一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、制备方法及用途的制作方法
一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、制备方法
及用途发明所属领域本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种含有肝炎病毒稳定复制的细胞、制备该细胞系的方法和该细胞用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范围内的一个重要公共卫生问题。据世界卫生组织报道，截至2008年止，全世界有超过20亿人感染过乙肝病毒，其中也有超过3. 5亿人口转变成为慢性携带者，每年死于由乙肝引起的肝纤维化以及原发性肝癌的人数差不多累积到60万。我国是乙型肝炎高发区。按照1992年全国乙型肝炎血清流行病学调查结果普通人群HBV感染阳性率为10%推算，我国现有慢性无症状的乙型肝炎病毒携带者超过1亿，每年数十万名患者死于肝硬化、肝癌等乙肝相关疾病。目前乙肝的发病机制尚不十分清楚。近年来乙肝病毒基因型与肝炎发生发展的关系日益引起学者的重视，是国内外研究的热点问题。乙肝病毒基因型分布有明显的地理区域性，而且差异较大，乙型肝炎病毒感染后的临床表现及致病进程除了与宿主免疫状态、感染时机等有密切关系之外，还可能与感染HBV的基因型关系密切。此外，随着抗病毒药物的广泛使用和临床研究的大量开展，越来越多的证据表明药物的抗病毒效果与HBV基因型差异的有关系。防治乙型肝炎需要对HBV有更为深入的基础研究，研究者通常把可自主复制的 HBV基因组瞬时转入到肝癌细胞系中，以研究HBV的复制和致病机理。瞬时转染的基因组游离于细胞中，并不整合到染色体上，一般在1-4天后就收获细胞分析样本。瞬时转染HBV 基因组与HBV本身整合到染色体中的持续性有根本性差别，因此含有HBV稳定复制的细胞系对于研究更具有实际意义，结果也更为准确和可靠。现在全世界范围内用于乙肝研究的细胞模型主要是基于分离的一个D型乙肝病毒基因组所构建H印G2. 2. 15 (Sells MA, Chen ML,Acs G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987 ;84 :1005—1009)。 H印G2. 2. 15所含有的HBV的D型基因型在全球范围内流行，尤其为非洲北部、地中海地区、 中东和印度的优势基因型。在我国，B和C基因型的HBV占了绝大部分，而D基因型在我国分布很少，这就使得H印G2. 2. 15细胞在我国的HBV基础研究中有很大的局限性。更重要的是，HepG2. 2. 15细胞生长较慢，分泌到细胞上清中E抗原和S抗原很低，无法确保结果的有效区分性和准确性。在我国乙肝病毒的防治中，缺少我国特有的乙肝病毒的细胞研究模型， 使得探索新的抗病毒药物无准确靶标，无法扭转目前中国的乙肝感染高发病率和高病死率现状。发明技术内容本发明的一个目的是提供一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞，该细胞含有中国特有的乙肝病毒基因，可大量分泌E抗原和S抗原，使研究抗中国乙肝病人药物有准确靶标。本发明的另一个目的是提供一种制备该细胞系的方法。本发明还提供了一种该细胞在抗乙肝病毒药物筛选上的用途。本发明公开了一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞，其特征在于，该细胞含有人工转入的中国人的乙型肝炎病毒基因，且乙型肝炎病毒基因具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，该细胞是人肝细胞Huh7. 37细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC C201185。Huh7. 37细胞是将HBV基因转入Huh7细胞系，并经G418压力筛选培养而获得一株稳定的细胞系。该细胞系能在普通DMEM培养基中稳定生长，长期培养过程中可检测到乙肝基因组DNA复制，并能持续稳定地表达S抗原和E抗原分泌至细胞培养液中。本发明的公开了制备Huh7. 37细胞系的方法。