专利名称：一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞体外扩增和保存方法，具体地说，是一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法。
背景技术：
受体对MHC不匹配的移植物发生排斥反应是组织和细胞移植失败的主要原因。在目前临床实践中，传统免疫抑制药物的使用，虽能有效防止移植排斥，缓解由供者T细胞介导的急、慢性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)，但常伴有受者整体免疫功能下降，感染机会增加和诱发肿瘤等副作用。因此，以诱导供受者之间移植免疫耐受为目的的细胞治疗方法日益受到重视。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)作为一种具有强大免疫抑制功能的T细胞亚群，被公认为免疫反应的主要负调节细胞，而基于Treg细胞的细胞疗法也被认为是最有希望成功的细胞疗法。Treg细胞可以通过多种方式调节免疫反应，包括分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β ；大量消耗维持炎症细胞生存的细胞因子IL-2以及细胞表面的接触抑制。同时活化Treg可以发挥广谱的抑制效应，且这种抑制效应可以不受MHC分子限制。小鼠骨髓移植实验证明新鲜分离或体外扩增的小鼠Treg细胞能有效的抑制GVHD，这说明人Treg细胞也可能同样具有这样的治疗潜力。然而，人Treg细胞的临床运用存在着许多问题和挑战。首先，机体内天然的Treg 细胞数目很少，在人体内，Treg细胞占⑶4+Τ细胞的5% 10%。这就需要建立有效的Treg 细胞体外扩增方法，才能满足大量的临床输注需要。其次，与小鼠Treg不同，人Treg细胞不能单纯依靠⑶25这一表面标志进行分离。一些Treg表达的标志，如R)XP3、CTLA-4和 GITR，也在某些活化效应T细胞上表达。所以，在分离人Treg细胞亚群时存在着巨大的困难，不能仅仅依靠上述这些标志进行分离。而相对的，来源于脐血的T细胞基本保持幼稚状态，T细胞亚群分布简单，存在明显的Treg细胞亚群，同时其含量也高于外周血。另外由于其含有相对较长的端粒，因而能够大量扩增。因此，脐血是Treg细胞的一个优质的来源。尽管仍有许多问题尚待解决，但令人鼓舞的是，多个Treg细胞的临床I期实验正在进行，并且在近期取得了重要进展。美国和意大利血液病专家已完成了两项体外扩增脐血和外周血Treg细胞抑制GVHD的I期临床试验，证明经第三方无关供者Treg细胞治疗的病人其GVHD症状明显减轻，且没有出现感染、复发或早期死亡的情况。这明确了体外扩增的第三方无关供者脐带血Treg细胞在抑制GVHD上具有显著的临床效果，也有力的证实了脐带血Treg细胞的临床运用是安全的。有研究表明，脐带血Treg细胞经过体外扩增培养后其在体内外的抑制能力要比新鲜分离的Treg细胞更强，而且Treg细胞经过冻存和融化后仍然能发挥其有效的抑制功能。综上所述，对脐带血Treg细胞进行体外扩增并进行深低温保存，建立体外扩增的第三方无关供者人脐带血调节性T细胞冷冻保存库将极大地推动 Treg细胞临床治疗造血干细胞移植移植物抗宿主病、同种异基因器官移植排斥、自身免疫性疾病的开展。中国专利文献CN1509327B公开了一种来自人类血液的⑶4⑶25调节性T细胞，该发明提供抑制性和/或调节性人类CD4+CD25+T细胞，用于增殖该细胞的方法，及抑制性和/ 或调节性人类CD4+CD25+T细胞和增殖的T细胞作为调节性药剂的用途。但是关于一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法。本发明的再一个目的是，提供一种所述的方法扩增后的调节性T细胞的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法，所述的方法包括以下步骤
a、用羟乙基淀粉代浆液分离脐带血中有核细胞，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，脐带血单个核细胞用免疫磁珠阴性分离步骤去除非CD4细胞得到CD4+细胞，脐带血CD4+细胞进一步用免疫磁珠阳性分离步骤分离出CD25+细胞，获得富含调节性T细胞的脐血CD4+CD25+T细胞；
