专利名称：检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测小反刍兽疫的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行小反刍兽疫检测的方法和试剂盒。
背景技术：
小反会兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反会兽疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)引起的ー种急性、烈性、接触性传染病，因其较高的发病率和死亡率，对山羊、绵羊、白尾鹿、野生的瞪羚 羊和藏羚羊等动物具有极大的威胁，是世界范围内公认的烈性传染病，我国也将该病列为ー类动物传染病。1942年，西非的科特迪瓦首次报道小反刍兽疫后，非洲大部分国家相继报道过本病的发生。近几年来，小反刍兽疫呈进一歩蔓延的趋势。2007年我国首次发现本病已通过边境从印度传入我国西藏局部地区，引起局部地区流行，对我国动物卫生安全尤其是小反刍兽的卫生安全构成了严重威胁，因此，灵敏度高、特异性强的小反刍兽疫诊断方法的建立就显得尤为迫切。小反当兽疫病毒(PPRV)属于副粘病毒科(Paramyxoviriade)麻疫病毒属(Morbollivirus)，同属的其他成员有牛瘟病毒(RPV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豹瘟病毒(PDV)、海豚瘟病毒(DDV)、牛麻疹病毒(MVKI)和人麻疹病毒(MV)等。PPRV的基因组结构为单股负链、无节段RNA。目前，小反刍兽疫的诊断方法主要有病毒分离鉴定、抗体血清学检测、抗原检测等。抗原检测方法有琼脂凝胶免疫扩散(AGID)、对流免疫电泳(CIEP)、间接荧光抗体试验(IFAT)等方法。抗体血清学诊断常采用OIE推荐的病毒中和试验(VNT)和竞争ELISA (c-ELISA)。随着分子生物学技术的迅猛发展，PCR技术得到了快速发展。毛立等报道了通过反转录PCR的方法检测本病毒。李伟、李林等用RT-LAMP检测本病毒。这些方法均可用于小反刍兽病毒的检测，但存在检测灵敏度低、假阳性高等不足。实时荧光定量PCR (real-time PCR)的出现，克服了普通PCR的不足，为目前较先进的检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性好、易操作、实效性好及重复性高等特点，实现了检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，并可根据需要对样品进行准确定量。该检测方法可满足对患病动物及其产品快速检测的要求，对保障国内畜牧业的健康发展，防止小反刍兽疫的传播具有重要意义，同时也为该病毒在自然宿主体内的致病性研究提供了一种新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测小反刍兽疫病毒的实时荧光定量PCR方法及小反刍兽疫病毒检测试剂盒，以提高对小反刍兽疫病毒的检测能力。本发明还提供用于特异性扩增靶序列的引物及与所述引物配合使用的荧光探针。本发明所提供的探针和引物不但适用于已报道的国内小反刍兽疫毒株的扩增还适用国外小反刍兽疫毒株的检测。
本发明提供了用于检测小反刍兽疫的遗传标记物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测小反刍兽疫的遗传标记物。进ー步，本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的突光探针。可以使用诸如Primer Express Version 3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20_50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补。在本发明的一个实施例中，用于扩增上述遗传标记物的特异性引物分别为上游引物F :5’-TCCATCATTACCCGTTCAAGACT-3’ (SEQ ID NO. 2)，
下游引物R :5’-GTCAGGATCTCCGGCCAAT-3’ (SEQ ID NO. 3)。本发明还提供了与引物配合使用的荧光探针，探针的5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团TAMRA。在本发明的一个实施例中，与上述引物配合使用的荧光探针核苷酸序列为5，-CTCGACAGGCTTGTCA-3’ (SEQ ID NO. 4)。本发明提供一种小反刍兽疫的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品cDNA或阳性质粒为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定結果。本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，其中25 μ L的反应体系为dOymol/LPremix Ex Taq 2Xbuffer 12. 5 μ L, 10 μ mol/L 的上、下游引物各 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 的探针 0. 8 μ L，ROX 染料 0. 4 μ L，模板 2 μ L, ddH20 8. 5 μ し本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性20s，56°C退火20s，40个循环。本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用有效扩增NTC(_)ANDP0S(+)无效扩增NTC (+) AND POS (+) 提示体系污染无效扩增NTC(_)AND POS(-) 提示体系错误或者试剂失效。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值小于等于38的标本为阳性结果；Ct值大于40的标本为阴性结果；Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明提供了一种用于小反刍兽疫检测的试剂盒，其包括上述遗传标记物或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的探针。本发明试剂盒的引物序列为上游引物F : 5 ’ -TCCATCATTACCCGTTCAAGACT-3 ’，下游引物 R : 5 ’ -GTCAGGATCTCCGGCCAAT-3 ’。