该方法步骤如下1)HBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到 HBV全基因组；2) HBV侵染性克隆的构建运用重叠延伸PCR技术构建HBV1. 3倍体，然后将HBV1. 3倍体插入到已含有NEO基因的pBlueScrip II KS (+)载体上，构建成 pBlue-HBVl. 3-NE0 侵染性克隆；3)转染与筛选转染质粒pBlue-HBVl. 3-NE0到Huh7细胞系，G418压力筛选出稳定复制HBV的细胞系。本发明还公开了优选的，有效制备含有HBV稳定复制的细胞系的方法，该方法包括如下步骤1)HBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到 HBV全基因组。2)HBV侵染性克隆的构建将整个HBV 1. 3倍体分成了四段序列构建，分别是片段 1，1050-1822 ；片段 2，1823-3215 ；、片段 3，1-1822 和片段 4，1823-1990 ；采用重叠延伸 PCR (SOE PCR)技术分三轮完成HBV1.3倍体构建；在第一轮PCR中，得到以上四个不同的片段；然后，经过重叠延伸将1、2片段和3、4片段分别拼接起来，得到片段A和片段B ；在第三轮PCR中，让片段A、B搭桥延伸出整个HBV的1. 3倍体；将G418抗性基因NEO连接在载体 pBluescript II KS (+)中得到 pBlue-NEO，通过酶切将 HBV1. 3 倍体连接在 pBlue_NE0 上， 得到侵染性克隆pBlue-HBVl. 3-NE0。3)转染与筛选采用脂质体转染方法转染含抗性基因的侵染性克隆 pBlue-HBVl. 3-NE0,再通过ELISA检测上清中的蛋白标志物E抗原和S抗原的表达情况， 确定转染阳性细胞；消化所有细胞，然后平均分配到多个细胞平板中，保证每个孔中细胞的覆盖率为30% ；加入含G418选择培养基，3-5天换一次液，15天后，剩下的细胞形成一些白色的集落，经消化后将细胞集落挑至96孔板中，细胞长满后检测相关蛋白的表达，通过有限稀释方法得到高表达蛋白及HBVDNA的细胞系，最终建成稳定复制B型HBV基因组的 Huh7. 37细胞系。该细胞命名为“Huh7. 37细胞”，含有人工转入的中国人的乙型肝炎病毒基因，且乙型肝炎病毒基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，该细胞是人肝细胞Huh7. 37细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201185，保藏日期是2011年8月20日。
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本发明还公开了 Huh 7. 37细胞在抗乙肝病毒药物筛选中的应用。本发明中的质粒载体pBlueScrip II KS (+)可通过市售商业生物公司获得，如 Thremo Fisher Scientific inc.等公司，Huh7，HepG2, HepG2. 2. 15 细胞可通过市售商业生物公司或菌种保藏机构获得，如中国典型培养物保藏中心保藏有该细胞，研究者可向该中心索取。在本发明中，申请人公开了筛选特异性的抗乙肝药物方法，该方法包括下列步骤1)细胞准备用常规方法培养Huh7. 37细胞，维持细胞良好的生长状态，铺96孔细胞板，至于含5% C02、37度的细胞培养箱培养，直到细胞生长至覆盖率大于90% ；2)待筛选药物的处理准备好待筛选的药物溶液，并设置好相应的阴性与阳性对照，每组实验做3个复孔；3)收集上清用药物处理适量的时间后，收集每个孔内的细胞培养上清保存；4)检测E和S抗原采用酶联免疫吸附实验测定上述细胞培养液上清中HBV蛋白水平E和S抗原表达变化；5)检测HBV的DNA 应用实时荧光定量PCR技术检测上清中HBV的DNA水平变化；6)结果分析根据5和6步骤的数据从HBV分泌到细胞培养上清的蛋白和DNA水平，分析药物抗乙肝病毒的功效。本发明的优点于现有技术相比，本发明有如下优点1)本发明提供的Huh7. 37细胞能够在含10%胎牛血清的DMEM培养基中稳定生长，并能持续稳定地表达分泌E抗原和S抗原。相对于H印G2. 2. 15细胞而言，Huh7. 37细胞具有更快的生长速度，更方便培养和使用；而且，Huh7. 37细胞分泌至细胞培养上清中的E 抗原和S抗原比H印G2. 2. 15细胞大幅提高，特别是S抗原达到了 2倍以上，反映了 Huh7. 37 细胞系中HBV更高的复制和翻译水平。在抗HBV药物筛选中，应用Huh7. 37能缩短筛选周期和提高实验数据的区分度及结果的准确性。2)本发明提供的Huh7. 37细胞中所含有的HBV病毒基因组是从中国乙肝病人血清中分离的，属于在我国流行较广的B基因型。Huh7. 37细胞的构建更加符合我国的迫切需要。将Huh7. 37细胞用于抗乙肝病毒药物的筛选更加具有针对性，能为我国的的乙肝病毒的临床研究和医学防治提供更加切实可行的研究平台。


