组织改造雌性生殖器官的建造的制作方法

专利名称：组织改造雌性生殖器官的建造的制作方法
优先权本发明要求2001年11月16日提交的名称为组织改造雌性生殖器官的建造的美国临时申请第60/331,503号的优先权。
背景技术：
本发明的技术领域为组织工程，具体而言，为组织改造雌性生殖器官的构造。本发明特别用于构造组织改造的阴道、输卵管、子宫、和子宫颈。
现有的多种病理性疾病都会影响外生殖器并要求进行广泛性外科手术干预(Hendren，H.W.(1998).泄殖腔畸形“Campbell’sUrology”7th ed.，Saunders，Philadelphia，1991-2001)。雄性生殖器重构利用组织工程学获得了最多目前报道的长期临床成功以及对尿道重构的确实适合性(Atala等，J.Urol.1621148-1151(1999)；Chen等，World J.Urol.18(1)67-70(2000))。当然，其它疾病，像泄殖腔畸形和外翻可导致雄性和雌性的严重生殖器模糊。然而，缺乏有关雌性生殖器和阴道重构的信息。
对于妇科患者而言，阴道、子宫颈、和子宫的先天性畸形具有很深刻的暗示。这些异常时常在青春期被检测出来。为了进行适当的处理，医生需要彻底了解正常的胚胎学和性分化。虽然临床经验可帮助妇科医生了解复杂的解剖学构型，但是必需对有缺陷的每位个体进行彻底评估，因为生殖道畸变并非必定遵循任何规定和一致的模式。雌性生殖异常的例子包括模糊不清的生殖器、阴道和子宫闭锁、梗阻性流出道疾病、子宫颈闭锁、泌尿生殖窦痰病、和雄性化痰病(Edmonds，D.K.，Obstet Gynecol Clin North Am 27(1)49-62(2000))。生殖器畸形尤其会妨害患者和她的家庭，这是因为他们不仅具有生殖疾病，而且还具有严重的心理和性问题，这种问题不仅需要解决，而且要以敏感且鼓励性的方式解决。更深一层的讨论可在教科书中找到(Rock JA“苗勒氏管异常的外科手术”Te Linde’s OperativeGynecology(第8版)，由J Rock，J.Thompson.Philadelphia，Lippincott-Raven编辑，1997；Edmonds DK“性发育异常和它们的构造上和下道”Pediatric and Adolescent Gynecology，由JSanfilippo，D Muram，P Lee，J Dewhurst.Philadelphia，W.B.Saunders编辑，1994；Jones HW Jr“先天性子宫阴道异常的构造”Female Reproductive Surgery，由J Rock，A Murphy，HW Jones Jr.Baltimore，Williams&Wilkins编辑，1992)。
先天和后天的子宫畸形，如发育不全或再生障碍性子宫异常、癌症、创伤、和严重的炎性疾病，占雌性不孕症的较大比例。但用于子宫重构的选择有限。如果使用子宫外组织进行重构，则无法怀孕。已经实验过使用合成生物材料进行子宫组织替换，然而这些尝试没有成功，这很可能是由于子宫的复杂生理和功能特性(Jonkman等，ArtifOrgans，10475-80，1986))。
先天性雌性生殖器异常和泄殖腔畸形，如icornuate/中隔子宫、双子宫、子宫颈和阴道闭锁、梗阻性生殖道，可能还需要广泛的外科手术构造。经常需要进行外科手术是由于可获得的天然组织量有限。目前，非-生殖道组织已经用于阴道重构，尽管存在很多相关并发症。这些治疗包括建造乙状阴道的腹膜后sacropexy的经腹方法，例如，在患有Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser综合症的患者中。然而，这些构造有脱垂倾向，导致阴道“脱落”感、疼痛、白带和性交困难，并需要进行修复。其他患者，例如，阴道和子宫颈发育不全，但仍然具有功能性子宫内膜的患者通常是通过进行传统的子宫切除，随后构造新阴道而治疗的。这就需要阴道皮肤的移植，这种移植可能会愈合不好，并可能导致月经失调。
目前，雌性生殖器官重构所用的各种方法都使用的是非同源性组织来源。然而，非同源性组织用于雌性器官重构的应用与有限的功能性有关。因此，本领域仍然需要通过改造雌性生殖和生殖器组织来解决这些问题。
因此，仍然存在生产雌性生殖器官的需要，例如使用自体细胞生产生殖道的器官和组织。
