专利名称：复合胰蛋白酶组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及ー种复合胰蛋白酶组合物，以及其应用。
背景技术：
蛋白水解酶具有广泛的商业应用，并成功的在エ业中实现，诸如，清洁剂、皮革、医药、农业、食品及乳制品中。胰蛋白酶作为蛋白酶的ー种，已经在商业应用中得到了推广。胰蛋白酶是肽链内 切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶也是特异性最強的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，是不可缺少的工具。胰蛋白酶临床用于抗炎消肿，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用；临床上还用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等，通过喷雾吸入，用于呼吸道疾病，也可用于治疗毒蛇咬伤，另外，还可应用于皮革制造、生丝处理、食品加工。胰蛋白酶最早是从新鲜动物的胰脏制备获得的，具体为通过绞碎、配料、磨浆、消化、过滤、干燥、球磨等エ艺制备成胰蛋白酶原粉，然后加填充剂稀释成不同酶活性的胰蛋白酶成品。虽然制备过程相对简单，但由此制备的胰蛋白酶活性相对较低，且难以控制，从而限制了胰蛋白酶的使用。低聚木糖(xylooligosaccharide, X0S),又称为木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1，4糖苷键结合而成的功能性聚合糖，其天然存在于竹根、水果、蔬菜、牛乳和蜂蜜中，来源广泛，获得成本低。低聚木糖因其稳定性，以及多重生理功能性，已在食品、医药、保健、饲料等各种领域得到广泛应用。随着研究的深入，人们也逐渐发现低聚木糖还具有更多其他功能，作为最具市场潜カ的一种低聚糖，低聚木糖在更多应用领域的潜能也有待进ー步开发。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高胰蛋白酶活性的复合胰蛋白酶组合物。ー种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比大于等于O. 001:1000。进ー步地,所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在0:001:1000 100:1000的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在O. 005:1000^100:1000 的范围。
进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在O. 01:1000^100:1000 的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(I!)之比在O. 02:1000^100:1000 的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在1:100(Tl00:1000的范围。进ー步地,所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比为0:001:1000或
O.005:1000 或 O. 01:1000 或 O. 02:1000 或 1:1000 或 100:1000。本发明另一方面还涉及上述复合胰蛋白酶组合物在医药エ业、皮革制造、食品加 エ中的应用。本发明的有益效果在于本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性，这样相对于具有相同活性的胰蛋白酶的制备成本降低，使得胰蛋白酶的使用范围更加广泛。另外，由于在胰蛋白酶添加了低聚木糖，有效利用低聚木糖的生理功能，使得胰蛋白酶的功能得到了扩展。本发明提供的复合胰蛋白酶组合物应用于医药エ业、皮革エ业、食品エ业中，以较小的复合胰蛋白酶组合物添加量，实现了胰蛋白酶活性显著的提升，降低了生产成本。
图I为本发明提供的测试复合胰蛋白酶组合物酶活性的エ艺流程图。图2为本发明提供各实施例的不同组份的低聚木糖的胰蛋白酶组合物对应的酶活性提高率折线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对复合胰蛋白酶组合物进ー步说明。实施方式中的ー种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比大于等于O. 001:1000。进ー步地,所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在0:001:1000 100:1000的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在
O.005:1000^100:1000 的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在
O.01:1000^100:1000 的范围。进ー步地，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在
O.02:1000^100:1000 的范围。进ー步地,所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在1:100(Tl00:1000的范围。进ー步地,所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比为0:001:1000或O.005: 1000 或 O. 01:1000 或 O. 02:1000 或 1:1000 或 100:1000。上述复合胰蛋白酶组合物在医药エ业、皮革制造、食品加工中的应用。本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性，这样相对于具有相同活性的胰蛋白酶的制备成本降低，使得胰蛋白酶的使用范围更加广泛。另外，由于在胰蛋白酶添加了低聚木糖，有效利用低聚木糖的生理功能，使得胰蛋白酶的功能得到了扩展。本发明提供的复合胰蛋白酶组合物应用于医药エ业、皮革エ业、食品エ业中，以较小的复合胰蛋白酶组合物添加量，实现了胰蛋白酶活性显著的提升，降低了生产成本。以下为具体实施例部分
采用《QBT1803-1993エ业酶制剂通用试验方法》中测定蛋白酶活性的方法进行实验。试剂
福林试剂在2000 mL磨ロ回流装置中加入IOOg钨酸钠(Na2W04-2H20)、25g钥酸钠(Na2MoO4- 2 H2O), 700 mL水、50mL 85%磷酸、IOOmL浓盐酸，置于小火中沸腾回流10h，取下回流装置，在通风橱中加入50 g硫酸锂(Li2SO4)、50 mL水和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min,以除去多余的溴,冷却,加水定容至IOOOmL.混勻、过滤,I&存于棕色瓶内；使用时将一份福林试剂与ニ份水混合，摇勻；
O.4mol/L 碳酸钠溶液(Na2CO3)；
O.4mol/L三氯こ酸；
O.5mol/L氢氧化钠溶液(NaOH)；
I mo I/L盐酸溶液(HCl)及O. lmol/L盐酸溶液(HCl)；
缓冲溶液制备PH=7. 5磷酸缓冲液，称取6. 02 g磷酸氢ニ钠(Na2HPO4 · 12H20)和O. 5g磷酸ニ氢钠(NaH2PO4 · 2H20)，加水溶解并定容至IOOOmL,用pH剂校正至7. 5 ；
