使用预冷保护剂制造用于低温保存的生物物质的方法

专利名称：使用预冷保护剂制造用于低温保存的生物物质的方法
技术领域：
本发明一般涉及低温保存，更具体涉及使用保护剂的低温保存处理。
背景技术：
从十八世纪起人们就知道使用冷冻保存细胞，当时用犬的精子进行试验发现细胞可以被冷冻和随后被解冻，以后有小部分百分比的精子可以恢复正常的生理功能。在二十世纪早期，发现如果使用总称为冷冻保护剂的化合物对细胞进行化学处理以经受冷冻和解冻循环，可以改善细胞的恢复率。在二十世纪后期，进行了大量的研究来开发细胞保护剂，同时优化用于各种不同细胞的冷冻温度和冷冻速度。但是，尽管今天在技术上取得了进步，冷冻保存后的细胞恢复率仍常常在50％或更低。
通常，冷冻保护剂由水、各种盐、各种糖、蛋白质源，和被称为冷冻保护剂或化学保护剂的化学化合物组成。各种盐作为缓冲剂维持pH在细胞或分子被冷冻时所能耐受的限度内，而各种糖作为能量来源和渗透压因子。各种蛋白质在化学上稳定冷冻前的细胞膜结构以防止休克蛋白的反应。
今天有各种冷冻保护剂被使用，例如，二甲亚砜(DMSO)，丙二醇(PPO)，和蛋黄/甘油溶液。用于大多数细胞类型的冷冻保存的，在工业上被广泛接受的标准冷冻保护剂是DMSO。这归因于对基于DMSO的冷冻保存溶液的经验和知识的广为流传，通常认为DMSO移除细胞中的水分使得冷冻期间的冰晶形成减少，能提供优良的保护和细胞存活最多。
至今，改善冷冻保存恢复率的研究努力通常集中在新的冷冻保护剂和冷冻技术上。两方面的努力是为了降低在冷冻过程中由于冰晶形成使细胞内水分膨胀造成的细胞损伤。理论上，很慢或很快的冷冻速度会减少或消除细胞中冰晶的形成。很慢速度冷冻的机制包括控制下降，通过从蒸汽氮到液态氮或把样品在超级冷冻化合物中移动，随后浸到液态氮中。快速冷冻技术把细胞直接浸到液态氮中以快速冷冻细胞中的水分，从而抑制冰晶形成。这种在短时间内温度极端下降经常导致细胞膜的应力性破碎，因而对恢复率有不利的影响。
在冷冻过程中，低温保护剂介质中组成化学成分的分子在冷冻过程中被迫排成行。这种被迫成行导致介质中组成的化学成分产生吸热反应，这在潜热相中会释放能量。在冷冻物质经受潜热相时(伴随吸热反应)，这种释放的热量导致低温保护剂的温度短暂升高。这种潜热量，也被认为是转化热，如果在压力不变的相转换中(如解冻、沸腾、升华)进行测量，只是焓的变化。在等压过程中焓的变化等于在一个系统经历由起始平衡状态到最终平衡状态的一个极小过程中热量的转移。
为了细胞存活最多必须优化的两个重要的低温保存参数是冷冻时间和冷冻速度。在潜热相中观察到的冷冻速度的改变和冷冻温度的增加是低温保存过程中或传统冷冻过程中优化细胞生存率的障碍。
发明概述因此，需要可在低温过程中保护单个细胞、组织、器官、核酸或其他生物活性分子存活，而避免现有方法中固有的某些问题的改进的方法。所以，本发明中至少一个实施方案提供了一种方法，该方法通过在解冻的保护剂应用在生物活性物质前，用预冷保护剂以产生不可逆的相变，通过降低保护剂升华的热量来改善低温保存的恢复率。
在一个实施方案中，保护剂被冷冻以诱导吸热反应。在吸热反应发生后，该保护剂被解冻和被用于准备进行冷冻的生物活性物质。在生物活性细胞中的解冻的保护剂在随后的冷冻中没有吸热反应，所以本文公开的方法可以充分增加经受低温保存过程的生物物质中存活的细胞数量。
本发明的另一个实施方案提供了在低温保存中通过低温保护剂减少热量释放的方法。该方法包括将保护剂预冷以在保护剂中产生不可逆的相变，用该保护剂处理生物活性物质，随后冷冻该经过处理的生物活性物质。
本发明的另一个实施方案提供了一种经历低温保存过程的生物物质，该低温保存过程包括预冷保护剂直至其冷冻以引起保护剂不可逆地释放能量，解冻该保护剂到适于应用到生物活性物质的温度，将解冻的保护剂应用到生物物质，并冷冻该处理过的生物物质。
本发明的至少一个实施方案的目的在于改善低温保存过程中生物活性物质的生存率。
本发明的至少一个实施方案的优点在于细胞存活损失率的下降，其原因在于低温保存过程中保存剂的热量释放对冷冻速度没有不利影响。
附图简述本发明的其他目的、优点、特点和特征，及有关结构因素的方法、操作和功能，和制造的部分与经济内容的结合，在考虑有参考附图的下文的描述和权利要求时会明显显示，所有这些都构成说明书的内容，其中在不同图形中用参考数字标明的相应部分，其中有

