土本身性能的影响，并具有较高的磁强度使其易与反应液分离。
4、由于本发明中用到的固定化酶载体具有磁性，并且考虑到酶是ー种蛋白质，其是由氨基酸组成，其侧链以及端基有大量的反应性基团(如氨基、羧基、巯基以及咪唑基等)，因此，本发明固定化酶不仅在于可以对共价键结合的载体进行再生，而且在于它的易于回收和循环使用。固定化酶重复使用性能的测试方法如下磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料和再生载体固定化的糖化酶催化水解淀粉后被回收，用醋酸缓冲溶液(50 mM, pH= 5.5)洗涤三次，再次进入新一轮的催化反应。经十次反应周期完成后，磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料和再生载体固定化糖化酶的残留活力都接近于60%。其活力的损失主要是由于使用过程中吸附到载体表面的部分酶蛋白分子脱落，以及催化过程中部分酶蛋白变性所致。显然，将酶固定在磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料上増加了它的操作稳定性。此外，可再生载体固定化酶优良的可重复性进一步证明了载体再生战略的可行性。5、通过对磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料进行透射电镜测试(FEI Tecnai G20)，可以看出平均粒径为150 nm的Fe3O4附着在层状高岭土的不同位置，归纳起来有三种不同结构的Fe3O4O高岭土纳米复合材料，也就是说，Fe3O4纳米粒子可以固定在粘土层状结构的边缘和表面，或是插入两层之间(參见图I)。6、通过对磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料进行VSM测试(LAKESH0RE-7304，USA),在室温下Fe3O4O粘土复合材料具有超顺磁性的特性，由于其具有很高的磁效应，因而对于外部磁场有很快的磁响应，这也说明纳米复合材料的饱和磁強度已经足够满足固定化酶的需求。此外，可以看出纯Fe3O4纳米粒子的饱和磁强度出现在88. 97 emu/g。然而由于粘土的存在，Fe3O4O高岭土纳米复合材料的磁饱和强度降低到38. 56 emu/g, Fe3O4OATP下降到40. 85 emu/g,这基本上与Fe3O4在纳米复合材料中的比例相一致。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进ー步详细的说明。图I为本发明中Fe3O4O高岭土纳米复合材料的投射电镜照片。
具体实施例方式实施例I 磁性纳米粘土载体固定化酶，包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成。载体为磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，该磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成,且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。其中磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料是指首先将FeCl3 6H20以I :20的料液重量体积比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到澄清溶液中，超声分散(40kHz) lh，得到混合液；最后将混合液加入到聚四氟こ烯衬里的不锈钢反应釜中，維持160°C反应24h即得。NaAc与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :7 ;聚こニ醇与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :20 ;盐酸活化的纳米粘土与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :60。盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按I :20的料液重量体积比放入浓度为I M、的HCl溶液中，在20°C温度下超声(40kHz)2 h进行活化，以去除粘土表面残留的碳和钠离子。活化完成后，经离心分离(4000转/min)并用蒸馏水反复洗涤至上清液呈中性，再离心分离(4000转/min)后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(50°C，24小吋)至恒重后研磨、过30Mm筛子即得。实施例2 磁性纳米粘土载体固定化酶，包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成。载体为磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，该磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成,且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。其中磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料是指首先将FeCl3 6H20以I :50的料液重量体积比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到澄清溶液中，超声分散(40kHz) 5h，得到混合液；最后将混合液加入到聚四氟こ烯衬里的不锈钢反应釜中，維持210°C反应5h即得。NaAc与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :18 ;聚こニ醇与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :50 ;盐酸活化的纳米粘土与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :150。盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按I :30的料液重量体积比放入浓度为3 M的HCl溶液中，在40°C温度下超声(40kHz)0.5 h进行活化，以去除粘土表面残留的碳和钠离子。活化完成后，经离心分离(4000转/min)并用蒸馏水反复洗涤至上清液呈中性，再离心分离(4000转/min)后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(50°C，24小吋)至恒重后研磨、过60Mm筛子即得。实施例3 磁性纳米粘土载体固定化酶,包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成。载体为磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，该磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成,且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。其中磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料是指首先将FeCl3 6H20以I :35的料液重量体积比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到澄清溶液中，超声分散(40kHz)3 h，得到混合液；最后将混合液加入到聚四氟こ烯衬里的不锈钢反应釜中，維持185°C反应15h即得。NaAc与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :12 ;聚こニ醇与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :35 ;盐酸活化的纳米粘土与澄清溶液的重量体积比(kg/L)为I :110。盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按I :26的料液重量体积比放入浓度为2 M的HCl溶液中，在30°C温度下超声分散(40kHz)l h进行活化，以去除粘土表面残留的碳和钠离子。活化完成后，经离心分离(4000转/min)并用蒸馏水反复洗涤至上清液呈中性，再离心分离(4000转/min)后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(40°C，48小吋)至恒重后研磨、过45Mm筛子即得。上述实施例广3中的纳米粘土为凹凸棒、高岭土、蒙脱土中的任意ー种。实施例4 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤
⑴将磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料以I :40的料液重量体积比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中2h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在90°C下油浴加热回流，且N2保护下反应6h，反应结束后こ醇洗涤三次，经磁铁将其分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，记为Fe3O4O粘土 -NH2。该Fe3O4O粘土 -NH2通过Vario EL元素分析仪测出(C、H和N)元素的含量，结果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分别为0. 6mmol/g 和 0.9 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷与ニ甲苯溶液的重量体积比(kg/L)为I :8。⑵在质量浓度为2%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室温下反应2h ;然后经磁铁将其分离，得到沉淀物，该沉淀物经蒸馏水洗涤数次去除未反应的戊ニ醛；最后用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤沉淀物，并将该沉淀物记作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2与戊ニ醛溶液的重量体积比(kg/L)为I :30。⑶将Fe3O4O粘土 -GA载体按I :10的料液重量体积比(kg/L)加入到浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液中，在20°C反应2小时进行酶的固定化；固定化后经磁铁将其分离并经浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤两次后，即得固定化酶。反应后的溶液和洗涤液合并，用来測定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。实施例5 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤
⑴将磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料以I :80的料液重量体积比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中4h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在130°C下油浴加热回流，且队保护下反应15h，反应结束后こ醇洗涤三次，经磁铁将其分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，记为Fe3O4O粘土 -NH2。该Fe3O4O粘土 -NH2通过Vario EL元素分析仪测出(C、H和N)元素的含量，结果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分别为0. 8 mmol/g 和 1.2 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷与ニ甲苯溶液的重量体积比(kg/L)为I :12。⑵在质量浓度为10%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室温下反应8h ;然后经磁铁将其分离，得到沉淀物，该沉淀物经蒸馏水洗涤数次去除未反应的戊二醛；最后用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤沉淀物，并将该沉淀物记作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2与戊ニ醛溶液的重量体积比(kg/L)为I :60。⑶将Fe3O4O粘土 -GA载体按I :20的料液重量体积比(kg/L)加入到浓度为50mM、 pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液中，在40°C反应8小时进行酶的固定化；固定化后经磁铁将其分离并经浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤两次后，即得固定化酶。反应后的溶液和洗涤液合并，用来測定未固定的酶蛋白含量。
⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。实施例6 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤
⑴将磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料以I :60的料液重量体积比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中3h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在110°C下油浴加热回流，且队保护下反应10h，反应结束后こ醇洗涤三次，经磁铁将其分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，记为Fe3O4O粘土 -NH2。该Fe3O4O粘土 -NH2通过Vario EL元素分析仪测出(C、H和N)元素的含量，结果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分别为0. 7 mmo I /g ネロ I. I mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷与ニ甲苯溶液的重量体积比(kg/L)为I :10。⑵在质量浓度为6%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室温下反应5h ;然后经磁铁将其分离，得到沉淀物，该沉淀物经蒸馏水洗涤数次去除未反应的戊ニ醛；最后用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤沉淀物，并将该沉淀物记作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2与戊ニ醛溶液的重量体积比(kg/L)为I :40。⑶将Fe3O4O粘土 -GA载体按I :15的料液重量体积比(kg/L)加入到浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液中，在30°C反应5小时进行酶的固定化；固定化后经磁铁将其分离并经浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤两次后，即得固定化酶。反应后的溶液和洗涤液合并，用来測定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。实施例7 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量5倍的丙酮/こ醇超声半小时，然后在80°C下煮沸60分钟，得到预处理的载体；预处理的载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，按I :30的料液重量体积比(kg/L)加入到质量浓度为2%的戊ニ醛溶液或环氧氯丙烷溶液中，于室温下反应2h，即得再生载体。③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在20°C空气浴固定化8h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :10。实施例8 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍的丙酮/こ醇超声半小时，然后在100°C下煮沸20分钟，得到预处理的载体；预处理的载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，按I :60的料液重量体积比(kg/L)加入到质量浓度为10%的戊ニ醛溶液或环氧氯丙烷溶液中，于室温下反应8h，即得再生载体。③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在40°C空气浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :20。实施例9 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量8倍的丙酮/こ醇超声半小时，然后在90°C下煮沸40分钟，得到预处理的载体；预处理的载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，按I :40的料液重量体积比(kg/L)加入到质量浓度为6%的戊ニ醛溶液或环氧氯丙烷溶 液中，于室温下反应5h，即得再生载体。③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在30°C空气浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :15。实施例10 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍、且浓度为0. 5mg/ml的Cu2+/Zn2+离子，室温下震荡0. 5h后，经离心分离(4000转/min)即得再生载体。③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在20°C空气浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :10。实施例11 上述实施例f 3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量20倍、且浓度为10 mg/ml的Cu2+/Zn2+离子，室温下震荡6h后，经离心分离(4000转/min)即得再生载体。③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在40°C空气浴固定化8 h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :20。实施例12 上述实施例广3的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤
①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量15倍、且浓度为5 mg/ml的Cu2+/Zn2+离子，室温下震荡3h后，经离心分离(4000转/min)即得再生载体。
③再生载体用醋酸缓冲溶液(50mM、pH=5. 5)洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在30°C空气浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生载体与糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比(kg/L)为I :15。应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域的人可以提出各种改进和变化 ，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质和范围以及所附的权利要求范围内。
权利要求
1.磁性纳米粘土载体固定化酶，包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成，其特征在于所述载体为磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，该磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成，且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。
2.如权利要求I所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，其特征在于所述磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料是指首先将FeCl3 6H20以I :2(Tl :50的料液重量体积比溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后将NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次将盐酸活化的纳米粘土加入到所述澄清溶液中，超声分散I飞h，得到混合液；最后将所述混合液加入到聚四氟こ烯衬里的不锈钢反应釜中，維持16(T210°C反应5 24h即得；其中所述NaAc与所述澄清溶液的重量体积比为I :7 1 18 ;所述聚こニ醇与所述澄清溶液的重量体积比为I :2(Tl :50 ；所述盐酸活化的纳米粘土与所述澄清溶液的重量体积比为I :6(Tl :150。
3.如权利要求2所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，其特征在于所述盐酸活化的纳米粘土是指将纳米粘土按I :2(T30的料液重量体积比放入浓度为广3 M的HCl溶液中，在2(T40°C温度下超声0.5 2 h进行活化后，经离心分离并洗涤至上清液呈中性，再离心分离 后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重后研磨、过3(T60Mffl筛子即得。
4.如权利要求3所述的磁性纳米粘土载体固定化酶，其特征在于所述纳米粘土为凹凸棒、高岭土、蒙脱土中的任意ー种。
5.如权利要求I所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤 ⑴将磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料以I :4(Tl :80的料液重量体积比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶胀，然后在搅拌下将Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加热回流，且队保护下反应6 15h，反应结束后こ醇洗涤三次，经磁分离后得到沉淀物，该沉淀物经真空干燥至恒重，得到改性的磁性纳米Fe3O4O粘土复合材料，记为Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基硅烷与所述ニ甲苯溶液的重量体积比为I :8 1 12 ； ⑵在质量浓度为2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,于室温下反应2 8h ；然后进行磁分离，得到沉淀物，该沉淀物经蒸馏水洗涤数次去除未反应的戊ニ醛；最后用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤沉淀物，并将该沉淀物记作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2与所述戊ニ醛溶液的重量体积比为I :30飞0 ； ⑶将所述Fe3O4O粘土 -GA载体按I :10 20的料液重量体积比加入到浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液中，在2(T40°C反应2 8小时进行酶的固定化；固定化后经离心分离并经浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤两次后，即得固定化酶； ⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。
6.如权利要求I所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，包括以下步骤 ①使经数次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶； ②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超声半小吋，然后在.8(Tl00°C下煮沸20 60分钟，得到预处理的载体；所述预处理的载体用浓度为50mM、pH值为.5.5的醋酸缓冲溶液洗涤数次后，按I :30飞0的料液重量体积比加入到质量浓度为2 10%的戊ニ醛溶液或环氧氯丙烷溶液中，于室温下反应2 8h，即得再生载体；③所述再生载体用浓度为50mM、pH值为5. 5的醋酸缓冲溶液洗涤数次后，然后加入浓度为50mM、pH值为5. 5、糖化酶含量为0. f0. 6 mg的糖化酶醋酸缓冲液，采用摇床在2(T40°C空气浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生载体与所述糖化酶醋酸缓冲液的重量体积比为I :10 20。
7.如权利要求6所述的磁性纳米粘土载体固定化酶的再生的方法，其特征在于用下述制备方法代替权利要求6中所述步骤②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且浓度为0.5 10 mg/ml的Cu2+/Zn2+离子，室温下震荡0. 5飞h后，经离心分离即得再生载体。
全文摘要
本发明涉及一种磁性纳米粘土载体固定化酶，该固化酶包括固定对象为糖化酶和相应固定化酶的载体，并以共价偶联法为固定化方法制成，其特征在于所述载体为磁性纳米Fe3O4@粘土复合材料，该磁性纳米Fe3O4@粘土复合材料由磁性Fe3O4纳米粒子和纳米粘土材料组成，且磁性Fe3O4纳米粒子有序地组装在所述纳米粘土上。本发明采用溶剂热法制备了超顺磁性的Fe3O4@粘土纳米复合材料，经γ-氨丙基三乙氧基硅烷对其进行表面改性后，利用戊二醛作为偶联剂将糖化酶共价固定于载体表面，并设计了两种新颖的载体再生策略。再生载体固定化糖化酶后依然保持着固定化酶原有的活性、热稳定性以及可重复使用性等优良性能。本发明还可适用于其它以共价偶联法固定化酶载体的再生。
文档编号C12N11/14GK102649954SQ20121015210
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者李彦锋, 王建芝, 赵光辉, 金新亮 申请人:兰州大学