专利名称：一种产尸胺工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程菌领域，尤其是一种产尸胺工程菌。
背景技术：
尸胺(Cadaverine)是一种多胺，S卩1，5_戊二胺(简称戊二胺)，在生物体内由赖氨酸脱羧生成，是广泛存在于生物体中的具有生物活性的含氮碱，但也作为一种肉毒胺存在于腐败物中。尸胺是合成新型材料聚酰胺-54(由尸胺和琥珀酸缩合而成)和聚酰胺-56(由尸胺和乙二酸缩合而成)的重要原料，具有重要的工业用途。目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻、污染环境， 酶转化法过程复杂、成本较高。利用基因工程技术构造代谢工程菌来直接规模化制备人类所需产品是最经济、环保和最有前途的方法，是代谢工程研究的方向和热点。微生物发酵法生产尸胺就是微生物利用糖类进行发酵，通过代谢直接大量合成尸胺，这种方法简单、经济、环保和高效，但要求微生物既能高效合成L-赖氨酸脱羧酶，又能高效合成L-赖氨酸，同时还能将尸胺转运到培养基中，防止尸胺对赖氨酸脱羧酶产生竞争抑制。虽然大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等可以直接合成尸胺，也对尸胺合成调节进行了广泛研究，但这些菌不能大量合成赖氨酸，尸胺合成量低，不适合直接发酵生产。谷氨酸棒杆菌能大量合成L-赖氨酸，但不能合成赖氨酸脱羧酶，也不能转运尸胺，给发酵制备尸胺带来了一定困难。随着基因工程技术迅猛发展和谷氨酸棒杆菌表达系统不断完善，在谷氨酸棒杆菌中高效表达大肠杆菌L-赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-尸胺转运蛋白，有效控制赖氨酸合成的代谢过程，大量合成尸胺已成为可能。
发明内容
本发明在于克服现有技术的不足之处，提供一种产尸胺工程菌，通过构建产尸胺工程菌来发酵生产尸胺，将赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因导入到谷氨酸棒杆菌中进行共表达，赖氨酸脱羧酶将赖氨酸转化为尸胺，赖氨酸-尸胺反向转运蛋白CadB将细胞外的赖氨酸转运至细胞内，为尸胺提供合成底物，同时将合成的尸胺转运至细胞外。本发明实现目的的技术手段如下—种产尸胺工程菌，所述工程菌具有赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因。而且，所述工程菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌。而且，所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因对所述工程菌是异源的。而且，所述赖氨酸脱羧酶基因来源于蜂房哈夫尼菌、大肠杆菌。而且，所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因来源于大肠杆菌。而且，所述赖氨酸脱羧酶基因大小为2220bp，其序列为序列1 ；所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因为133^p，其序列为序列4。而且，所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以单顺反子的形式共表达，或者赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以多顺反子的形式共表达。而且，所述共表达的赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因可以同时整合到宿主细胞的基因组中，或者同时存在于宿主细胞内的共表达载体上，或者一个基因整合到宿主细胞的基因组中，另一个基因存在于宿主细胞内的表达载体上。本发明的优点和积极效果1、本发明将赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因转入能够大量合成赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中，构建工程菌株，实现赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白cadB基因的高效表达，进而达到尸胺的过量合成，为微生物发酵法批量生产尸胺提供了有效途径，为新型材料聚酰胺的生产提供了原料，有效遏制全球变暖。2、本发明合成尸胺的方法简单、经济、环保、高效，符合当前化学产品进行生物合成的发展趋势，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有巨大的经济效益和实惠效益， 市场开发前景广阔。
图Ia为本发明的扩增电泳图，其中1、PCR获得的赖氨酸脱羧酶基因；Μ、11Λ DNA Marker ；图Ib 为重组质粒 pXMJ19_ldc 的酶切验证图，其中1、pXMJ19_ldc/Hind III ；2、 pXMJ19-ldc/Xba I ；3、pXMJ19_ldc/Hind III/Xba I ；MUkb DNA Marker ；图加为本发明的扩增电泳图，其中123、PCR获得的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因；MUkb DNA Marker ；图2b 为重组质粒 pXMJ19_cadB 的酶切验证图，其中12、pXMJ19-cadB/HindIII/BamHI ；34、pXMJ19_cadB/PCR ；MUkb DNA Marker ；图2c为重组质粒pXMJ19-terminators的酶切验证图，其中12、 pXMJ19-terminators/Xba I /BamHI ；34> pXMJ19-terminators/PCR ；MUkb DNA Marker ；图2d为重组质粒pXTTB的酶切验证图，其中12、pXTTB/BamH I /Sma I ；34, pXTTB/PCR ；MUkb DNA Marker ；图加为重组质粒pXLB的酶切验证图，其中12、pXLB/Xba I /Sma I ；MUkb DNA Marker ；