探针序列为(FAM)5’ -CTCGACAGGCTTGTCA-3’(TAMRA)。本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为小反刍兽疫基因组DNA。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂。利用本发明提供的引物和探针进行小反刍兽疫的荧光定量PCR检测方法进ー步简化小反刍兽疫的检测的程序、缩短检测周期，能够检测小反刍兽疫病毒株，可作为检测临床标本的手段，提高小反刍兽疫检测的阳性率。本发明的荧光定量PCR在反应过程中可收集到很好的信号，且检测样本的模板浓度均在建立方法的动力学范围内，并与麻疹病毒和犬瘟热病毒无交叉反应，具有良好的特异性。PPRV临床样品检测结果显示，实时荧光定量PCR方法的阳性检出率达到98. 1%。本发明建立的方法可用于小反刍兽疫早期快速诊断，并且能够实时地反映病毒的感染状况，动态地反映出病毒在机体组织中的分布情况。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了本发明的上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂 盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定小反刍兽疫的感染情況。
图I为实时荧光定量PCR检测小反刍兽疫标准曲线图，其中横坐标为阳性模板浓度的对数值，纵坐标为反应体系检测不同浓度阳性模板的Ct值，图中数字标示的模板浓度为 I :1 X IO7 个拷贝 /μ L ；2 :1 X IO6 个拷贝 /μ L ；3 :1Χ105 个拷贝 / μ L ；4 :1 X IO4 个拷贝/μ L ；5 =IXlO3 个拷贝 / μ L, R2 = O. 976。
具体实施例方式以下实施例进ー步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法所用引物和探针的设计与合成根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒基因序列，通过序列比对选择高度保守N基因作为扩增区域，设计I对特异引物和I条探针，引物与探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，PCR扩增产物为60bp。上述引物序列为上游引物F :5’-TCCATCATTACCCGTTCAAGACT-3’ (SEQ ID NO. 2),下游引物R :5’-GTCAGGATCTCCGGCCAAT-3’ (SEQ IDNO. 3)。探针序列为(FAM) 5，-CTCGACAGGCTTGTCA-3’ (TAMRA) (SEQ ID NO. 4)。扩增目的基因序列为TCCATCATTACCCGTTCAAGACTGCTCGACAGGCTTGTCAGATTGGCCGGAGATCCTGAC(SEQ IDNO. I)。SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列可以作为检测小反刍兽疫病毒的靶序列。
虽然引物和探针与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的靶序列或其特异性片段。实施例2小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立I.实验材料I. I毒种、菌株和载体小反刍兽疫病毒(PPRV)N75/1株(购自中国兽医药品监察所)、麻疹病毒(MV)、犬瘟热病毒(⑶V)本实验室保存；DH5a感受态细胞由本实验室保存；pCR'" 2. I-T克隆试剂盒购自Invitrogen公司。 I. 2主要仪器与试剂iQ5型荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司(Bio-Rad) ;DNA片段回收试剂盒、荧光定量PCR 2XEx premix Taq试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录酶(AMV，200U/μ L)购于Promega公司。I. 3引物和探长上游引物F、下游引物R和探针的核苷酸序列參见实施例I。2.方法与结果2. I扩增用阳性、阴性标准品的制备引物序列、探针序列參见实施例I。克隆N基因，构建PPRV-N重组质粒，命名为pCR 2. 1-PPRV-N。转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，LB培养基増殖。扩增片段连入T载体提质粒后定量，_20°C保存备用。阴性扩增对照为pCRK' 2. I-T02. 2样品的采集、处理与保存活体动物采集眼睑下结膜和鼻腔、颊部及直肠黏膜拭子。收集的拭子置于PBS溶液中，反复冻融三次后取出拭子，样品液10000r/min离心IOmin后取上清，-20°C保存备用。活体动物无菌操作采集动物血。自然凝固后分离血清装入灭菌小瓶中，加适量抗菌素，加盖密封后-20°C保存。采集的血液样品应标明样品编号、采集地点、动物种类和时间
坐寸ο病死动物采集肠系膜淋巴结和支气管淋巴结、脾脏、肠黏膜。采集的样品匀浆后反复冻融三次后，样品液10000r/min离心IOmin后取上清，_20°C保存备用。2. 3病毒RNA的提取与反转录在200μ L处理样品中加600μ L异硫氰酸胍，再加200μ L氯仿，颠倒混匀，13000r/min离心15min,将离心的上清转移至400 μ L预冷的异丙醇中，颠倒混勻，13000r/min离心15min,轻轻倒去上清,加600 μ L的75%こ醇，颠倒数次，13000r/min离心15min,轻轻倒去上清，加入20 μ L DEPC水混匀，2000r/min离心5sec,冰上保存备用。反转录反应液的配制5XReaction BufferΙΟμ
