专利名称：一种脐带血来源的cik细胞的制备方法
技术领域：
本发明涉及细胞免疫领域，具体地说是一种CIK细胞的制备方法，即从脐带血中大量扩增获得高效的CIK细胞用于肿瘤生物免疫治疗，最终制备为细胞治疗产品，用于临床治疗乳腺癌等多种恶性肿瘤。
背景技术：
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells, CIK)是介导细胞毒活性最强的免疫效应细胞，兼具有T淋巴细胞的高度的杀瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等优点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。 现有技术中的CIK细胞制备方法大多采用病人的外周血单个核细胞，先加入IFN- y，24小时后再加入其他细胞因子如IL-2、IL-I a、⑶3，继续培养，这种方法制备出的CIK细胞存在繁殖能力差、细胞活性低等问题。
发明内容
本发明通过细胞来源的选择、培养方案的优化等方面的改进，提供了一种新的CIK细胞制备方法，解决了 CIK细胞增殖能力差，杀瘤活性低的问题。本发明提供了一种CIK细胞制备方法，其特征在于将脐带血单个核细胞用含有脐带血分离的上层血浆的培养基悬浮后加入rhIFN- y，继续培养24h后，转入用抗⑶3单克隆抗体包被的细胞培养瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3_L，再继续培养7_21天，即可获得成熟的CIK细胞。其中，加入rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3-L后隔天半量换液，并补加rhIL-2、rhIL-1 a、SCF和Flt3_L以保持培养基中其浓度不变。在一个特定的实施方案中，所分离的脐带血单个核细胞是采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血得到的。在一个特定的实施方案中，使用的培养基选自完全RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AIM-V培养基，优选GT-T551培养基；脐带血分离的上层血浆为自体脐带血血浆，并且其在培养基中的含量为0. 6-10%，优选为1% ;加入的细胞因子rhIFN- y、rhIL-2、rhIL-1 a、SCF 和 Flt3_L 的终浓度分别为 1000U/mL、1000U/mL、100U/mL、50 ng/mL 和 30 ng/mL。在最优选的实施方案中，所述CIK细胞制备方法包括下列步骤
(1)将分离得到的单个核细胞贴壁2h，扔掉贴壁细胞，取悬浮细胞用含有1%自体脐带血血浆和80 U/ml庆大霉素的GT-T551培养基调整细胞浓度为2X IO6个/ml接种于6孔板内，每孔2ml，并加入rhlFN-y 1000 U/ml，放置37 °C，5% CO2孵育箱中培养;
(2)培养24h后，转入用⑶3单克隆抗体包被的细胞培养瓶中，并加入1000U/mLrhIL-2、100U/mL rhIL-1 a、50 ng/mL SCF 和 30 ng/mL Flt3_L，在 37°C、5% CO2 培养箱中继续培养；(3)隔天半量换液，并补加rhIL-2、rhIL-l a、SCF和Flt3_L以保持培养基中其浓度不变，在37°C、5% CO2培养箱中共培养7-21天即可获得成熟的CIK细胞。通过CIK细胞生长曲线、CIK细胞免疫表型、CIK细胞杀伤活性证明本发明的方法所得到的CIK细胞具有细胞纯度高、增殖能力强、杀瘤活性强的特点。
图IA本发明的方法(实施例I)中培养第I天的细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20 X。图IB本发明的方法(实施例I)中培养第7天的细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为IOX。 图IC本发明的方法(实施例I)中培养第14天的细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为IOX。图2A本发明的方法(实施例I)中培养第I天的细胞的姬姆萨染色形态，放大倍率为20 X 0图2B本发明的方法(实施例I)中培养第14天的细胞的姬姆萨染色形态，放大倍率为20 X 0图3脐带血来源CIK细胞的生长曲线。第一组采用本发明的方法(实施例I);第二组在上述培养体系中不添加SCF和Flt3-L ;第三组在上述培养体系中，只加一次rhIL-1 a ;第四组在上述培养体系中，换用添加相应比例的胎牛血清；第五组在上述培养体系中，改变CD3单克隆抗体的添加方式，直接向培养基中加CD3单抗。图4A 图4E不同组别CIK细胞的流式细胞图。图4A 图4E分别为第一组 第五组。图5不同组别CIK细胞中⑶3+和⑶3+⑶56+的比例。图6本发明的方法(实施例I)得到的CIK细胞以不同的比例与靶细胞(乳腺癌细胞)共培养时的杀伤活性。图7不同组别CIK细胞以2. 5:1的比例与靶细胞(乳腺癌细胞)共培养时的杀伤活性。