4
图3为本发明重组表达质粒pXMJ19-ldc的构建流程图； 图4为本发明重组表达质粒pXLB的构建流程图； 图5为本发明HPLC测定尸胺标准曲线；
图6a为本发明C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19_ldc发酵液上清液相图； 图乩为本发明C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19_ldc发酵液液相图； 图6c为本发明C. glutamicum ATCCl3032/pXLB发酵液上清液相图； 图6d为本发明C. glutamicum ATCCl3032/pXLB发酵液液相图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种尸胺工程菌，宿主菌为谷氨酸棒杆菌(包括但不限于谷氨酸棒杆菌 ATCC1303》，具有赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因。所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因对所述工程菌是异源的。所述赖氨酸脱羧酶基因来源于蜂房哈夫尼菌。所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因来源于大肠杆菌。所述赖氨酸脱羧酶基因大小为2220bp，其序列为序列1 ；所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因为 133^p，其序列为序列4。其中，赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因在谷氨酸棒杆菌中共表达。共表达的赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因可以同时整合到宿主细胞的基因组中，也可以同时存在于宿主细胞内的共表达载体上，或者一个基因整合到宿主细胞的基因组中，另一个基因存在于宿主细胞内的表达载体上。赖氨酸脱羧酶基因、赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因分别连接到谷氨酸棒杆菌的表达载体上，以单顺反子形式表达；或者赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因同时连接到谷氨酸棒杆菌的表达载体上，以双顺反子的形式表达。表达载体PXMJ19上同时连接有来自于蜂房哈夫尼菌或大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因或者其他来源的赖氨酸脱羧酶基因和来自于大肠杆菌的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因。本发明利用基因工程技术，将赖氨酸脱羧酶基因(L-lysine decarboxylase gene, cadA/LDC)禾口赖氛酸一尸胺反向转运蛋白基因(cadaverine-lysine antiporter gene，cadB)分别或同时克隆至谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中并诱导共表达，具体构建方法如下一、pXMJ19_ldc 的构建首先，使用PCR引物IdcF(序列2)/ldcR(序列3)和蜂房哈夫尼菌的染色体DNA 作为模板来扩增Idc基因，纯化扩增的目的片段，将纯化的片段与pGEM _T Easy vector连接，构建重组质粒pGEM -T-ldc。对双酶切结果正确的重组质粒的目的基因通过测序进行证实。然后，质粒pGEM -T-Idc通过限制性内切酶Hind III、)(ba I双切后，将目的基因 Idc定向连接以用相同限制性内切酶作用的PXMJ19载体，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli JMllO感受态中，在含有Cm的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和Xba I双位点单、双酶切鉴定，测序，命名为pXMJ19-ldc。所用的引物IdcF CCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGAATATCATTGCCATCATGAACG(Hind III)IdcR CGTCTAGATTATGACTTCTTCGCCGCTGAT (Xba I )用于扩增目的基因Idc的PCR条件
5
扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；二、pXLB载体的构建l、cadB基因的克隆首先，使用PCR引物cadBF (序列5)/cadBR(序列6)和大肠杆菌的染色体DNA作为模板来扩增cadB基因(序列4)。纯化扩增的目的片段，与pMDIS-T vector连接，构建重组质粒pMD18-T-cadB。对双酶切结果正确的重组质粒的目的基因通过测序进行证实。然后，重组质粒pMD18-T-cadB通过限制性内切酶Hind III、BamH I双切后，将目的基因cadB连接以用相同限制性内切酶作用的PXMJ19载体，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli JMllO感受态中，在含有Cm的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用Hind III和BamH I双酶切鉴定和PCR验证，测序，命名为pXMJ19-cadB。
