专利名称：一种高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株及其应用，特别是一种在高产苯丙氨酸的重组大肠杆菌过量表达苯丙酮酸脱羧酶(KDC)及乙醇脱氢酶(ADHl)的大肠杆菌工程菌株，属于代谢工程领域。
背景技术：
β-苯乙醇(β-Phenylethanol),也称2_苯乙醇、β -苯基乙醇、苯乙醇,化学名称为β-苯基乙醇(2-pheny ethyl alcohol，简称PEA)，分子式为C8H100，分子量为122. 16。
β -苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，天然存在于很多花和植物的精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、水仙、百合等，其它含有天然苯乙醇的产品是一些生产中涉及发酵的食品，像茶叶、可乐、咖啡、面包、白酒、苹果酒、奶酪以及酱油等。玫瑰芳香气味颇受人们欢迎，使得苯乙醇在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分。苯乙醇具有玫瑰花的芳香气味，其高雅轻柔的香味深受人们的喜爱。这使得β_苯乙醇在食品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且具有协合及增效作用，是多种香型配方所需的组分。作为香料添加剂，其使用量仅次于香兰素，是第二大香料成分，可用于玫瑰、焦糖、蜂蜜及其它果香型食品香精及各种酒用香精和烟用香精的配制，它是玫瑰和其它植物风味中不可缺少的物质；对碱的稳定使得它能专门地用于肥皂香料中；少量的β_苯乙醇用作食品的香味成分，如软饮料、糖果、饼干等。以苯乙醇为原料生产的衍生物，如乙酸苯乙酯，也是具有很高香料价值的香料。苯乙醇也是医药上传统的抑菌剂。全球苯乙醇的年产量近万吨，除了很少一部分是从天然的玫瑰花或玫瑰精油中提取之外，基本上都是采用廉价的化工原料苯或苯乙烯通过化学合成方法生产。化学合成的苯乙醇市场价格约为3. 50美元/kg，而天然的β-苯乙醇价格却高达1，000美元/kg以上。天然β-苯乙醇的生产，现在有人估计年产量为数吨，从玫瑰或其它精油中提取价格昂贵，因此远远不能满足市场的需要。从上世纪末开始，随着人们对生活品质要求的提高和对健康的关注，消费者越来越注重食品、日用品等的安全性，更崇尚“绿色”和“天然”，食品、化妆品等生产也越来越倾向于使用天然的添加剂。近年来，随着食品行业中不良事件的发生和致癌等毒性物质的检出，各国对食品安全都更加重视和加强管理，各国商标法中对加工食品的某些限制性规定也日益明确。在美国和欧洲，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产。在商场或超市，经常会在食品包装的突出位置上看到“天然”、“含天然香料”、“无添加化学合成品”、“无添加化学调味品”之类的字样。其目的显然是为了迎合消费者对“天然”食品的需要。因为人们对化学合成的食品添加剂具有某种抵触乃至恐惧心理，因而为安全、健康宁愿付出高于合成品几倍乃至几十倍的价格去选购天然产品，美国一些高档的食品宁愿采用昂贵的天然提取的β-苯乙醇而不用廉价的合成β-苯乙醇。国际上天然苯乙醇主要是以微生物转化L-苯丙氨酸法生产，主要集中在法国、德国、日本等发达国家，其当前的生产量远不能满足消费需求。我国在微生物法生产天然苯乙醇方面的研究尚处于起步阶段，目前尚无生产天然苯乙醇的厂家，因此需要加强该方面的研究工作。生物法制备天然β-苯乙醇(I)能合成β-苯乙醇的微生物多种酵母具有从头合成和生物转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的能力，如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)发酵5d, 可产生浓度为400mg/L的β-苯乙醇,发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)发酵16h,可形成浓度为505. 5mg/L的β-苯乙醇。此夕卜，还有酸酒酵母(Saccharomyces vini)、产阮球拟酵母(Torulopsisu tilis)、芽枝状枝霉(Cladosporiumc Iadosporioides)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)等，都能在生长过程中从头合成一定量的β-苯乙醇。