图1是根据本发明中至少一个实施方案对三种低温保护剂的温度测量图表，该三种低温保护剂经过有短暂时间间隔的快速冷冻的预先处理；图2是阐明根据本发明中至少一个实施方案的方法的流程图；图3是根据本发明中至少一个实施方案，用液态氮的低温保存方法与对照组和本发明的低温保存方法与对照组的对比实验结果的柱形图；图4是阐明根据本发明中至少一个实施方案，猪精子在经历冷冻-解冻循环后保持活力的百分比的柱形图；图5是适合用于本发明中至少一个实施方案的冷冻设备的侧面剖面图。
附图详述图1-5描绘的是，根据本文公开的各种实施方案，在生物活性物质的低温保存中使用预冷保护剂的方法，该方法可使经过冷冻过程的细胞生存率升高。在各种实施方案中，生物活性物质包括存活的单个细胞、存活的组织、存活的器官、存活的核酸、存活的核糖核酸、存活的基于氨基酸的化合物和存活的基于脂肪的化合物。
理论上，大多数化学反应是双向的(可逆的)。但是，实际上，根据特定反应的能量要求，许多化学反应被发现是单向的(不可逆的)。在本发明中包含的保护剂的情况中，在潜热相中的热量释放就是单向化学反应。因此，一旦冷冻，本发明包含的保护剂在随后的解冻和再冷冻中显示出长持续时间的相变能力(不可逆相变)。
在冷冻中潜热释放现象在图1中可见，图1是根据本发明中各种实施方案对三种低温保护剂的温度测量图表，该三种低温保护剂经过有短暂时间间隔的快速冷冻的预先处理。图1中测量的低温保护剂包括二甲亚砜，如DMSO 110所示；蛋黄/甘油溶液，如Gly 115所示；丙二醇，如PPO 120所示。在冷冻过程中转换能量的热释放的效果在时间间隔5(在时间＝75秒)和间隔6(在时间＝90秒)的测量中清楚可见，所有三种物质可见有温度的明显升高，或有高峰125。在高峰125后，在以后的时间间隔中的测量显示温度的下降，直至测量时间结束。
从在溶质冷冻的一系列测量中，可能确定在潜热相中的热释放是保护剂介质中温度的短暂升高，如图1中高峰125所示。但是，如本文公开的，首先把保护剂在预先处理步骤中快速冷却(过度冷却)，就不会观察到上述的温度升高，因为预先处理的保护剂经历了化学特性的变化，显示出长持续时间的相变能力。这种预先处理溶质带来的长持续时间的相变能力的效果已经过测量，发现本文公开的预先处理的保护剂在本文所述的冷冻中没有明显的热量释放。
在一个实施方案中，对保护剂经历冷冻/解冻循环后没有特别的温度储存要求。在本文所述的预先处理以后，保护剂表现出长持续时间的相变能力，如果需要可以被再次使用，在冷冻过程中不会再次出现不需要的温度高峰。根据本发明中各种实施方案，温度高峰的降低应会增加在低温保存后细胞和分子的生存力和存活力。
现在讨论图2，图2阐明了根据本发明中一个实施方案的方法。该阐述的方法从步骤1010开始，该步骤中按上文讨论把保护剂快速冷冻以形成能量的不可逆释放(不可逆相变)。在各种实施方案中使用的保护剂可包括，但不限于，下列甘油、DMSO、或丙二醇。在步骤1015中，通过解冻保护剂到0摄氏度以上的温度使保护剂恢复到预冷的稠度。一旦解冻，快速冷冻保护剂到-18摄氏度或更低就没有液体层的分离。没有液体层的分离是有利的，因为在首次冷冻和解冻循环后，保护剂在随后的冷冻循环中的溶解增加。在保护剂溶解到足够的稠度后，将要冷冻的生物物质被浸到解冻的保护剂中以准备冷冻生物物质，如步骤1020所示。在步骤1025中，浸有保护剂的生物物质被快速冷冻。在一个实施方案中，可应用该方法的生物物质包括生物活性物质如存活的单个细胞、存活的组织、存活的器官、存活的核酸、存活的核糖核酸、存活的基于氨基酸化合物和存活的基于脂肪的化合物。
可选择的是，某些生物物质要求在冷冻前有其他化学准备。例如，对物质的化学准备包括制剂(稳定剂)物质的预先处理，这些制剂通过移除细胞生长时或死亡时分泌的有害物质以增加细胞存活力。有益的稳定剂包括化学物和化学化合物，它们中许多是本领域技术人员知晓的，这些化学物和化学化合物隔绝高度反应性和损害性的分子如氧化基团。
图2所示的步骤是按照连续的顺序显示和讨论的。但是，所阐明的方法的特性在于其中一些或全部的步骤是连续进行的，和可以按不同的顺序进行的。例如，如果现有的一批保护剂是已经经过冷冻/解冻循环的，则在应用于生物物质前不必把保护剂再次冷冻。