下游引物 R ( ΙΟμιηοΙ/L )3pL
dNTPs ( I Ommo]/L )5pL
AMV (200 /μ )1/μΕ
ddH209μΙ制备的20 μ L RNA 94°C作用5min，置于冰上5min。然后加入以上的反转录反应液28 μ L、RNA酶抑制剂I μ L、反转录酶I μ L，42°C水浴中反应lh，cDNA产物94°C灭活置于冰上备用。2. 4扩增体系与扩增条件实时荧光定量PCR的25 μ I反应体系为
Premix Ex Taq 2><buffer ( 10μιηο1./ .) 12‘5pL上游引物 F (lOpmol/L)0.4^iL
下游引物 R ( ΙΟμηιοΙ/L)0.4μΕ
探4十(Ι0μιηο!/ )Ο.Βμ
染料(ROX )0.4,liL
模板(cDNA或质粒模板)2μ[
ddH208.5,uL反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性20s，56°C退火20s，40个循环。2. 5标准曲线的绘制将标准质粒模板的浓度换算为拷贝数，按I. OX 10 I. OX IO7拷贝/ μ L共7个稀释度作为标准模板，进行实时荧光定量PCR。以拷贝数为X轴，循环数Ct为Y轴，获得标准曲线。如图I所示，图中数字标示的模板浓度为I =IXlO7个拷贝/ yL;2 :1 X IO6个拷贝/μ L ；3 =IXlO5 个拷贝 /μ L ；4 =IXlO4 个拷贝 / μ L ；5 =IXlO3 个拷贝 / μ L，R2 = 0. 976。2. 6结果的判定样本检测时均设立阴、阳性对照。检测中两种对照为有效扩增时，结果判断标准如下Ct值大于40的样本为阴性结果；Ct值小于等于38的样本为阳性结果；Ct值在38-40之间的样本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。根据标准曲线得到的回归方程来计算阳性样品的基因拷贝数。实施例3PPRV荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价I、灵敏度评价
灵敏度，又称真阳性率，即实际上是按照该本发明检测方法的标准被正确地判为小反刍兽疫的百分比。用本发明建立的小反刍兽疫病毒荧光定量PCR检测体系与普通反转录PCR方法同时检测105份疑似小反刍兽疫临床分离病料。如表I所示，本发明建立的方法与普通RT-PCR(即未添加本发明的探针，所使用的引物与本发明方法相同)相比灵敏度可达 98. 9% (92/93)。表I荧光定量PCR与普通反转录PCR检测结果评价
权利要求
1.一种用于检测小反刍兽疫(Peste des petits ruminants)的遗传标记物,其具有SEQ ID NO. I所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求I所述遗传标记物的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其核苷酸序列为上游引物 F :5’ -TCCATCATTACCCGTTCAAGACT-3’， 下游引物 R :5’ -GTCAGGATCTCCGGCCAAT-3’。
4.与权利要求2或3所述引物配合使用的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为5’ -CTCGACAGGCTTGTCA-3’。
6.ー种小反刍兽疫病毒的检测方法，其特征在干，以样品cDNA或阳性质粒为模板，以权利要求I所述的遗传标记物为靶序列，利用权利要求书2或3所述的引物和权利要求4或5所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定結果。
7.如权利要求6所述的小反刍兽疫的检测方法，其特征在干，实时荧光定量PCR25 μ L的反应体系为10 μ mol/L Premix Ex Taq2 Xbuffer 12. 5 μ L, 10 μ mol/L 的上、下游引物各 O. 4 μ L，10 μ mol/L 的探针 O. 8 μ L, ROX 染料 O. 4 μ L，模板 2 μ L, ddH20 8· 5 μ し
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在干，所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性30s，I个循环；95°C变性20s，56°C退火20s，40个循环。
9.含有权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针的试剂盒。
10.含有权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针的检测试剂。
全文摘要
本发明通过对小反刍兽疫N基因测序和比对，提供了用于检测小反刍兽疫的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本发明还提供了对小反刍兽疫病毒进行定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法及检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。
文档编号C12N15/11GK102676697SQ20121015135
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者史利军, 朱鸿飞, 李刚, 王勇, 程超飞, 金红岩, 黄华欣 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所