胰蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司(10000U/g)，使用时稀释5000倍。酪素购自上海源叶生物科技有限公司，使用时配成10g/L。实验方法 对照实验
(1).在试剂瓶中加入IHiL的胰蛋白酶及I mL的各种浓度的低聚木糖溶液(包括浓度为零，即不含低聚木糖)于40°C ±0.2°C环境中静置2min ;加入2. 00 mL的三氯こ酸，摇匀，于40°C ±0. 2°C环境中静置IOmin ;加入I. 00 mL酪素，混合均匀；
(2).将上述试剂瓶取出静置IOmin后过滤；
(3).用量杯取I.00 mL滤液，再在量杯中加入5. 00 mL碳酸钠溶液；加入I. OOmL福林试剂使用溶液，混合均匀；
(4).将步骤(3)中最終的溶液置于40°C±0.2°C，显色20 min，并于680nm波长，用IOmm比色皿，选取低聚木糖浓度为零的样品管设背景管，并调零。样品测试请參阅图I为本发明提供的测试复合胰蛋白酶组合物酶活性的エ艺流程图，具体エ艺如下
(I).在试剂瓶中加入I HiL的胰蛋白酶及I mL的各种浓度的低聚木糖溶液(包括浓度为零，即不含低聚木糖)于40°C ±0. 2°C环境中静置2min ；(2).再在上述试剂瓶中加入1.00mL酪素，混合均匀，于40°C ±0.2°C环境中静置IOmin ；
(3).再在上述试剂瓶中加入2.00 mL的三氯こ酸，摇匀；
(4).将上述试剂瓶取出静置10min后过滤；
(5).用量杯取I.00 mL滤液，再在量杯中加入5. 00 mL碳酸钠溶液；
(6).在上述量杯中加入I.00 mL福林试剂使用溶液，混合均匀；
(7).将步骤(6)中最終的溶液置于40°C±0. 2°C，显色20 min，并于680nm波长，用IOmm比色皿测试其吸光度。 标准曲线
绘制相应的含有不同含量低聚木糖的酪氨酸标准曲线，计算吸光常数K是否在规定范围内。计算得出K=98. 2895±0. 0013。即K值基本相同。实验所述浓度的低聚木糖在680nm波长处无明显吸光度。X = 5/ 10 XAXKXn X——样品的酶活力，u/g(u/mL)
A-----样品吸光度；
K------吸光常数；
5------反应试剂的总体积，mL
10----反应时间IOmin,以I min计;
η——稀释倍数。由此可以看出，由于K值基本相同，酶活的变化可以由A的变化来计算，本发明提供的实施例基于这ー原理，通过计算样品吸光度A变化率来表征样品的酶活性变化率。提高率按照下式计算
低聚木糖对胰蛋白酶活性提高率=(加入XOS后含胰蛋白酶样品吸光度-不加XOS时含胰蛋白酶样品吸光度)/不加XOS时含胰蛋白酶样品吸光度X 100%。对比例
加入不加低聚木糖时，按照上述试验所述的实验方法，即胰蛋白酶活性不受低聚木糖影响时，测试吸光度为O. 0322。实施例I :
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性(U)为O. 001:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0334。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高3. 73%。实施例2
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性(U)为O. 005:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0342。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高6. 21%。实施例3
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性(U)为O. 01:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0361。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高12. 11%。
实施例4;
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性(U)为O. 02:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0379。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高17. 70%。实施例5
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性U)为1:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0391。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高21. 43%。实施例6:
加入低聚木糖质量(g):胰蛋白酶活性(U)为100:1000，按照上述正式试验所述的实验方法，测试吸光度为O. 0397。采用上述提高率计算公式得出，本实施例提供的胰蛋白酶活性(U)相对于对比例胰蛋白酶活性(U)提高23. 29%。表I为本发明上述各实施例提供的胰蛋白酶添加不同质量的低聚木糖的吸光度及酶活性提高率。表I-各种胰蛋白酶组合物活性
权利要求
1.ー种复合胰蛋白酶组合物，其特征在干，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比大于等于O. 001:1000。
2.根据权利要求I所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在0:001:1000 100:1000的范围。
3.根据权利要求2所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在O. 005:1000^100:1000的范围。
4.根据权利要求3所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在0·01:100(Γ100:1000的范围。
5.根据权利要求4所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在O. 02:1000^100:1000的范围。
6.根据权利要求5所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比在1:100(Γ100:1000的范围。
7.根据权利要求6所述的复合胰蛋白酶组合物，其特征在于，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(U)之比为 0:001:1000 或 O. 005:1000 或 O. 01:1000 或 O. 02:1000 或 1:1000或 100:1000。
8.权利要求I至7之任一项在医药エ业、皮革制造、食品加工中的应用。
全文摘要
一种复合胰蛋白酶组合物，包含低聚木糖及胰蛋白酶，其中，所述低聚木糖质量(g)与胰蛋白酶活性(u)的比例小于等于100:1000。本发明提供的复合胰蛋白酶组合物在传统胰蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了胰蛋白酶的活性。本发明还提供该复合胰蛋白酶组合物在医药工业、皮革制造、食品加工中的应用，以较低的成本获得较佳的效果。
文档编号C12N9/96GK102676491SQ20121015166
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者周虹, 李旭, 陈功 申请人:苏州先阔生物科技有限公司