发明概述本发明提供使用组织改造雌性生殖器官改善雌性生殖道先天性畸形和疾病的组合物及方法。这些组织改造雌性生殖器官可通过培养源于生殖道组织的细胞，如阴道上皮细胞、输卵管上皮细胞、子宫颈上皮细胞、子宫上皮细胞和平滑肌细胞的细胞群体而产生。将培养细胞灌注在生物相容性性基质上或生物相容性基质中。本发明的方法可用于重构雌性生殖器官，包括但不限制于，子宫颈、子宫、阴道、和输卵管。
使用雌性生殖细胞，例如，子宫上皮细胞、阴道上皮细胞、输卵管上皮细胞、和平滑肌细胞，例如子宫肌细胞的群体灌注生物相容性性基质，之后它们发育成各自的生殖道组织层。因此，一方面，本发明提供一种重构人造雌性生殖器官构造的方法，即把培养的雌性生殖细胞的第一群体灌注到生物相容性基质的一侧中，这样培养的雌性生殖细胞就可与生物相容性基质粘附；然后培养生物相容性性基质中的培养的雌性生殖细胞，直到培养的雌性生殖细胞产生第一雌性生殖组织层；将与培养的雌性生殖细胞第一群体不同的培养的雌性生殖细胞第二群体灌注到生物相容性性基质的另一侧，从而使培养的雌性生殖细胞第二群体与生物相容性性基质粘附；并培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖细胞的第二群体，直到培养的雌性生殖道细胞产生不同于第一生殖组织层的第二雌性生殖组织层，由此建造雌性生殖器官构造。
所述人造雌性生殖器官构造还可通过在生物相容性性基质同一侧上培养生殖道细胞的第一和第二群体而建造。在一个实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的一个群体，例如阴道上皮细胞建造。在另一实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的至少2个不同群体，例如阴道上皮细胞和平滑肌细胞而建造。在其它实施方案中，所述雌性生殖器官构造可通过使用雌性生殖细胞的任何数目的不同群体，例如3个不同群体或更多群体而建造。本发明的范围内还包括这样一种雌性生殖器官构造，它是从雌性生殖细胞的至少一个群体和并非来源于雌性生殖细胞的另一群体，例如，来源于膀胱的平滑肌细胞而建造的。
另一方面，本发明提供一种重构人造子宫构造的方法，即把培养的子宫上皮细胞群体灌注到生物相容性性基质的一侧，这样子宫上皮细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的子宫上皮细胞，直到上皮细胞产生子宫上皮组织层，例如，子宫内膜；将培养的平滑肌细胞，例如子宫肌细胞群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样子宫肌细胞与生物相容性基质粘附；并培养生物相容性基质中的子宫肌细胞，直到子宫肌细胞产生子宫肌肉组织层，由此建造人造子宫。在另一实施方案中，人造子宫可通过将细胞接种在生物相容性基质两侧上而建造。在另一实施方案中，人造子宫可通过铺层培养细胞层而建造，例如，可将子宫上皮细胞接种在生物相容性基质两侧上，然后接种平滑肌细胞，例如子宫肌细胞。另一实施方案中，可将子宫上皮细胞和平滑肌细胞同时接种在生物相容性基质上。
另一方面，本发明提供一种重构人造阴道构造的方法，即把培养的阴道上皮细胞群体灌注到可生物降解基质的一侧，这样阴道上皮细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的阴道上皮细胞，直到阴道上皮细胞产生阴道上皮组织层；把培养的平滑肌细胞群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样平滑肌细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的平滑肌细胞，直到平滑肌细胞产生平滑肌组织层，由此建造人造阴道。在另一实施方案中，人造阴道可通过在生物相容性基质两侧接种细胞而建造。在另一实施方案中，人造阴道可通过铺层培养细胞层而建造，例如将阴道上皮细胞接种在生物相容性基质的两侧，然后接种平滑肌细胞。在另一实施方案，可将阴道上皮细胞和平滑肌细胞同时接种在生物相容性基质上。
生物相容性基质可由不可降解或可降解的物质组成。生物相容性基质可形成三维支架。生物相容性基质还可由去细胞化的(decellularized)器官物质组成。当在生物相容性基质中生长时，增殖细胞成熟并适当分离形成与在体内找到的相应物类似的组织。在其它实施方案中，雌性生殖系统的一部分可用人造雌性生殖器官代替。