所用的引物
cadBF CCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGAGTTCTGCCAAGAAGATCGG(Hind III) cadBR :CGGGATCCCTCATTAATGTGCGTTAGACGCGGTG(BamH I ) 用于扩增目的基因cadB的PCR条件
94 0C5min
94 °CImin 、
55°CImin >- 30 cycles
72 °CImin 乂
72 °CIOmin扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L，dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；2、Terminators 基因的克隆使用PCR引物I^erminatorsF/terminatorsR和质粒pXMJ19作为模板来扩增 Terminators基因。纯化扩增的目的片段，双切后，将其连接以用相同限制性内切酶)(ba I、BamH I作用的pXMJ19载体，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli JM110感受态中，在含有Cm的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用限制性内切酶 Xba I , BamH I双酶切鉴定和PCR验证，测序，命名为pXMJ19-Terminators。所用的引物TerminatorsF CGTCTAGAGGCTGTTTTGGCGGATGA(Xba I)TerminatorsR GGGGATCCAGCGGATACATATTTGAATGTA(BamH I )用于扩增目的基因^Terminators的PCR条件
6
94 0C5min
94 °C 40s 、
52°C 35s U 30 cycles
72 °CImin
72 °CIOmin扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L，dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；3、Tac-cadB 基因的克隆使用PCR引物Tac-cadBF/Tac-cadBR和质粒pXMJ19_cadB作为模板来扩增 Tac-cadB基因。纯化扩增的目的片段，双切后，将其连接以用相同限制性内切酶BamH
I、Sma I作用的pXMJ19-Terminators载体，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli JMllO感受态中，在含有Cm的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用限制性内切酶BamH I ,Sma I双酶切鉴定和PCR验证，测序，命名为pXTTB。所用的引物Tac-cadBF :GGGGATCCTGAGCTGTTGACAATTAATCATCGG (BamH I)Tac-cadBR CCCCGGGTTAATGTGCGTTAGACGCGG (Sma I )用于扩增目的基因I1ac-CadB的PCR条件
94 0C5min
94 °C 45s 、
58°C 45s —30 cycles
72 °Clmin30s-
72 °CIOmin扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, La TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；4、pXLB载体的构建选择限制性内切酶)(ba I和Sma I对重组质粒pXTTB进行双切，切胶回收大小约为1.81Λ的目的片段，双切后，将其连接以用相同限制性内切酶)(ba I、Sma I作用的 pXMJ19-ldc载体，将连接产物应用化学转化法转化到E. coli JMl 10感受态中，在含有Cm的 LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用限制性内切酶)(ba KSma I双酶切鉴定，命名为PXLB。这是以单顺反子形式表达的实例，也可以将Idc基因和CadB基因之间插入适合SD 序列和顺反子间隔区，构建成双顺反子表达载体，实现两个基因的共表达。三、构建尸胺生产菌株谷氨酸棒杆菌的感受态细胞参照van der Rest等在文献A heat shock following electroporation induces highly effcient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA 中描述的方法(Appl Microbiol Biotechnol (1999) 52 :541-545)进行制备。
重组质粒pXMJ19-ldc、质粒pXLB通过电穿孔法被引入，具体步骤如下1)将感受态细胞从冰箱中取出置于冰上融化。2)力Π 1 μ g质粒DNA至80uL感受态细胞中混勻。3)将混合液转移至预冷的0. Imm电转杯中，于1. 8kV，5ms条件下电击细胞。4)电击后立即加入ImL SOC培养基，混勻，转入1. 5ml管后于46°C水浴热击6min， 然后于30°C水浴Ih。5)取100-300 μ L菌液涂布到含10 μ g/ml的Cm抗性平板上30°C倒置培养36h0获得具有赖氨酸脱羧酶(质粒pXMJ19-ldc)和同时含有赖氨酸脱羧酶、赖氨酸-尸胺反向转运蛋白(质粒pXLB)的两个菌株。四、使用工程菌摇瓶生产尸胺1、对工程菌采用摇瓶培养来检测尸胺的产量。该重组谷氨酸棒杆菌在含有氯霉素的培养基中于30°C条件下培养。