不少真菌也具有从头合成或转化L-苯丙氨酸为β -苯乙醇的能力，如火木层孔菌(Phellinus igniarius)、平滑层孔菌(Phellinus Iaevigatus)、杨木层孔菌(Phellinustremulae)、安息香薄皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)、帚状地霉(Geotrichumpenicillatum)、猴头菌(Hericiumerinaceus)、硬黑孔菌(Nigroporus durus)和黑曲霉(Aspergillus niger)等,但合成或转化能力相对较低。(2)合成β -苯乙醇的代谢途径①从头合成途径一苯丙酮酸途径在一些酵母细胞中，苯乙醇可以通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径从头合成。即经过莽草酸途径形成分枝酸后，分枝酸在变位酶作用下，转变成预苯酸，经过脱水、脱羧后形成苯丙酮酸；苯丙酮酸脱羧产生苯乙醛；苯乙醛脱氢便生成苯乙醇；代谢途径见图I。②苯丙氨酸转化途径一艾氏途径在哺乳动物细胞中，L-苯丙氨酸转变为酪氨酸，酪氨酸再经过尿黑酸降解为延胡索酸和乙酰乙酸。而在微生物细胞中，L-苯丙氨酸的分解代谢可能存在几种途径。其中之一是肉桂酸途径，降解过程的第一步是苯丙氨酸脱去氨基产生反式肉桂酸，如在掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)和黏红酵母(Rhodotorula glutinis)细胞中。对于把氨基酸仅作为氮源利用的微生物来说，肉桂酸已没有进一步降解的必要；而对于能够利用氨基酸作为碳源的微生物，肉桂酸则经过原儿茶酸进一步降解为3-酮基乙二酸，3-酮基乙二酸最终进入到TCA循环中。在微生物细胞中，L-苯丙氨酸分解的另一条途径是通过氨基酸的转氨作用生成苯丙酮酸，或在脱羧酶作用下形成苯乙胺，再脱羧或胺氧化形成苯乙醛，进而生成苯乙醇。这个途径首先是由Ehrlich在1907年发现。研究表明，在细胞中，苯乙醇合成走哪一条途径取决于培养基中氮源的种类，只有当L-苯丙氨酸作唯一氮源存在时，艾氏途径才能占优势。如果环境中有其它更容易利用的氮源存在，即使在较高的L-苯丙氨酸浓度条件下，L-苯丙氨酸仍有一部分通过其它途径被代谢，如通过肉桂酸途径降解为3-酮基乙二酸而进入TCA循环，而且这个降解途径不能完全被抑制，所以任何条件下，L-苯丙氨酸不能完全转化为β -苯乙醇。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株，其单独表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)苯丙酮酸脱羧酶及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae S288c)乙醇脱氢酶或串联表达。本发明还提供了一种构建高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株的方法，以高产苯丙氨酸的大肠杆菌为出发菌株，利用表达载体P CL1920表达来源于毕赤酵母以及酿酒酵母中苯乙醇合成途径的两个酶KDC、ADH1，获得高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产苯乙醇的方法，具体方法如下I 菌株E. coli pAP-B03/pCL1920-adhl-kdc2培养基斜面培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，葡萄糖5 ;斜面培养基添加琼脂 20，ρΗ7· O ；发酵种子培养基(g/L) :LB培养基(蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5)，pH7.0，装液量20mL/250mL，必要时在培养基中添加Kan50mg/L, Spec80mg/L。发酵培养基(g/L):葡萄糖35，(NH4)2S045，KH2P043，MgSO4 · 7H203，NaCl 1，Na-CitrateI. 5, CaCl2 ·2Η20 O. 015，FeSO4 ·7Η20 O. 1125，Thiamine-HCl O. 075, L-Tyr 0.4，蛋白胨 4，酵母粉 2，KanO. 04，微量元素营养液(TES) I. 5mL/L，ρΗ6· 8±0· I ；12g/L CaCO3 用于调节pH。装液量为50mL/250mLTES (g/L) =Al2(SO4)3 · 18H20 2. 