使用本文公开的技术进行的研究显示可获得改善的细胞生存率为40％或更高。用猪肌肉细胞的实验结果如图3所示，柱形图显示了液态氮(LN)的低温保存方法与对照组和本发明(SC)的一个实施方案与对照组的结果，如柱形图400所涉及的。柱形图400把已经历了有预冷保护剂的低温保存的猪肌肉细胞的存活数目与对照组进行比较。按照本文公开的各种实施方案，对照组所进行的低温保存的保护剂未经过预冷处理。
按照本文所示的高温度冷冻方法，没有预冷处理的保护剂的对照组405被冷冻到约负-25摄氏度度，而没有预冷处理的保护剂的对照组410在液态氮中被冷冻到约负196摄氏度。两个对照组405和410，和有预冷处理的保护剂的组420和425取自普通组织来源，这些组织被分成许多组以被用于不同的处理和冷冻技术(LN和SC)。猪肌肉组425如本文所示在预冷保护剂处理后用于有液态氮(LN)的低温保存。猪肌肉组420如本文所示在预冷保护剂处理后，按照冷冻对照组405使用的相同的高温度冷冻方法进行低温保存。
如柱形图400所示，使用液态氮(LN)技术，预冷组425在解冻后显示的存活百分率在约60-70％，而使用同样的LN冷冻技术的没有预冷保护剂的对照组410在解冻后显示的存活百分率在约40-50％。使用本文所示的高温度冷冻方法的冷冻技术，预冷组420显示的存活百分率在约80-90％，而没有预冷保护剂的对照组405显示的存活百分率在约80-90％。根据总体的细胞生存情况，LN低温保存技术与高温度冷冻技术相比，其细胞生存相当少。在使用液态氮的组410和425中，按本文所示使用预冷保护剂的细胞与使用未预冷的保护剂的细胞相比，细胞在生存力上有明显增加。但是，如使用预冷保护剂处理的组420和425的对比所显示的，高温度冷冻方法所产生的细胞生存增加比LN技术增加将近一倍。虽然使用预冷保护剂的相同细胞用高温度冷冻方法进行冷冻没有明显改变生存率，例如组405和420，但其他实验的其他细胞类型(如图4所示的猪精子)在两种冷冻技术(LN和SC)中显示明显的改善。
现在讨论图4，图4阐明了用传统保护剂处理的猪精子样本和按照本发明的实施方案用预冷保护剂处理的猪精子样本，在经过低温保存(冷冻)和解冻后检测的运动性能的百分比。本研究使用的保护剂是甘油和水的混合物，各种浓度的甘油有各自的重量百分比。因此数字1％，2％，等等在纵坐标上指明最终的甘油浓度1％，2％，3％，4％，或5％。对照组505显示用有不同浓度甘油(重量上1％-5％)的保护剂处理的精子样本，这些保护剂未按照本文所示的实施方案进行预冷。预冷组510显示用有不同浓度甘油的保护剂处理的精子样本，这些保护剂已按照本文所示进行预冷。本文包含的高温度冷冻方法被用于冷冻各种猪精子样本。
如图4所示，预冷组510与对照组505相比在所有的甘油浓度上都显示出较高的运动性能百分比，除了3％甘油数据点，在该点上二者几乎相等。这些数据显示对冷冻更敏感的细胞如果用预先处理的介质冷冻表现出较高的生存率，如本文所示显示长持续时间的相变能力(不可逆相变)。研究结果进一步表明本文公开的技术可用于低温保存那些以前被认为不可使用这些技术的生物物质种类，同其他所有的哺乳动物种类一样。除了精子以外，还有许多其他领域如皮肤、细胞系、蛋白质和其他生物活性物质，可以使用本文所述的方法而受益。
在一个实施方案中，本文所述的方法的应用可以扩展到人类，在人工受精和体外受精领域针对不育症提供低成本的治疗。因为本文所述的一些低温保护剂，如丙二醇，不表现其他一些低温保护剂如DMSO的毒性影响，则长持续时间的相变保护剂对导入使用保护剂的精子的患者没有副作用。
再讨论图5，适合用于本方法的冷冻设备根据本发明中至少一个实施方案来阐明，通常指冷冻单元800。冷冻单元800包括容纳冷冻液840的水箱810较佳。浸在冷冻液840中的是循环机械装置834，像发动机和推进器的组合体，及热交换线圈820。可被冷冻的物质包括，但不限于，存活的单个细胞、组织、器官、核酸、核糖核酸、基于氨基酸化合物和基于脂肪的化合物，和其他生物活性分子。在水箱810的外面，连接热交换线圈820的是制冷单元890。
水箱810必须足够在冷冻液840的容量中浸没将冷冻的物质，可以是任何尺寸，该尺寸可是12英寸的比例倍数乘24英寸乘48英寸。可使用与本文要求一致的其他大小的水箱。例如，在一个实施方案中(未写出)，水箱810的大小足够容纳冷却液840，所以快速冷冻包括生物物质和低温保护剂的悬浮液的容器可被置于水箱810中。在另一个实施方案中，水箱810大到足以把整个生物体完全浸没来快速冷冻。水箱810可以或大或小，按照需要制备，以容纳各种大小和数量的物质被冷冻，这是有利的。