另一方面，本发明提供一种通过植入人造雌性生殖器官而治疗患有生殖疾病患者的方法，所述人造雌性生殖器官是如下形成的将培养的雌性生殖道细胞第一群体灌注到生物相容性基质的一侧，这样培养的雌性生殖道细胞与生物相容性基质粘附；培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖道细胞，直到培养的雌性生殖道细胞产生第一雌性生殖组织层；将与培养的雌性生殖道细胞第一群体不同的培养的雌性生殖道细胞的第二群体灌注到生物相容性基质的另一侧，这样培养的雌性生殖道细胞第二群体与生物相容性基质粘附；并培养生物相容性基质中的培养的雌性生殖道细胞的第二群体，直到培养的雌性生殖道细胞产生不同于第一生殖组织层的第二雌性生殖组织层；并监测生殖器官疾病患者是否适应。所述人造雌性生殖器官或组织结构显示出天然雌性生殖器官的顺应性和脉管系统。在其中一个实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造阴道。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宫。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是人造子宫颈。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官是输卵管。
另一方面，本发明提供一种人造雌性生殖器官，它包括一个用可生物降解基质制成的三维支架，该生物降解基质是用培养的雌性生殖道细胞的至少一个群体灌注的，产生至少一层雌性生殖组织层，从而建造雌性生殖器官构造。在另一实施方案中，所述人造雌性生殖器官构造含有培养的雌性生殖道细胞的至少两个不同群体，从而产生至少两种不同的雌性生殖组织层。在一个实施方案中，两种不同的雌性生殖组织层是在生物降解基质的同一侧上产生的。在另一实施方案中，两种不同的雌性生殖组织层是在生物降解基质的两个不同侧面上产生的。在另一实施方案中，将第一和第二细胞群体灌注到分开的基质层中或基质层上，且将这些基质层在灌注后结合在一起。
另一方面，本发明提供一种筛选调节雌性生殖细胞的化合物的方法。该方法包括提供一种可植入的生物相容性基质，该基质已经用雌性生殖细胞群体和平滑肌细胞群体灌注，这样雌性生殖细胞群体与形成具有正常子宫组织顺应性的组织结构的肌细胞群体粘附；使人造雌性生殖器官与供试化合物库接触；从供试化合物库选择可调节雌性生殖细胞的目标化合物。所述化合物可以是化学品或药物，它可能是细胞毒性的，治疗性的，影响胚胎的植入，或调节收缩。
附图简述

图1是表示植入6周后，正常和组织改造(TE)阴道在不同水平电刺激下的激发电位的曲线图；图2A是描述正常子宫组织对电场刺激的反应的曲线图；图2B是描述正常子宫组织对卡巴胆碱(CA)和阿托品(AT)药物刺激的反应的曲线图2C是描述正常子宫组织对脱羟肾上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)药物刺激的反应的曲线图；图2D是描述细胞接种的子宫植入组织对电场刺激(100v；1ms)的反应的曲线图；图2E是描述细胞接种的子宫植入组织对卡巴胆碱(CA)和阿托品(AT)药物刺激的反应的曲线图；图2F是描述细胞接种的子宫植入组织对脱羟肾上腺素(PE)和酚妥拉明(PL)药物刺激的反应的曲线图；图3A是表示植入1、3、和6个月后，子宫细胞接种构造的最大张应力的曲线图；和图3B是表示植入1、3、和6个月后，子宫细胞接种构造的最大拉伸应变的曲线图。
详述本发明涉及雌性生殖器官或组织结构的重构，修复，增大或替换。本发明的实际操作采用组织改造方法，包括细胞培养，细胞扩增，在生物基质上进行细胞接种，以及用于进行组织替换的体内构造植入。
为了更容易理解本发明，定义了一些术语这里所用的术语“粘附”是指细胞与三维支架直接粘连，或细胞自身与其它细胞粘附。
