专利名称：一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于筛选抗氧化剂或化学预防剂的细胞系。具体涉及一种高效的，快速的筛选抗氧化剂或化学预防剂的细胞系的建立方法及其应用。
背景技术：
有研究认为，氧化应激在风湿病、糖尿病、心血管疾病、癌症及其他多种慢性疾病的发生和发展及老化中扮演了举足轻重的角色。业已证实，氧化应激过程中活性氧簇(ROS)是主要的氧化剂，具有很强的氧化能力，同时也是引起各种损伤的主要网子，易产生连锁反应,且对蛋白质、核酸、脂质等均可产生损害作用，从而弓I起机体功能性的损伤。Nrf 2-ARE通
路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，其可调控表达抗氧化酶，如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等。对维持细胞氧化-抗氧化平衡，对氧化损伤和亲电子损伤细胞防御起重要的作用。研究证实接触和摄入环境中的各种化学致癌物，如苯并芘、黄曲霉素、有机氯磷农药以及亚硝胺化合物等，是发生各种癌症的主要原因。在癌变的早期，利用毒性较低的天然或合成化学物质，抑制前体化合物形成真正的致癌物，并阻止其与细胞内的大分子，如DNA、RNA或蛋白质发生接触和反应，直至将其完全排出体外，是预防、抑制或逆转癌症发生的重要策略。这个过程即所谓的“癌症化学预防(cancer chemoprevention) ”。诱导正常细胞产生各种抗氧化酶、金属结合蛋白、药物代谢酶、药物转动蛋白及分子伴侣是防止肿瘤发生的有效措施之一。最近发现，有些癌症预防物是通过诱导II相代谢相酶来清除体内的致癌物质或其它毒物，这种诱导作用是通过Nrf2-ARE信号通路。化学致癌物的体内生物转化依靠肝脏的I相和II相代谢相酶来完成。Nrf2是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，作为对化学预防剂的应答反应，作为对化学预防剂的应答反应，碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员转录因子Nrf2首先从胞质蛋白Keapl上解离，然后发生核内转位，与II相代谢酶基因上游的抗氧化反应元件(ARE)结合诱导II相代谢酶基因的表达，这是化学防癌的重要机制。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，细胞分子水平的药物筛选模型虽不能直接反映药物整体治疗效果，但具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等特点。从分子和细胞水平上对药物进行研究的方法更加省时高效，并且能对药物作用的机理进行较为确切和具有位点专一性的研究，加速对药物作用机理的微观研究。以往的体外抗氧化剂筛选方法，如采用Fenton法和邻苯三酚自氧化法测定样品对· 0H、02_ ·和H2O2的清除率，方法复杂，不能够快速高效、微量检测，并且无法明确样品的作用机制。建立稳定的用于筛选药物的细胞系，该细胞系的染色体已经整合了外源基因，并且细胞可以稳定表达该外源基因，使用方便，可高效快速的筛选药物，重复多次也十分稳定，并且药物作用机制明确。在200510118390. 3专利申请中，发明人提供的构建抗氧化药物筛选细胞模型的方法，该方法建立的细胞模型为重组质粒瞬时转染细胞建立，没有获得稳定的细胞系，在需要多样品，大量筛选时使用不便，不能做到省时即用。在201010293566. X专利申请中，发明人提供的化学预防药物筛选模型，构建方法复杂繁琐，所选择的报告基因GEP对细胞正常活动有一定的影响，例如GFP可以抑制由RING类E3介导的多聚泛素化作用，因此基于GFP的药物筛选可能会有一些预想不到的干扰因素。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可高效、简便、快速筛选抗氧化剂或化学预防剂的细胞系，该细胞系稳定，并高度敏感，能快速的对所筛选的样品进行定性评价其是否具有抗氧化性质或是有化学预防的作用，并可定量的评价其作用的效果。本发明提供一种重组质粒，含有抗氧化反应元件，荧光素酶基因和G418抗性基因。优选地，抗氧化反应元件为SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，荧光素酶基因为SEQID NO. 2所示的核苷酸序列和新霉素抗性基因为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
本发明还提供上述的重组质粒的构建方法，将所述抗氧化反应元件连接到PHTS-MCS载体上，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒 pARE-Luc-Neo。具体地，上述的构建方法，包括如下步骤
1)据pHTS-MCS载体多克隆酶切位点图谱，在抗氧化反应元件基因序列5'端和:T端分别设计Agl II和fel I酶切位点以便与pHTS-MCS载体连接；
2)设计用于阳性克隆PCR鉴定的引物
上游引物5、AGTCAAGTCAGATCTCGGCCGCAATAAAATATCTTT-3'，
下游引物5Λ -ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3'；
3)用DNA连接试剂，将所述抗氧化反应元件基因插入到pHTS-MCS载体的SglII和SalI酶切位点，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5ci，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒。本发明提供一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系，所述细胞系为整合有上述的重组质粒的细胞。优选地，所述细胞系为整合有上述重组质粒的Hek293细胞。上述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法将所述重组质粒转染的体外培养的受体细胞，经培养、筛选后，即得。具体地，上述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，包括如下步骤