0，CoSO4 · 7H20 0. 75，CuSO4 · 5H20 2. 5，H3BO3 0. 5，MnSO4 · 7H2024, Na2MoO4 · 2H20 3. 0, NiSO4 · 6H20 2. 5, ZnSO4 · 7H2015。3培养条件(I)种子培养从LB平板上挑取单菌落接种至三角瓶中培养，装液量为50mL/250mL, 37° C，200r/min 培养 10_14h。(2)摇瓶发酵培养将培养好的种子培养液按10%(v/v)的接种量，接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行培养，发酵温度33° C，摇床转速200r/min，当菌体生长至OD61tl为I. 5-2. O时，迅速转至38° C摇床，继续培养至48h。4苯乙醇的测定高效液相色谱(HPLC)。(I)色谱条件色谱分离柱SynergiHrdro-RP C18 (4. 6mmX 250mm, 4 μ m);保护柱-AnalyticalKJ0-4282 (4. OmmX 2. 0mm);流动相甲醇-水=50: 50 (v/v)；检测波长210nm;流速lmL/min ;进样量20 μ L ;柱温30° C。(2)标准溶液的配制β -苯乙醇工作液取IOmL β -苯乙醇标准储备液于IOOmL的容量瓶中，用70%的乙醇水溶液定容，其浓度为100mg/L。再用流动相分别稀释至50、20、10、5、1和O. 5mg/L。(3)样品处理发酵结束后，10000r/min离心获取发酵上清液3mL加入7mL乙醇水溶液定容IOmL,摇勻，离心出去杂蛋白等,经O. 45 μ m滤膜过滤即可进样分析。本发明提供的大肠杆菌工程菌株能够产生β -苯乙醇130mg/L,有效的利用L-Phe合成通路的通量促进产量苯乙醇的产生，从而 实现微生物发酵法直接发酵葡萄糖产苯乙醇。
图I :目的基因扩增ο图(a)泳道I:DL 2000Marker ;泳道2: adhl ;图(b)泳道I:DL2000Marker ;泳道 2:kdc图2 :关键酶基因adhl/kdc连接克隆载体验证(a) I: DL5000Marker; 2: pMD19_adhl 双酶切获取 adhl; 3: adhl;(b) I :DL10000 Marker; 2:pMD 19-kdc; 3:pMD19_kdc 双酶切 kdc.图3 :关键酶基因表达载体构建以及酶切验证I: pCL1920-adhl; 2: pCL1920_adhl 双酶切获取 adhl; 3: DL10000; 5: pCL1920_adhl-kdc; 5: pCL1920-adhl-kdc 双酶切获取 kdc图4重组菌发酵验证
具体实施例方式实施例I重组质粒的构建及鉴定分别毕赤酵母(Pichiapastoris GSl 15)以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae S288c)基因组为模板获取kdc以及adhl,引物如下(框框部分为RBS，下划线部分为引物酶切位点)kdc F: TCCCCCGGG jAAGGAGGATATACAlj ATGGCCCCAGTTCCAGATATAGCAR:CGAGCTCTTAACCTACGATTTTGGCTTTGTTCTTGadhl F A A A A CTGCAGGTAA jAAGGAGGATATACAT
ATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTR: CGCGGATCCGAATTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCACTTTA反应条件为94° C5min ;再 94 ° C30s，62 ° C (adhl)/63 ° C (kdc) 30s，72。C70s (adhl)/108s (kdc) (30 个循环);72° ClOmin 进行 PCR 反应，并以 0. 8% 琼脂糖凝胶电泳验证并回收PCR扩增产物，结果为扩增得到与文献报道大小相符的adhl/kdc基因片段(图I (a)_泳道2，图I (b)_泳道2)。