图 1 是载体 pBlueScript II KS 示意2是侵染性克隆pBlue-HBVl. 3-NE0构建过程示意3是HBV全基因组PCR图谱。M为DNA分子Marker，泳道1-7为7个不同的样
P BFI图4是SOE PCR第一轮电泳图M 为 DNA 分子 Marker，片段 1 为 773bp，1050nt-1822nt ；片段 2 为 1393bp， 1823nt-3215nt ；片段 4 为 168bp, 1823nt_1990nt ；片段 3 为 1822bp, lnt-1822nt)图5是SOE PCR第二轮电泳图M为DNA分子Marker，由片段1和片段2扩增出片段A ；由片段3和片段4扩增出片段B图6是SOE PCR第三轮电泳图M为DNA分子Marker，片段A和片段B扩增出HBV的1. 3倍体图7是HBV1. 3倍体示意8是侵染性克隆pBlue-HBVl. 3-NE0酶切鉴定图M为DNA分子Marker，1、2泳道均为阳性克隆的酶切图谱图9是Huh7. 37细胞常规培养1_6月细胞上清E、S抗原和HBVDNA动态变化图10是稳定培养的Huh7. 37细胞培养液中E抗原分泌水平检测图11是稳定培养的Huh7. 37细胞培养液中S抗原分泌水平检测图12是Huh7. 37细胞内钙网蛋白(CRT)的mRNA相对水平检测(*代表具有显著性差异)图13是H印G2. 2. 15细胞内钙网蛋白(CRT)的mRNA相对水平检测(*代表具有显著性差异)。
具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例1建立稳定转染HBV基因组的Huh7. 37细胞系根据图1和图2所示，构建步骤如下1. 1病毒DNA的提取采用天泽基因工程有限公司生产的病毒DNAout试剂破碎病毒，释放病毒DNA。(1)在1. 5mL螺旋盖塑料离心管加入480 μ 1病毒DNAout溶液。(2)加入160 μ 1血清样品，彻底振荡30s混勻后室温放置IOmin。(3)再振荡30s混勻，加入560 μ 1异丙醇，振荡30s，15000g室温离心15min，带管盖柄的方向一致向外。(4)先用ImL移液枪遗弃上清，分两次吸取(注意不要触及沉淀或者让吸起的液体污染枪)，留少量液体，再短暂离心lmin，用100-200 μ 1移液枪小心地弃所有残留液体，此步作用尽量去除液体中杂蛋白。(5)加入800 μ 1 70%的乙醇，轻柔颠倒混合3次，不要摇散底部沉淀，然后15000g 室温离心5min，按照4的方法分两次遗弃上清，此步作用在于去除残留异丙醇和盐分。(6)开盖8min，使残留的乙醇蒸发，从而让DNA更易于溶解于水，此时加入 80 μ LTris缓冲液，等待2-aiiin，使沉淀变得松散，用移液枪吹打管壁和管底的膜状沉淀， 使其溶解。(7) 15000g离心Imin后取适量用于PCR，其余-20摄氏度保存。1. 2HBV全长基因组的扩增参考文献报道引物序列进行HBV扩增(S Gunther, B C Li, S Miska, D H Kriiger, H Meisel and H Will. A novel method for efficient amplification of whole hepatitis B virus genomes permits rapid functional analysis and reveals deletion mutants in immunosuppressed patients. J. Virol. 1995,69(9) :5437.)。