b、在细胞培养板或细胞培养袋中用连接⑶3/^拟8抗体的磁珠和重组人IL-2扩增富集的脐带血⑶4+⑶25+Τ细胞，获得高纯度的调节性T细胞；
c、将所述扩增后的调节性T细胞低温保存在液氮中。所述的步骤a中分离得到脐带血单个核细胞的步骤包括输血传播传染病检测合格的脐带血按体积比4 1的比例加入6%羟乙基淀粉代浆液，4°C冰箱放置沉淀红细胞，取上层血浆层离心，弃大部分血浆，沉淀的白细胞重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。所述的步骤b中扩增时间为2-3周，其中包括两轮各6-8天的扩增和两轮扩增中间细胞休息2-4天。所述的步骤c中扩增后的调节性T细胞与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮-196°C保存。所述的冷冻保护剂由10% 二甲基亚砜，20%人白蛋白，70%羟乙基淀粉代浆液组成。所述的CD4+CD25+T细胞扩增后80_99%的细胞为CD4+CD25+T细胞，扩增后 CD4+CD25+T细胞中FoxP3+CD127-细胞比例大于80%。所述的CD4+CD25+T细胞扩增后数量为起始细胞的1000-3000倍。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是所述的方法扩增或低温保存后的调节性T细胞作为第三方无关供者细胞在制备治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、 自身免疫性疾病药物中的应用。本发明优点在于
本发明所述的一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存的方法，可以从脐带血中获得大量的调节性T细胞，在液氮中长期保存，能够满足临床对调节性T细胞制品的需求， 用于治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。
图1是扩增14天流式细胞仪检测脐血Treg细胞的表型。扩增后的脐带血Treg细胞共表达⑶4和⑶25，90%以上的细胞表达R)xP3。同时，与新鲜分选的⑶4+⑶25+T细胞相比,这些细胞高表达 CTLA-4 (68%)、CD39 (71%)和 LAG-3 (45%)。图2是扩增后的脐血Treg细胞的细胞因子表达。与活化的⑶4+⑶25-T细胞相比，扩增后的脐带血Treg细胞几乎不表达IL-2基因，表达少量的IFN-γ，而高表达IL-10 和TGF-β基因。图3是体外扩增的第三方无关供者脐血Treg抑制效应T细胞的增殖。从外周血磁珠分离得到⑶4+⑶25-细胞作为效应T细胞(Tste),经CFSE染色后，按Treg与Tste细胞不同比例加入扩增后的第三方无关供者的脐带血Treg细胞，每孔用CD3/C^8单克隆抗体或者成熟树突状细胞(mDC)刺激活化，培养4天后收集细胞并用流式细胞仪进行结果分析。 第三方无关供者的脐带血Treg细胞在Treg: Tjs应细胞比例为1 1、1 4、1 16时能有效抑制效应T细胞的体外扩增。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明的一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法包括以下步骤
1.输血传播传染病检测合格的脐带血按体积比4:1的比例加入6%羟乙基淀粉代浆液，4°C冰箱放置沉淀红细胞，取上层血浆层离心，弃大部分血浆，沉淀的白细胞重悬后用 Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。2.脐带血单个核细胞用免疫磁珠阴性分离步骤去除非CD4细胞得到CD4+细胞， 脐带血CD4+细胞进一步用免疫磁珠阳性分离步骤分离出CD25+细胞获得富含调节性T细胞的脐血CD4+CD25+T细胞。3.在细胞培养板或细胞培养袋中用连接⑶3/^拟8抗体的磁珠和重组人IL-2扩增富集的脐带血CD4+CD25+T细胞，扩增时间为2-3周，其中包括两轮各6_8天的扩增和两轮扩增中间细胞休息2-4天。4.