具体实施例方式实施例I脐带血来源CIK细胞的制备 自体脐带血血衆的制备
I.无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐带血一份，枸橼酸抗凝，置离心管内离心15分钟。2.吸取上清大约30ml，放入离心管内，继续离心15分钟，收集上清血浆。3.将收集到的血浆放入56°C水浴30分钟，灭活补体。离心除去管中絮状沉淀物，将上清移至新的离心管中分装冻存备用。脐带血单个核细胞的分离
I.将分离完上层血浆的脐带血，混匀按照I: I的比例与生理盐水混匀，再按4:1的比例与6.0% (w/v)的羟乙基淀粉(HESpan)混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉降红细胞。2.吸出上清，置50ml离心管中，25°C、1800rpm离心5分钟。3.在15ml的离心管中加入5ml Ficoll人淋巴细胞分离液，再缓缓沿管壁加入5ml细胞悬液，250C、1800rpm离心25分钟，分离出单个核细胞。4.收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。5.用PBS悬浮细胞计数，备用。CIK细胞的体外诱导
I.将分离得到的单个核细胞贴壁2h，扔掉贴壁细胞，取悬浮细胞用含有1%自体脐带血 血浆和80 U/ml庆大霉素的GT-T551淋巴细胞、DC细胞培养基(日本TAKARA原装进口无血清培养基，由宝日医生物技术有限公司提供)调整细胞浓度为2X IO6个/ml接种于6孔板内，每孔2ml，并加入rhlFN-y 1000 U/ml，放置37 °C，5% CO2孵育箱中培养。2.培养24小时后，转入用⑶3单克隆抗体包被的细胞培养板中，并加入rhIL-21000 U/ml, rhIL-1 a 100 U/ml,50 ng/mL SCF 和 30 ng/mL Flt3_L，在 37。。、5% CO2 培养箱中继续培养。3.隔天半量换液，并补加rhIL-2、rhIL-1 a、SCF和Flt3_L以保持培养基中其浓度不变，在37°C、5% CO2培养箱中共培养21天获得成熟的CIK细胞。4.分别取培养第1、7和14天的细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，如图I所示，第I天的细胞明显呈现单个核细胞的球形，而第7和14天的细胞逐渐拉长，并可见集落形成。分别取第I和14天的细胞进行姬姆萨染色，倒置显微镜下观察，如图2所示，可见第14天的细胞胞浆量小，淡染，胞核体积大，核染色质致密。由此可见，本发明的方法成功将脐带血单个核细胞诱导成了 CIK细胞。5.以上为第一组实验操作，同样设其他四组比较实验，分别为第二组在上述培养体系中不添加SCF和Flt3-L ;第三组在上述培养体系中，只加一次rhIL-1 a ;第四组在上述培养体系中，换用添加相应比例的胎牛血清；第五组在上述培养体系中，改变CD3单克隆抗体的添加方式，直接向培养基中加CD3单抗。通过设置对比试验，比较上述培养体系的优劣。实施例2 CIK细胞的生长曲线测定
分别取培养的第1、7、9、11、14、18、21天的CIK细胞，台盼蓝染色，倒置显微镜下计数活细胞的总数(表I )，绘制不同培养体系的CIK细胞的生长曲线(图3)。表I不同组别CIK细胞的扩增数目
细胞数目Xio8 I第I天I第7天I第9天I第11天I第I4天I第I8天I第2I哭
第一组_2. 38 10. 8 13. 0 27. 80 63. 20 199. 50 244. 0
第二组_2.38 8 90~ 16.25 36.90 50.70 181.0 201.0
第三组—2.38 TT76~ 20. 75 39.80 76.10 142.0 205.0
第四组_2.38 lTT~ 22.25 35. 10 57.60 71.50 41.90
第五组|2.38 |9. 50 |l7.25|21.10 !46. 10 !41.60 !38.40
由此可见，与对比试验相比，本方法获得的CIK细胞增殖能力强。实施例3 CIK细胞免疫表型的检测
取培养第18天的CIK细胞，用无钙镁PBS洗2次后，各取I父105个/ ml，分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体包括⑶3、⑶56抗体各5 u 1,4 1避光孵育30分钟，每10分钟摇晃I次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400 u I的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur (BD Biosciences)检测，结果见图4、表2、图5。表2不同组别CIK细胞的免疫表型
IR别 |CD3+ICD+CD56+
竟一组 97. 01 ±0.67% ~§5.27±2.72%
竟二组 94. 12± I. 13% 16. 24±2. 57%*
竟三组 95. 56± I. 3 2% 18. 79± I. 24%*
竟四组 96. 27±1.01% Tl. 94±5. 04%*