水箱810容纳冷冻液840。在一个实施方案中，冷冻液是食品级的溶液。食品级品质的液体的好例子是基于丙二醇、氯化钠溶液、甘油等的液体。在一个较佳实施方案中，冷冻液是保护剂丙二醇。而用于容纳生物物质的各种容器，本发明中一些实施方案用这些容器把生物物质直接浸入冷冻液进行快速和有效的冷冻。
为了能冷冻物质但不形成冰晶，本发明的一个实施方案把冷冻液840循环通过进行冷冻的物质，以35升每分钟的相对固定的速度用于装在超过24英寸宽48英寸深的范围内的每部分冷冻液。必要的循环通过一个或多个循环机械设备834-像发动机和推进器的组合体一提供。在本发明的至少一个实施方案中，浸在循环液中的循环机械设备834把冷冻液840循环通过进行冷冻的物质。其他循环机械设备834，包括各种泵(未画出)，可与本发明的物件相容地使用。本发明至少一个实施方案使用至少一个循环机械设备834来循环冷冻液，增加了循环冷冻液的面积和体积。在使用多个循环机械设备834的实施方案中，冷冻液循环的面积和体积的增加与每个增加使用的循环机械设备成直接比例。例如，在一个较佳实施方案中，一个增加的循环机械设备被用于在不超过24英寸宽28英寸深的范围中循环每一部分循环液。
较佳的是，循环机械设备834中的发动机可保持固定的预先确定的速度控制冷冻液流经要冷冻的物质，同时保持水箱810每一点上冷冻液温度均匀分布在+/-0.5摄氏度内。冷冻液循环以固定和预先确定的速度经过物质或产品提供了持续的、可测量的热量转移，这样可进行物质的冷却和冷冻。在一个实施方案中，冷冻液的特性，如粘度、温度等等，被测量和处理，控制信号被传送到循环机械设备834使循环机械设备834中的发动机可以按要求增加或减少推进器的转速和扭矩。在其他实施方案中，发动机的构造在各种液体情况范围内保持特定的转速不产生额外的热量。在这种情况，发动机给推进器的扭矩或转速不是外部控制的。重要的是没有冷冻设备需要的外部的泵、轴或滑轮。发动机和推进器的组合物，或其他循环机械设备834，是直接浸在冷冻液840中的。结果是，冷冻液840不仅冷冻水箱810中放置的物质，而且冷冻液840还冷冻循环机械装置834中的部件(即发动机和推进器)。
热交换线圈820是“多路线圈”较佳，该线圈允许制冷剂通过多种路径转移(即三种或更多路径)，与此相比，传统的制冷线圈是制冷剂通常限制在一个或两个连续路径上。而且，线圈大小与包含可测量的数量的冷冻液840的横截面积有直接关系。例如，在一个较佳实施方案中，水箱810是一英尺长，二英尺宽和四英尺深，使用的热交换线圈是一英尺乘二英尺。如果水箱810的长度增加到二十英尺，则热交换线圈820的长度也增加到二十英尺。结果，热交换线圈820只需传统线圈大小的大约百分之五十就能处理相同的热负荷。循环机械设备834把冷却的冷冻液840循环到被冷冻的物质，然后把变热的冷冻液运送到热交换线圈820，该线圈浸没在冷冻液840中。在至少一个实施方案中，热交换线圈820计划为从冷冻液840中移除的热量不少于从被冷冻的物质中移除的热量，因此维持冷冻液的温度在预先确定的范围。热交换线圈820连接在制冷单元890上，该制冷单元从热交换线圈820和系统中移除热量。
在一个较佳实施方案中，制冷单元890被设计为与热交换线圈820的负荷要求相匹配，所以可以平衡和有效的方式从系统中移除热量，导致对物质可控的、快速的冷冻。制冷单元890的效率与用于控制吸水压力的方法直接有关，该吸水压力是由于热交换线圈820的有效输送和制冷单元890使用的压缩机的有效输出形成的。
该方法要求在制冷剂和冷冻液840的温度，在冷凝温度和周围温度中保持很小的偏差。这些温度标准，与热交换线圈820一起，使热交换线圈820的输送更有效，这使压缩机在平衡和紧密控制的方式下输送，使得压缩机获得超过压缩机制造商标准等级百分之二十五的表现。
注意图5所描绘的实施方案，制冷单元890是外置的，位于远处的制冷系统。但是，在另一个实施方案中(未写出)，制冷单元890被组合在水箱810的另一个部分。制冷单元890的各种形状或多或少适于冷冻单元800的某些形状是有利的。例如，如果水箱810特别大，分离的制冷单元890可能是合意的，而便携式的实施方案受益于一体化的制冷单元890。这种一体化只有通过执行本文提出的原则取得效率，特别是使用缩小尺寸的热交换线圈，才有可能获得。