扩增后脐带血调节性T细胞去除⑶磁珠，与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮-196 °C保存。冷冻保护剂由10% 二甲基亚砜(DMSO), 20%人白蛋白，70%羟乙基淀粉代浆液(HES)组成。5.冻存的脐带血调节性T细胞复苏后作为第三方无关供者输注治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。上述全部过程均在无菌环境中进行。需要说明的是，所述的CD4+CD25+T细胞扩增后80%_99%的细胞为CD4+CD25+T细胞，扩增后CD4+CD25+T细胞中R)xP3+CD127-细胞比例大于80%。所述的CD4+CD25+T细胞扩增后数量为起始细胞的1000-3000倍。实施例1
脐带血按体积比4:1的比例加入6%羟乙基淀粉代浆液，4°C冰箱放置Ih沉淀红细胞， 取上层血浆层离心(2000rpm/min，5min)，弃大部分血浆，沉淀的白细胞重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液分离(2000rpm/min，20min)，用PBS洗涤三次，得到脐带血单个核细胞。根据厂家的说明，用标准分离试剂盒，例如使用CliniMACS，Miltenyi Biotec公司的抗人CD8、 CD14、CD19、CD56单克隆抗体免疫磁珠去除脐带血单个核细胞中的非CD4细胞，然后对脐带血⑶4+T细胞用抗人⑶25抗体偶联的磁珠富集⑶4+⑶25+细胞。脐带血⑶4+⑶25+T细胞纯化后用流式细胞仪检测分离细胞的纯度。实施例2
在商购的细胞培养袋或细胞培养板中用抗人CD3/CM8抗体偶联的磁珠以及重组人 IL-2 (200U/ml)对纯化的脐带血CD4+CD25+T细胞进行体外扩增，使用X-VIV015完全培养液培养(含有10%灭活人AB血清，青、链霉素双抗50U/ml)，培养体系中CD3/C^8包被的 Dynal Beads与细胞的比例为1 1，于37°C、5%C02及饱和湿度的条件下进行培养，隔天半量更换培养液和IL-2。整个扩增时间为2-3周，其中包括各6-8天的两轮扩增和两轮扩增中间细胞休息2-4天，即细胞去除磁珠后在含IL-2 (20U/ml)的X-VIV015完全培养液培养2 天。体外扩增结束后细胞数量增加约1500倍，脐带血Treg细胞除去磁珠检测表面标志和体外抑制效应T细胞增殖的能力，并进行低温保存。实施例3
采用流式细胞术进行脐带血Treg细胞免疫表型分析。使用FITC标记的CD4抗体、 PE-Cy5标记的⑶25抗体、APC标记的⑶127抗体、PE标记的CTLA-4抗体、⑶39抗体、LAG3 抗体进行细胞表面标记，经固定液和破膜液处理之后，用PE标记的R)xp3进行细胞内标记。 如图1所示，扩增后的脐带血iTreg细胞共表达⑶4和⑶25，90%以上的细胞表达R)xP3。同时，与新鲜分选的CD4+CD25+T细胞相比，扩增后脐带血Treg细胞高表达CTLA_4(68%)、CD39 (71%)和 LAG-3 (45%)ο实施例4
采用微量抽提RNA方法获得活化的外周血CD4+CD25-T细胞以及扩增后Treg细胞总 RNA,再逆转录成cDNA，所获得的cDNA作为扩增靶基因片段，用于后续Real-time PCR体系中。以β-actin作为参照量，细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β作为靶基因，通过Real-time PCR比较活化的外周血⑶4+⑶25-T细胞和扩增后iTreg细胞IL_2、IFN- γ、 IL-10、TGF-β基因表达的差异。如图2所示，与活化的⑶4+CD25_T细胞相比，扩增后的脐带血Treg细胞几乎不表达IL-2基因，表达少量的IFN- γ，而高表达IL-10和TGF- β基因。实施例5
从外周血免疫磁珠分离纯化得到的⑶4+⑶25-细胞作为效应T细胞，经CFSE (5μΜ) 染色后，以5 X IO4/孔接种于96孔培养板中，再按Treg与效应T细胞不同比例(1 1、1 4、 1:16,1:64)加入扩增后的第三方无关供者的脐带血Treg细胞，每孔用⑶3/^拟8单克隆抗体(300ng/ml)或者经丝裂霉素处理后的同种异基因成熟树突状细胞(mDC)刺激活化，于 37°C、5% 0)2及饱和湿度条件下培养4天，4天之后收集细胞并用流式细胞仪进行结果分析。 如图3所示，第三方无关供者的脐带血Treg细胞在Treg: T效应细胞比例为1:1、1:4、1:16 时能有效抑制效应T细胞的体外扩增。实施例6