用限制性内切酶双酶切消化并纯化后的adhl/kdc基因与克隆载体PMD19，用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，连接产物转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在LB (Ampr)平板上，37° C过夜培养，挑选阳性克隆子提取质粒(adhl图2 (a)-泳道4;kdc 图 2(b)-泳道 2)，用酶切(adhl 图 2 (a)-泳道 2;kdc 图 2 (b)-泳道 3)和 PCR (adhl图2 (a)-泳道3)方法验证，并送上海生工测序验证，挑选测序正确的转化子，与构建重组表达载体，如图3。将重组质粒pCL1920-adhl、pCL1920_kdc、pCL1920-adhl_kdc转化本实验室前期开发的L-苯丙氨酸生产菌大肠杆菌WSH-Z06 (pAP-B03) (CCTCC M 2010009)，已实现工业化生产，但是在生产过程中，容易受到噬菌体的污染，导致大量的倒罐，严重影响了生产企业的经济效益。实施例2共表达ADHl、KDC酶对重组大肠杆菌苯乙醇发酵的影响不同重组菌大肠杆菌与出发菌进行发酵实验对比。重组菌E. coli PAP-B03/pCL-adhl-kdc，进行发酵实验，测定苯丙氨酸产量以及β-苯乙醇产量如图4所示通过单独以及共同表达苯丙酮酸脱 羧酶(KDC)以及乙醇脱氢酶(ADHl)的情况下都能产生β-苯乙醇，而且同时表达两个酶基因的情况下β_苯乙醇的产量最高，最高能达到130mg/L，出发菌E. coli pAP-B03检测不到苯乙醇产量(图4)。
权利要求
1.一种高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株，其特征在于表达毕赤酵母(PichiapastorisGSl 15)苯丙丽酸脱竣酶以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)乙醇脱氧酶。
2.权利要求I所述的工程菌株，其特征在于所述表达为单独表达或串联表达。
3.权利要求I所述工程菌株的构建方法，其特征在于以高产苯丙氨酸的大肠杆菌为出发菌株，利用表达载体PCL1920表达来源于毕赤酵母以及酿酒酵母中苯乙醇合成途径的两个酶KDC、ADHl，获得高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株。
4.权利要求I所述工程菌株发酵法生产苯乙醇的方法，其特征在于工程菌株活化后，按10%(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵温度33° C，摇床转速200r/min，当菌体生长至OD61tl为1.5-2. O时，迅速转至38° C摇床，继续培养至48h。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于发酵培养基配方为(g/L):葡萄糖35，(NH4)2S045, KH2P043, MgSO4 · 7H203, NaClI，Na-CitrateI. 5，CaCl2 · 2H20 0. 015, FeSO4 · 7H200.1125，Thiamine-HClO. 075，L-TyrO. 4，蛋白胨 4，酵母粉 2，KanO. 04，微量元素营养液(TES) I. 5mL/L, ρΗ6· 8±0· I ；12g/L CaCO3 用于调节 pH ;装液量为 50mL/250mL ；TES (g/L) =Al2(SO4)3 · 18Η202· O, CoSO4 · 7Η200· 75，CuSO4 · 5Η202· 5，H3BO3O. 5，MnSO4 · 7Η2024, Na2MoO4 · 2Η203. O, NiSO4 · 6Η202. 5, ZnSO4 · 7Η2015。
全文摘要
本发明公开了一种高产苯乙醇的大肠杆菌工程菌株及其应用，以能够大量积累苯丙氨酸(L-Phe)的大肠杆菌基因工程菌作为出发菌株(摇瓶发酵苯丙氨酸发酵水平能达到6.0g/L)，将苯丙酮酸脱羧酶(KDC)以及乙醇脱氢酶(ADH1)，通过单独表达以及通过合适的基因组合串联表达两个关键酶基因，构建重组菌株，串联表达苯丙酮酸脱羧酶以及乙醇脱氢酶的重组菌株能够产生β-苯乙醇130mg/L，苯丙氨酸产量为5.0g/L，而出发菌株高产L-Phe的大肠杆菌作为对照菌株在整个发酵过程中检测不到苯乙醇的积累。本发明提供了一种利用能过量表达来源于不同宿主的合成代谢途径中的酶基因，通过代谢工程的手段使得大肠杆菌利用葡萄糖为唯一碳源发酵直接生产苯乙醇的方法。
文档编号C12R1/865GK102851253SQ20121027649
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者陈坚, 张传志, 堵国成, 康振, 关泽宇 申请人:江南大学