依靠制冷单元890和热交换线圈820，在一个较佳实施方案中，冷冻液被冷冻到-20摄氏度和-30摄氏度的温度之间，冷冻液内的温度差别小于约+/-0.5摄氏度。在另一个实施方案中，冷冻液被冷冻到超过-20摄氏度和-30摄氏度的温度范围以控制物质被冷冻的速度。其他实施方案控制冷冻液的循环速度以获得需要的冷冻速度。可选择的是，冷冻液的体积可以变化以利于特定的冷冻速度。可用于获得所需的冷冻速度的冷冻液循环速度、冷冻液体积和冷冻液温度的各种组合是有利的。
在前述的详细描述中，已参考了本文组成部分的附图，并通过阐明可施行本发明的特定的实施方案进行了说明。这些实施方案已被充分细致地描述使本领域技术人员能够施行本发明，可以理解的是本发明可使用其他实施方案，可以在不背离本发明的精神和范围内在逻辑上、机械上、化学上和电子上进行变化。为了避免本领域技术人员施行本发明所不必要的细节，描述中省略了某些本领域技术人员知晓的信息。因此，前述的详细描述并不是作为限制，本发明的范围只由所附的权利要求确定。
权利要求
1.一种方法包括以下步骤冷冻保护剂使能量从保护剂中不可逆的释放；用该保护剂处理生物活性物质；和冷冻该处理过的生物活性物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到小于约-23℃的温度经过度冷却处理的溶质。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到约-23℃和-26℃之间经过度冷却处理的溶质。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃-8.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约17℃的平均速度经过度冷却处理至少部分时间的溶质。
7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，在约-23℃和-26℃之间所述经预处理的溶质的热吸收速度是约135BTU。
8.如权利要求1所述的方法，还包括在处理生物活性物质的步骤之前的加热保护剂的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，加热保护剂的步骤包括加热保护剂到超过0摄氏度。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括丙二醇。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括甘油。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括DMSO。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性物质包括存活的单个细胞、存活的组织、存活的器官、存活的核酸、存活的核糖核酸、存活的基于氨基酸的化合物和存活的基于脂肪的化合物。
14.一种方法包括以下步骤冷冻保护剂到低于约-23摄氏度以使能量从保护剂中不可逆的释放；加热保护剂到超过0摄氏度；用该保护剂处理生物活性物质；和冷冻该处理过的生物活性物质。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到小于约-23℃的温度经过度冷却处理的溶质。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到约-23℃和-26℃之间经过度冷却处理的溶质。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃-8.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约17℃的平均速度经过度冷却处理至少部分时间的溶质。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在约-23℃和-26℃之间所述经预处理的溶质的热吸收速度是约135BTU。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括丙二醇。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括甘油。