正链引物Fl :5，-CCGGA AAGCTT GAGCTC TTCTTT TTCACC TCTGCC TAATCA-3，(SEQ ID NO 2)负链引物Rl :5，-CCGGA AAGCTT GAGCTC TTCAAA AAGTTG CATGGT GCT GG-3，(SEQ ID NO 3)以上述特异性引物及提取的HBV基因组模板，用高保真的DNA聚合酶扩增HBV全基因组。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物(图3)，酶切回收经过测序得知大小为32Kbp，通过在NCBI中BLAST序列比对得知它是属于HBV基因组，且与与B型的HBV基因组相似度最高，达到了 92%，故确定其基因型为B型；1. 3HBV1. 3倍体的构建将整个HBV 1. 3倍体分成了四段序列，分别是 1050-1822 (片段 1)、1823-3215 (片段 2)、1-1822 (片段 3)和 1823-1990 (片段 4)。我们采用SOE PCR技术构建HBV1. 3倍体。在第一轮PCR中(图4)，我们主要是得到以上四个不同的片段；然后经过重叠延伸将1、2片段和3、4片段分别拼接起来，得到片段A和片段B (图 5)；最后在第三轮PCR中，我们就可以让片段A、B搭桥延伸出整个HBV的1.3倍体(图6)。 HBV1. 3倍体示意图如图7所示。同时我们也引入了 EcoRI和Ml I的酶切位点，准备将 HBV1. 3倍体连接入载体pBluescript II KS⑴。1.4侵染性克隆的构建由于酶切位点的重复，因此需要先将G418抗性基因NEO 通过XhoI和KpnI连接在载体pBluescript II KS (+)中得到pBlue_NE0，然后再通过EcoR I和Ml I的双酶切将HBV1. 3倍体连接在pBlue-NEO载体中，得到了 pBlue-HBVl. 3-NE0质粒克隆，也就是HBV侵染性克隆(图7)，我们用Kpn I和)(h0 I进行双酶切鉴定，挑选出正确的克隆，并进行测序确认序列正确(图8)。1. 5转染与筛选将复苏后传代3次的Huh7细胞以胰蛋白酶消化，用含10% (体积/体积)胎牛血清的DMEM培养基调成5X IO5个/mL的密度，接种于若干个直径为35mm 的培养皿中，于无菌环境中37°C、5% CO2条件下培养M小时，待细胞融合至90%时，按照 Lipofectamine 2000操作说明书进行细胞转染操作，6小时后更换有血清、无双抗的DMEM 培养基继续培养。转染2天后，开始用30(^8/!^浓度的6418压力筛选，直至绝大部分细胞死亡，这个过程大约要2周左右。将获得细胞采用极限稀释法传至96孔细胞培养板，交替使用常规培养基和G418(300yg/mL)培养基培养单个细胞，至其长出单个克隆。挑选出最优的细胞克隆继续培养，并不断扩繁，最终建成稳定转染HBV基因组的Huh7. 37细胞系。 按照一般细胞系建细胞库的方法，将培养好的含HBV稳定复制基因的细胞逐级冻存建立转基因细胞库以备用。该细胞命名为“Huh7. 37细胞”，已于2011年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201185。1. 6Huh7. 37细胞表达E、S抗原和上清DNA的检测采用含有10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基进行培养，持续6个月时间，细胞能够稳定快速生长，分时间段采集细胞培养上清，分别采用酶联免疫吸附实验和荧光定量PCR实验检测上清中的E、S抗原和HBV 的DNA，结果表明Huh7. 37细胞能持续稳定的表达E、S抗原和分泌HBV至细胞培养上清(图 9)，显示HBV能稳定存在于所购建的细胞系之中。实施例2Huh7. 37细胞的培养、冻存与复苏与正常的Huh7细胞培养方法一致，可以购买DMEM培养基，或自行配备常规的DMEM 培养基。在DMEM培养基中加入10 %的胎牛血清和1 %的青霉素-链霉素双抗并混勻，即可用于培养Huh7. 37细胞。细胞传代时先用吸除培养基，用灭菌后的PBS洗去残余的培养基，加入适量的胰酶，放入37度细胞培养箱消化5分钟。待细胞疏松脱壁后，可直接加入上述含有血清和双抗的DMEM培养基终止消化，并吹散成单个细胞，传代至新的细胞瓶扩大培养。细胞生长至90%丰度即可进一步的传代。较H印G2. 2. 15细胞而言，Huh7. 37细胞具有更快的生长速率，平均每天可按1 2传代，在细胞扩大培养用于药物筛选应用中具有良好的优势。Huh7. 37细胞可以用含有10% (体积/体积)的DMSO的胎牛血清冻存。