扩增后脐带血调节性T细胞去除CD3/CD^磁珠，与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮_196°C保存。冷冻保护剂由10% 二甲基亚砜(DMS0)，20%人白蛋白，70% 羟乙基淀粉代浆液(HES)组成。人脐带血经过严格检测程序(梅毒抗体检测、HIV免疫检测、 CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)检测合格后进行富集和体外扩增Treg细胞，获得的脐带血Treg细胞经纯度和体内外抑制功能检测合格后冻存在液氮中，用于治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤a、用羟乙基淀粉代浆液分离脐带血中有核细胞，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞，脐带血单个核细胞用免疫磁珠阴性分离步骤去除非CD4细胞得到CD4+细胞，脐带血CD4+细胞进一步用免疫磁珠阳性分离步骤分离出CD25+细胞，获得富含调节性T细胞的脐血CD4+CD25+T细胞；b、在细胞培养板或细胞培养袋中用连接⑶3/^拟8抗体的磁珠和重组人IL-2扩增富集的脐带血⑶4+⑶25+Τ细胞，获得高纯度的调节性T细胞；c、将所述扩增后的调节性T细胞低温保存在液氮中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中分离得到脐带血单个核细胞的步骤包括输血传播传染病检测合格的脐带血按体积比4:1的比例加入6%羟乙基淀粉代浆液，4°C冰箱放置沉淀红细胞，取上层血浆层离心，弃大部分血浆，沉淀的白细胞重悬后用Ficoll淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中扩增时间为2-3周，其中包括两轮各6-8天的扩增和两轮扩增中间细胞休息2-4天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中扩增后的调节性T细胞与冷冻保护剂预处理后，分装入冷冻管或冷冻袋中液氮-196°C保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的冷冻保护剂由10%二甲基亚砜，20% 人白蛋白，70%羟乙基淀粉代浆液组成。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T细胞扩增后80-99%的细胞为CD4+CD25+T细胞，扩增后CD4+CD25+T细胞中R)xP3+CD127-细胞比例大于80%。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD4+CD25+T细胞扩增后数量为起始细胞的1000-3000倍。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法扩增或低温保存后的调节性T细胞作为第三方无关供者细胞在制备治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种脐带血调节性T细胞体外扩增及低温保存方法，所述的方法包括以下步骤从脐带血中分离富含调节性T细胞的CD4+CD25+T细胞群；扩增所述富集后的CD4+CD25+T细胞群获得高纯度的调节性T细胞；将所述扩增后的调节性T细胞低温保存在液氮中，作为第三方无关供者调节性T细胞应用于临床疾病治疗。本发明优点在于本发明所述的方法，可以从脐带血中获得大量的调节性T细胞，在液氮中长期保存，能够满足临床对调节性T细胞制品的需求，用于治疗移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性疾病。
文档编号C12N5/0783GK102517253SQ20111042524
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者任亚娜, 杨懿铭, 杨洁, 范华骅, 谢如锋 申请人:上海市血液中心