23.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括DMSO。
24.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述生物活性物质包括存活的单个细胞、存活的组织、存活的器官、存活的核酸、存活的核糖核酸、存活的基于氨基酸的化合物和存活的基于脂肪的化合物。
25.经低温保存处理的生物物质，所述低温保存处理包括冷冻保护剂使能量从保护剂中不可逆的释放；用该保护剂处理生物活性物质；和冷冻该处理过的生物活性物质。
26.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
27.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到小于约-23℃的温度经过度冷却处理的溶质。
28.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述经预处理的溶质是从室温到约-23℃和-26℃之间经过度冷却处理的溶质。
29.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约6.5℃-8.5℃的平均速度经过度冷却处理的溶质。
30.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述经预处理的溶质是以每分钟至少约17℃的平均速度经过度冷却处理至少部分时间的溶质。
31.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，在约-23℃和-26℃之间所述经预处理的溶质的热吸收速度是约135BTU。
32.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述低温保存处理包括在处理生物活性物质的步骤之前加热保护剂。
33.如权利要求32所述的生物物质，其特征在于，所述低温保存处理包括加热保护剂到超过0摄氏度。
34.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的单个细胞。
35.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的组织。
36.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的器官。
37.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的核酸。
38.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的核糖核酸。
39.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的基于氨基酸的化合物。
40.如权利要求25所述的生物物质，其特征在于，所述生物物质包括存活的基于脂肪的化合物。
全文摘要
本发明提供了一种制备用于低温保存生物物质的方法。该方法通过冷冻保护剂、解冻保护剂并用解冻的保护剂处理生物活性物质，使低温保护剂在潜热相中减少热量释放。首先，冷冻保护剂以产生不可逆的相变，同时有不可逆的热量释放。在这个相变发生后，该保护剂被解冻并被用于准备进行冷冻的存活细胞或其他生物活性物质。在随后的冷冻过程中，在生物活性细胞中的解冻保护剂可减少吸热反应。在一个实施方案中，冷冻生物物质包括把生物物质浸在冷冻液中，以一直持续的、预先确定的速度和温度循环冷冻液经过生物物质，使生物物质被玻璃化，在细胞膜形成的应力性破碎最小。该保护剂可以是丙二醇、甘油、DMSO或其他合适的保护剂。
文档编号C12N5/02GK1655672SQ02827300
公开日2005年8月17日 申请日期2002年11月20日 优先权日2001年11月20日
发明者A·J·卡塞尔, B·伍德, S·D·普里恩 申请人:苏帕契勒技术控股有限公司