O抗生素最佳筛选浓度的确定
将体外培养的受体细胞铺于多个培养板孔中，每孔加入G418使其终浓度分别为100μδ/πι^1000 gg/mL，培养7_15天后，检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度，确定筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度；
2)细胞系的构建
将所述重组质粒转染受体细胞，5%C02 , 37°C培养24h后，更换含有的G418的选择性培养基，G418在选择性培养基中的浓度为步骤I)所述的筛选浓度，5、天后，存活的细胞开始成簇生长，此时的细胞为已经整合了所述重组质粒的细胞，将存活下来的细胞进行单克隆化，开始进行阳性单克隆细胞筛选，将培养板中的孔内只有1-2个细胞的孔进行标记，时时观察生长情况，待这些细胞生长成簇后，扩大培养，冻存保种；
TBHQ刺激诱导将冻存保种的细胞铺于培养板的孔中，每孔加入含有TBHQ的培养基，对筛选得到的单克隆细胞刺激诱导，5%C02，37°C培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后，检测荧光素酶活性，选出一株对TBHQ诱导响应最高的阳性克隆细胞进行二次单克隆化操作；
将二次单克隆化得到的细胞再次进行TBHQ刺激诱导，筛选最高响应TBHQ诱导的一株单克隆细胞，即为抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系。优选地，步骤2)中所述含有 TBHQ的培养基中TBHQ的浓度为20Mmol/L。本发明还提供应用上述细胞系筛选抗氧化剂或化学预防剂的方法，包括如下步骤
将所述抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系铺入培养板的孔中，同时加入待筛选的药物，5%C02，37°C培养24h后，更换培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后，检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，说明该药物为抗氧化剂或化学预防剂。本发明能够达到以下效果
本发明使用的重组质粒为基于PHTS-MCS载体构建，该载体专用于快速建立稳定的、评价细胞信号通路的细胞系的载体。本发明选用荧光素酶作为报告基因灵敏性好，线性范围宽，在哺乳动物中内源性活性极小。随着检测试剂的不断改进更新，检测时可以直接在96孔板或48孔板内进行检测，检测时虽需要将细胞裂解，但无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到裂解液中的萤火虫荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的，非常适合高通量应用，并且检测试剂最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，可提供最优的测试灵敏度。本发明提供的细胞系，已将重组质粒载体pARE-Luc-Neo中的ARE基因，荧光素酶基因，新霉素抗性基因整合到了宿主细胞Hek293的基因组中，随着细胞的传代培养(10代以上)，对荧光素酶表达的检测依旧稳定，与瞬时转染的方法相比，更加方便，灵敏，可靠。本发明建立稳定的用于筛选抗氧化剂或化学预防剂的细胞系，为筛选抗氧化剂或化学预防剂提供了一种高效、快速、简便的方法，也为研究一些抗氧化剂或化学预防剂作用机制提供了方便。本发明提供的细胞系可应用于筛选具有抗氧化作用或化学预防作用的天然药物和人工合成的化合物的筛选，亦可用从天然药物中筛选具有抗氧化作用或化学预防作用的有效成分。
图I是pARE-Luc-Neo重组质粒双酶切、PCR鉴定。M DNA Ladder Mix; I :pARE-Luc_neo 重组质粒经 5^7 丨和兔1·/ II 双酶切；
2: ARE基因PCR扩增；3 =ARE基因PCR扩增阴性对照；
4 pARE-Luc-neo 重组质粒。图2是pARE-Luc-Neo重组质粒图谱。图3是抗生素最佳筛选浓度的确定结果。
图4是阳性单克隆细胞培养过程中细胞生长情况示意图。A :阳性单克隆细胞培养48h (40X10);
B:阳性单克隆细胞培养7d (20X10)。图5是细胞系Hek293_ARE的姜黄素验证结果。图6是细胞系Hek293_ARE的白藜芦醇验证结果。图7细胞系Hek293_ARE传代培养后其荧光素酶相对活性检测示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 实施例I :pARE-Luc-Neo重组质粒的构建
I)根据pHTS-MCS载体(购自Biomyx Technology公司，该载体带有突光素酶基因如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列和新霉素抗性基因如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列)多克隆酶切位点图谱，在抗氧化反应元件ARE基因序列(如SEQ ID NO. I所示)5'端和:T端分别设计了 Bgl II和fel I酶切位点以便与载体连接，ARE基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2)设计用于阳性克隆PCR鉴定的引物
上游引物5Λ -AGTCAAGTCAGATCTCGGCCGCAATAAAATATCTTT-3'
下游引物5Λ -ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3'