竟五组 |86. 27±7. 46% |20. 06± I. 34%~
* P < 0. 01，n=3
由此可见，与对比试验相比，本方法得到的CIK细胞纯度高。实施例4 CIK细胞杀伤活性的检测
取培养21天的CIK细胞进行杀伤活性实验检测，靶细胞为乳腺癌细胞系ZR-751。效应细胞(第一组)与靶细胞的比例分别为2. 5:1、5:1、10:1、20:1、30:1和50:1时，CIK 细胞的杀伤活性分别为 51. 72%,55. 72%,72. 00%,89. 74%,87. 38%,86. 51%，见图 6。进一步分别比较了不同培养体系获得的CIK细胞与乳腺癌细胞共培养后杀伤活性的能力，效应细胞与靶细胞的比例为2. 5:1时，不同组别CIK细胞的杀伤活性分别为第一组51. 72%、第二组47. 33%、第三组:46. 96%、第四组:39. 99%、第五组:36. 37%，见图 7。由此可见，与对比试验相比，本方法所得到的CIK细胞具有杀瘤活性强的特点。
权利要求
1.ー种CIK细胞制备方法，其特征在于将脐带血单个核细胞用含有脐带血分离的上层血浆的培养基悬浮后加入rhIFN- Y，继续培养24h后，转入用抗⑶3单克隆抗体包被的细胞培养瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-Ια、SCF和Flt3_L，再继续培养7_21天，即可获得成熟的CIK细胞。
2.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，其中，加入rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3-L后隔天半量换液，并补加rhIL-2、rhIL-1 a、SCF和Flt3_L以保持培养基中其浓度不变。
3.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，其中，所述培养基选自完全RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AIM-V培养基。
4.权利要求3所述的CIK细胞制备方法，其中，所述培养基为GT-T551培养基。
5.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，其中，所述培养基中含O.6-10%脐带血分离的上层血浆。
6.权利要求5所述的CIK细胞制备方法，其中，所述培养基中含1%脐带血分离的上层血浆。
7.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，其中，所述脐带血分离的上层血浆为自体脐带血血衆。
8.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，其中，加入的细胞因子rhIFN-γ、rhIL-2、rhIL-1 a、SCF 和 Flt3_L 的终浓度分别为 1000U/mL、1000U/mL、100U/mL、50 ng/mL 和 30ng/mL0
9.权利要求I所述的CIK细胞制备方法，包括下列步骤 (1)将分离得到的单个核细胞贴壁2h，扔掉贴壁细胞，取悬浮细胞用含有1%自体脐带血血浆和80 U/ml庆大霉素的GT-T551培养基调整细胞浓度为2 X IO6个/ml接种于6孔板内，每孔2ml，并加入rhIFN-Y 1000 U/ml，放置37で，5% CO2孵育箱中培养； (2)培养24h后，转入用⑶3单克隆抗体包被的细胞培养瓶中，并加入1000U/mLrhIL-2、100U/mL rhIL-1 a、50 ng/mL SCF 和 30 ng/mL Flt3_L，在 37°C、5% CO2 培养箱中继续培养； (3)隔天半量换液，并补加rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3_L以保持培养基中其浓度不变，在37°C、5% CO2培养箱中共培养7-21天即可获得成熟的CIK细胞。
10.权利要求1-9任一项所述的CIK细胞制备方法，其中，所分离的脐带血单个核细胞是采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血得到的。
全文摘要
本发明公开了一种脐带血来源的CIK细胞的制备方法。该方法采用CD3单克隆抗体激活细胞，增强细胞的刺激强度，从而提高细胞的体外扩增能力，在细胞培养基中加入干细胞生长因子和Flt3-L可以有效促进脐带血中的造血细胞向免疫细胞诱导和增殖。该方法解决了CIK细胞增殖能力差、细胞活性低的问题，制备出的CIK细胞具有增殖能力强，杀瘤活性高的特点。
文档编号C12N5/0783GK102676454SQ20121015085
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者习佳飞, 刘大庆, 南雪, 史高娜, 吴明远, 李会, 裴雪涛, 陈琳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 北京和泽普瑞生物科技有限公司