(1)种子培养从含有氯霉素的LBG平板上挑取单菌落接种至液体种子培养基 (终浓度为10 μ g/ml氯霉素的LBG)，30°C，200rpm培养过夜。种子培养基为含0. 5%葡萄糖的LB培养基。(2)摇瓶培养按2%的接种量将种子培养液转接至IOOml摇瓶培养基中(终浓度为 10 μ g/ml 氯霉素的 LBG)，30°C，200rpm 培养。摇瓶培养基葡萄糖5%，(NH4)2SO4 3%，酵母粉 0. 5%,K2HPO4 2. 5g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 75g/L, CaCl2 · 2H20 50mg/L, FeSO4 · 7H20 50mg/L。(3)由于载体为IPTG诱导性表达质粒，重组菌在摇瓶培养至OD6tltl约为1时，加入终浓度为ImM的IPTG，继续培养36h，诱导重组质粒表达。2、尸胺的定量测定由于尸胺无紫外吸收，又无荧光和电化学活性，检测困难，必须衍生后才能检测， 选用苯甲酰氯作为衍生剂对尸胺进行柱前衍生，使用Agilent 1100HPLC测定尸胺含量。分别测定两种工程菌胞外和发酵液中的尸胺含量。(1)样品预处理各取50ml的菌液，12000rpm离心，留取上清液备用。菌体使用PBS缓冲液洗涤两次，用5ml PBS缓冲液重悬，同时各取5ml菌液，分别加入适量溶菌酶于37°C放置1. 5h，然后超声破碎15min。(2)样品的衍生和萃取移取2mL样品置于IOmL具塞刻度试管中，加入ImL氢氧化钠溶液，20 μ L苯甲酰氯，在液体混勻器上涡旋30s，置于37°C水浴中振荡，反应时间20min，反应期间每隔5min涡旋 30s。衍生反应完毕后，加入Ig氯化钠，2mL乙醚，振荡混勻，涡旋30s，静置。待溶液分层后，用滴管将乙醚层完全移取至IOmL具塞刻度试管中，用氮气或吸耳球缓缓吹干乙醚， 加LOOmL甲醇溶解，再用一次性过滤器过滤后，作为高效液相色谱分析用试样。(3)不同浓度尸胺标准工作溶液的衍生和萃取准确称取1. 7140g 盐酸尸胺(C5H14N2 ·2Η(Π，纯度> 99% )准至 0. OOOlg，于 IOOmL 容量瓶中，用水溶解完全后，稀释至刻度，混勻得到10. Omg/mL尸胺标准储备液，于4°C保存，有效期为3个月。移取2. OOmL不同浓度的标准工作溶液分别置于5个IOmL具塞刻度试管中，加入 ImL氢氧化钠溶液20 μ L苯甲酞氯，在液体混勻器上涡旋30s充分混勻。萃取步骤同上。(4)色谱条件①色谱柱，Cw色谱柱，5 μ m，4. 6 X 250mm，或性能相当者；②柱温，室温；③流动相，A(乙睛)；B(0. 02mol/L乙酸铵)。梯度洗脱条件见表1 ；④检测波长，2Mnm;⑤进样量20 μ L。表1梯度洗脱条件
权利要求
1.一种产尸胺工程菌，其特征在于所述工程菌具有赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的产尸胺工程菌，其特征在于所述工程菌宿主菌为谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求1所述的产尸胺工程菌，其特征在于所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因对所述工程菌是异源的。
4.根据权利要求1或2所述的产尸胺工程菌，其特征在于所述赖氨酸脱羧酶基因来源于蜂房哈夫尼菌、大肠杆菌。
5.根据权利要求1或2所述的产尸胺工程菌，其特征在于所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因来源于大肠杆菌。
6.根据权利要求1或2所述的产尸胺工程菌，其特征在于所述赖氨酸脱羧酶基因大小为2220bp，其序列为序列1 ；所述赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因为133^p，其序列为序列4。
7.根据权利要求1所述的产尸胺的基因工程菌，其特征在于所述赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以单顺反子的形式共表达，或者赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因以多顺反子的形式共表达。
8.根据权利要求7所述的产尸胺的基因工程菌，其特征在于所述共表达的赖氨酸脱羧酶基因和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因可以同时整合到宿主细胞的基因组中，或者同时存在于宿主细胞内的共表达载体上，或者一个基因整合到宿主细胞的基因组中，另一个基因存在于宿主细胞内的表达载体上。
全文摘要
本发明涉及一种产尸胺工程菌及其构建方法及利用该菌生产尸胺的方法，利用基因工程技术，将赖氨酸脱羧酶基因(L-lysine decarboxylase gene，cadA/LDC)和赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因(cadaverine-lysine antiporter gene，cadB)分别或同时克隆至谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中并诱导共表达，CadA酶催化赖氨酸脱羧生成尸胺，CadB蛋白将尸胺转运到细胞外，从而构建一株高产尸胺工程菌株，建立由谷氨酸棒杆菌发酵一步合成尸胺的新方法。这种由微生物发酵一步合成尸胺的方法，为规模生产尸胺提供了新途径，具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。
文档编号C12N1/21GK102424811SQ201110425049
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者刘萌, 王春霞, 路福平, 黄云雁, 黎明 申请人:天津科技大学