3)用Ligation high DNA连接试剂，将双链的ARE基因插入到pHTS-MCS载体的沒glII和5 I I酶切位点。将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，经过i gl II和fel I双酶切、PCR及基因测序鉴定阳性克隆，结果如图I所示，结果鉴定正确，可用于转染细胞，重组质粒载体命名为pARE-Luc-Neo。图谱结构如图2所示。实施例2 :建立稳定的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293_ARE I) 抗生素最佳筛选浓度的确定
将Hek293细胞铺于96孔板中，每孔约200个细胞左右，加入G418使其终浓度分别为100 Pg/mL-1000 Pg/mL，每个浓度设3个重复，并设有空白对照。培养7_15天后，用MTT法检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度。最佳筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度(即一个数量级)。筛选结果如图3所示，最佳筛选浓度为70(^g/mL。2)pARE-Luc-Neo 质粒瞬时转染 Hek293 细胞
大量制备 pARE-Luc-Neo 并纯化后，使用 FuGENE HD Transfection Reagent 试剂将pARE-Luc-Neo质粒转染Hek293细胞，5%C02，37°C培养24h后(DMEM培养基)，加入含有20Mmol/L的叔丁基对苯二酚(TBHQ)的培养基，刺激诱导24h后，萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，与对照I (未被pARE-Luc-Neo质粒转染的Hek293细胞)、对照2 (pARE-Luc-Neo质粒转染Hek293细胞，未经TBHQ刺激诱导)相比可检测到荧光素酶，鉴定pARE-Luc-Neo质粒具有筛选抗氧化剂或化学预防剂的作用。3)建立稳定的细胞系Hek293_ARE
将pARE-Luc-Neo质粒转染Hek293细胞，5%C02,37°C培养24h后(常规培养细胞的方法，HEK293细胞的培养基为DMEM培养基，血清浓度为10%)，更换含有70(^g/mL的G418选择性培养基(含有G418的DMEM培养基，血清浓度为10%，浓度是步骤一筛出的浓度)，一星期左右，细胞开始大量死亡，至对照孔细胞(未被pARE-Luc-Neo质粒转染的Hek293细胞)全部死亡后，实验组细胞已开始成簇生长，此时的细胞为已经整合了质粒的细胞。经过初筛后，使用96孔有限稀释法，将存活下来的细胞进行单克隆化，开始进行阳性单克隆细胞筛选，见图4为细胞的生长情况。将96孔中的孔内只有1-2个细胞的孔进行标记，时时观察生长情况，待这些细胞生长成簇后，依次转移到48孔培养板、24孔培养板、12孔培养板、6孔培养板中逐步扩大培养，直至15cm2培养瓶中，冻存保种。TBHQ刺激诱导将筛选得到细胞铺于白色96孔培养板中，每孔细胞O. 5 X IO4个，每孔加入含有20Mmol/L TBHQ的培养基(DMEM培养基，血清浓度10%)，对筛选得到的单克隆细胞刺激诱导，24h，5%C02, 37°C培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入100 μ L荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后,使用全波长扫描式多功能酶标仪Luminometric进行检测荧光素酶活性，重复检测三次，选出一株对TBHQ诱导响应最高的阳性克隆细胞进行二次单克隆化操作；
将二次单克隆化得到的细胞再次进行TBHQ刺激诱导，筛选最高响应TBHQ诱导的一株单克隆细胞，即为抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293-ARE。4)抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293_ARE的验证
使用已知的对Nrf2- ARE抗氧化通路有作用的姜黄素及白藜芦醇对细胞系进行验证，将Hek293-ARE细胞铺于白色96孔培养板中，每孔细胞O. 5 X IO4个，实验组同时加入不同浓度的姜黄素和白藜芦醇，每个浓度设5个平行孔，另设5个不加诱导剂的细胞孔为阴性对照。5%C02，37°C培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入100 μ L荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后,使用全波长扫描式多功全功能酶标仪Luminometric进行检测，结果见图5、图6，从图5和图6的结果可以看出，随着姜黄素和白藜芦醇浓度的增加，荧光素酶的相对活性也随之增加，二者有一定的剂量关系，说明抗氧化剂筛选细胞系Hek293-ARE建立成功。实施例3 :抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293_ARE稳定性验证实验
对实施例2制得抗氧化剂筛选细胞系Hek293-ARE进行传代培养，按照实施例2步骤3中TBHQ刺激诱导的方法，分别对传代培养至10代、15代和20代的Hek293_ARE细胞刺激诱导，并检测其荧光素酶相对活性，结果见图7 (图中阴性对照为未加TBHQ刺激诱导)，结果表明Hek293-ARE在传代培养10代、15代和20代后，荧光素酶的相对活性并未受影响，说明细胞系Hek293-ARE非常稳定。实施例4 :抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293_ARE的应用
将抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系Hek293-ARE铺入培养板的孔中，同时加入待筛选的药物，5%C02，37°C培养24h后，更换培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后，检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，说明该药物为抗氧化剂或化学预防剂。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
权利要求
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有抗氧化反应元件，荧光素酶基因和新霉素抗性基因。
2.根据权利要求I所述的重组质粒，其特征在于，所述抗氧化反应元件为SEQID NO. I所示的核苷酸序列，所述荧光素酶基因为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列和所述新霉素抗性基因为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.权利要求I或2所述的重组质粒的构建方法，将所述抗氧化反应元件连接到PHTS-MCS载体上，将连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒 pARE-Luc-Neo。
4.权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 1)据pHTS-MCS载体多克隆酶切位点图谱，在抗氧化反应元件基因序列5'端和:T端分别设计Agl II和fel I酶切位点以便与pHTS-MCS载体连接； 2)设计用于阳性克隆PCR鉴定的引物 上游引物5、AGTCAAGTCAGATCTCGGCCGCAATAAAATATCTTT-3'， 下游引物5Λ -ATACAATCTCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGAC-3'； 3)用DNA连接试剂，将所述抗氧化反应元件基因插入到pHTS-MCS载体的BglII和SalI酶切位点，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5ci，挑取单菌落扩增后，提取质粒DNA，即得重组质粒。
5.一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系，其特征在于，所述细胞系为整合有权利要求I或2所述的重组质粒的细胞。
6.根据权利要求5所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系，其特征在于，所述细胞为 Hek293。
7.权利要求5或6所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，将所述重组质粒转染的体外培养的受体细胞，经培养、筛选后，即得。
8.权利要求7所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 O抗生素最佳筛选浓度的确定 将体外培养的受体细胞铺于多个培养板孔中，每孔加入G418使其终浓度分别为100μδ/πι^1000 gg/mL，培养7_15天后，检测细胞活性，确定G418致细胞全部死亡的最低致死浓度，确定筛选浓度为在致细胞全部死亡的最低致死浓度基础上提高一个浓度梯度； 2)细胞系的构建 将所述重组质粒转染受体细胞，5%C02 , 37°C培养24h后，更换含有的G418的选择性培养基，G418在选择性培养基中的浓度为步骤I)所述的筛选浓度，5、天后，存活的细胞开始成簇生长，此时的细胞为已经整合了所述重组质粒的细胞，将存活下来的细胞进行单克隆化，开始进行阳性单克隆细胞筛选，将培养板中的孔内只有1-2个细胞的孔进行标记，时时观察生长情况，待这些细胞生长成簇后，扩大培养，冻存保种； TBHQ刺激诱导将冻存保种的细胞铺于培养板的孔中，每孔加入含有TBHQ的培养基，对筛选得到的单克隆细胞刺激诱导，5%C02，37°C培养24h后，每孔换新鲜的培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后，检测荧光素酶活性，选出一株对TBHQ诱导响应最高的阳性克隆细胞进行二次单克隆化操作；将二次单克隆化得到的细胞再次进行TBHQ刺激诱导，筛选最高响应TBHQ诱导的一株单克隆细胞，即为抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系。
9.根据权利要求8所述的抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述含有TBHQ的培养基中TBHQ的浓度为20Mmol/L。
10.应用权利要求5或6细胞系筛选抗氧化剂或化学预防剂的方法，其特征在于，包括如下步骤 将所述抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系铺入培养板的孔中，同时加入待筛选的药物，5%C02，37°C培养24h后，更换培养基，并加入荧光素酶检测试剂，室温下反应IOmin后，检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，说明该药物为抗氧化剂或化学预防剂。
全文摘要
本发明公开了一种重组质粒及其构建方法，所述重组质粒含有抗氧化反应元件，荧光素酶基因和新霉素抗性基因。本发明还公开了一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建方法，所述细胞系为整合有上述的重组质粒的细胞。本发明提供的细胞系，已将重组质粒载体pARE-Luc-Neo中的ARE基因，荧光素酶基因，新霉素抗性基因整合到了宿主细胞Hek293的基因组中，随着细胞的传代培养(10代以上)，对荧光素酶表达的检测依旧稳定，与瞬时转染的方法相比，更加方便，灵敏，可靠。
文档编号C12Q1/02GK102899351SQ201210276800
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者张耀洲, 刘阳 申请人:天津耀宇生物技术有限公司