消化细胞后用培养基终止消化，2000rpm离心5分钟，吸除离心管中上清，加入含10%的DMSO的胎牛血清并吹散，吸至细胞冻存管。逐级降温，然后至于-80摄氏度冰箱6小时或过夜，最后冻存于液氮罐，可长期稳定保存。复苏Huh 7. 37细胞时，从液氮罐中取出一支Huh7. 37细胞至于37摄氏度水浴，不断轻摇是管内冻存细胞均勻受热复苏至完全溶解，最后将细胞冻存液加入至含有10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基，6小时后细胞贴壁，更换新鲜的 DMEM培养基进行培养，生长至一定数量即可传代。实施例3Huh7. 37细胞培养液中E抗原和S抗原分泌水平检测以目前被广泛使用的稳定转染HBV的细胞系H印G2. 2. 15为参考，检测我们所构建的Huh7. 37细胞系的E抗原和S抗原的分泌水平。采用ELISA检测方法，购买上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒E抗原和S抗原医用检测试剂盒，具体步骤如下1细胞准备以同样的含10 %胎牛血清和1 %双抗的DMEM培养基分别培养 HepG2. 2. 15 细胞和 Huh7. 37 细胞。2铺板将H印G2. 2. 15细胞和Huh7. 37细胞用胰酶消化后，用适量的上述DMEM培养基中和消化作用，并吹散成单个细胞。然后，均以3X IO6个/mL的细胞密度分别铺6孔板各2mL细胞液。摇勻细胞平铺板底，至于细胞培养箱中培养。3收样稳定培养48小时后，收取孔内细胞培养液4度保存。4试剂盒检测E、S抗原分泌水平(1)每孔中加入待测样品(包括转染侵染性克隆、空载体以及阳性对照即 H印G2. 2. 15细胞上清)50 μ L，再设阴性对照一组；(2)每孔中加入酶结合物50 μ L(或1滴)，充分混勻后封板，置于37度孵育 30min ；(3)手工洗板弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5sec，甩干，重复5次后拍干；(4)每孔中加入显色剂A液、B液各50 μ L (或1滴)，充分混勻，封板，置于37度孵育15min ；(5)每孔中加入终止液50 μ L (或1滴)，混勻；(6)用酶标仪读数，取波长450nm(使用双波长的酶标仪比色时，参考波长为 630nm)，读取各孔OD值；5结果分析根据试剂盒列举的标准，阴性对照小于0. 01，阳性对照大于1，因此 Huh7. 37细胞分泌至细胞培养基中的E、S抗原结果为阳性(图10和图11)。相对于H印G2. 2. 15而言，Huh7. 37细胞在相同条件下分泌的E、S水平更高，具体地，Huh7. 37细胞在相同条件下分泌的E抗原为H印G2. 2. 15细胞的约1. 3倍，而S抗原的分泌水平更是达到了 2倍以上，表明了 Huh7. 37细胞系相对更高水平的HBV复制和翻译水平，具有更为广阔的应用前景。实施例4检测Huh7. 37细胞中钙网蛋白mRNA水平钙网蛋白(CRT，Calreticulin)是存在于内质网的一种多功能蛋白质，它具有分子伴侣、钙离子存储和信号调节等重要功能。在一些病理条件下，细胞内质网在应激情况下会造成内质网压力，形成大量错误折叠蛋白，有时钙网蛋白会被上调形成抗击病理条件的方式之一。HBV感染后利用细胞的蛋白翻译系统和复制系统，达到增值病毒颗粒的目的，期间有可能对宿主细胞内的钙网蛋白进行调节。我们采用荧光定量PCR的方法去检测 Huh7. 37细胞内的钙网蛋白mRNA相对于Huh7细胞的变化水平，并以H印G2. 2. 15细胞相对于H印G2细胞的变化水平作为阳性对照，以期获得相同的调节方式，从而验证Huh7. 37细胞的可靠性。分别培养Huh7细胞、Huh7. 37细胞、HepG2细胞和H印G2. 2. 15细胞，取等量的切106个细胞，用TRIzol (Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)裂解细胞，按照提供的标准流程分离提取高纯度的RNA，然后于随机引物体系中在37度条件下逆转录1小时得到4份 cDNA，用于荧光定量PCR检测钙网蛋白的mRNA水平，检测仪器为Light Cycler 480 (Roche， Indianapolis, IN)。结果显示，Huh7.37细胞中钙网蛋白水平相对于Huh7细胞而言有显著上升(图 12)，表明HBV对宿主的稳定感染会造成细胞内的钙网蛋白mRNA水平变化。同样地，作为阳性对照，IfepG2. 2. 15细胞中的钙网蛋白水平相对于H印G2细胞而言也有显著上升(图13)， 而且上调水平均为原来的2-2. 5倍。这在一个侧面说明了在HBV稳定感染的细胞模型中， Huh7. 37细胞具有与H印G2. 2. 15细胞相同的细胞生理学特征，具有较好的应用前景。GAPDH基因作为内参，引物序列如下CRT 正链引物5' -TACAATGCTGACTATGGCTAC-3‘ (SEQ ID NO 4)CRT 负链引物5' -ACTGATGCGTGAAGTGCTG-3‘ ； (SEQ ID NO 5)GAPDH 正链引物5' -AAGGCTGTGGGCAAGG-3 ‘ (SEQ ID NO 6)GAPDH 负链引物5' -TGGAGGAGTGGGTGTCG-3 ‘ . (SEQ ID NO 7)
权利要求
1.一种新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系，其特征在于，该细胞含有人工转入的中国人的乙型肝炎病毒基因，且乙型肝炎病毒基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，该细胞是人肝细胞Huh7. 37细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201185。
2.权利要求1所述细胞系的制备方法，其特征在于包括如下步骤DHBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到HBV全基因组；2)HBV侵染性克隆的构建运用重叠延伸PCR技术构建HBV1.3倍体，然后将HBV1. 3倍体插入到已含有NEO基因的pBlueScrip II KS (+)载体上，构建成pBlue_HBVl. 3-NE0侵染性克隆；3)转染与筛选转染质粒pBlue-HBVl.3-NE0到Huh7细胞系，G418压力筛选出稳定复制HBV的细胞系。
3.根据权利要求2中所述制备细胞系的方法，其特殊征是，该方法包括下列步骤 DHBV全基因组的克隆从中国乙肝病人血清中提取到HBV病毒DNA，并扩增到HBV全基因组；2)HBV侵染性克隆的构建将整个HBV 1.3倍体分成了四段序列构建，分别是片段1， 1050-1822 ；片段 2，1823-3215 ；、片段 3，1-1822 和片段 4，1823-1990 ；采用重叠延伸 PCR (SOE PCR)技术分三轮完成HBV1. 3倍体构建；在第一轮PCR中，得到以上四个不同的片段； 然后，经过重叠延伸将1、2片段和3、4片段分别拼接起来，得到片段A和片段B ；在第三轮 PCR中，让片段A、B搭桥延伸出整个HBV的1. 3倍体；将G418抗性基因NEO连接在载体 pBluescript II KS (+)中得到 pBlue-NEO，通过酶切将 HBV1. 3 倍体连接在 pBlue_NE0 上， 得到侵染性克隆pBlue-HBVl. 3-NE0 ；3)转染与筛选采用脂质体转染方法转染含抗性基因的侵染性克隆 pBlue-HBVl. 3-NE0,再通过ELISA检测上清中的蛋白标志物E抗原和S抗原的表达情况， 确定转染阳性细胞；消化所有细胞，然后平均分配到多个细胞平板中，保证每个孔中细胞的覆盖率为30% ；加入含G418选择培养基，3-5天换一次液，15天后，剩下的细胞形成一些白色的集落，经消化后将细胞集落挑至96孔板中，细胞长满后检测相关蛋白的表达，通过有限稀释方法得到高表达蛋白及HBV DNA的细胞系，最终建成稳定复制B型HBV基因组的 Huh7. 37细胞系。
4.权利要求1中所述的细胞系在抗乙肝病毒药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明提供了一个新的含有乙型肝炎病毒稳定复制的细胞系、该细胞系的制备方法以及用该细胞系在抗乙肝病毒药物筛选中的应用。本发明的细胞含有中国人特有的乙肝病毒基因，可大量分泌E抗原和S抗原，使研究抗中国乙肝病人药物有准确靶标。
文档编号C12N15/63GK102517255SQ201110423980
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者任文丹, 吴建国, 朱应, 赵凡鹏 申请人:武汉大学