这里所用的术语“生物相容性基质”、“生物相容性基底”、“聚合物支架”是指适合植入到受治疗者中、其上面可沉积细胞群体的物质。一旦植入到受治疗者中，生物相容性底物不会引起毒性或有害作用。在一个实施方案中，生物相容性基底是表面可被塑造成需要进行替换的器官的聚合物。所述聚合物还可被塑造成需要进行替换的器官的一部分。在另一实施方案中，生物相容性基底可以是去细胞化的结构。在另一实施方案中，生物相容性基质是一种三维支架，包括生物相容性基质，例如聚乙醇酸的基础结构，或通过除去所有细胞物质而使器官去细胞化后留下的基础结构。这种复合三维支架可提供使细胞与它粘附，并在它上面生长的支持构架。然后，细胞的培养的群体在三维支架上生长，其提供细胞-细胞相互作用所需的精确间隙距离。如此即可提供一种类似体内天然器官的重构器官。这种三维支架是用培养的雌性生殖道细胞的至少一个群体灌注的，该群体生长并发育，从而提供雌性生殖道组织层。在另一实施方案中，所述生物相容性基质是生物可降解的。生物相容性聚合基质的非限制性例子可从下列物质形成，这些物质选自，但不限制于，纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并噁唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烃，聚乙醇酸，聚酰亚胺，聚烯烃，聚噁二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纤维素，聚硅氧烷，脲-甲醛聚合物，及其共聚物和物理混合物。所述聚合基质可用生物相容性及生物降解的定形物质涂覆。在一个实施方案中，定形物质可以是液体共聚物。在另一实施方案中，所述共聚物是聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
这里所用的术语“去细胞化的结构”是指一种三维生物学排列(例如，器官，或器官的一部分)，它是通过除去全部细胞和组织内容物，留下复合基础结构的方法产生的。器官的专门组织结构是提供与器官有关的特定功能的实质。器官的支持纤维网是基质。绝大多数器官都具有由支持专门组织的非专门结缔组织构成的基质构架。去细胞化过程可除去所述的，专门组织留下结缔组织复合三维网。结缔组织基础结构主要由胶原组成。术语“去细胞化的结构”包括除去细胞和组织物质的整个器官。术语“去细胞化的结构”还包括已经除去细胞和组织物质的器官结构的一部分。去细胞化的结构提供了一种上面可灌注不同细胞群体的生物相容性基底。去细胞化的结构可以是刚性、或半-刚性的，具有改变它们形状的能力。例如，去细胞化的子宫能够使子宫扩张，但在生产后即恢复到它的原始形状。去细胞化的结构的例子包括，但不限制于，去细胞化的子宫、阴道、子宫颈、卵巢、和输卵管。
这里所用的术语“雌性生殖器官”和“雌性生殖组织”包括与生殖有关的所有器官或组织。这些包括但不限于阴道、子宫、卵巢、输卵管、和子宫颈。
在这里交换使用的术语“雌性生殖细胞群体”和“雌性生殖细胞”是指源于雌性生殖系统任何部位的细胞。雌性生殖系统包括能够使雌性产卵(卵细胞)、性交、营养和受精卵着床直到它完全发育、并生产的器官。雌性生殖细胞群体可来源于如阴道、子宫颈、子宫、输卵管、和卵巢器官。该术语用于指代细胞混合物，包括来源于雌性生殖系统的所有细胞。该术语还可用于指代来源于雌性生殖系统其中一个部位的分离的亚群体，例如，只有阴道细胞、上皮细胞、内皮细胞的单一群体。细胞的分离的亚群体可来源于器官的任何部位，例如子宫内膜、子宫肌层、和子宫外膜(见Gray’s解剖学药物和手术的解剖学基础，38th ed.Churchill Livingstone Eds.H.Gray，L.H.Bannister，M.Berry，P.L.Williams 1996)。在一个实施方案中，分离的亚群体是细胞的同种亚群体。在一个实施方案中，雌性生殖细胞群体是指基本为阴道、子宫颈、子宫、卵巢、或输卵管上皮细胞的细胞群体。在另一实施方案中，雌性生殖细胞群体是指基本为平滑肌细胞的细胞群体，例如子宫肌层。雌性生殖系统细胞可通过采集受治疗者的活组织检查样品而得到。雌性生殖系统细胞可来源于干细胞、胚胎干细胞、儿童干细胞、胎儿干细胞、成人干细胞、天然细胞、核移植、及parathenogenesis。细胞分选技术可用于将健康细胞与病态细胞分离开来。细胞分选技术，例如，FACS还可用于分离细胞的亚群体。
这里所用的术语“阴道上皮细胞群体”或“阴道上皮细胞”是指来源于阴道的细胞或雌性阴道的天然细胞。阴道上皮细胞包括子宫内膜细胞。阴道上皮细胞包括复层鳞状上皮细胞。
这里所用的术语“子宫上皮细胞群体”和“子宫上皮细胞”是指来源于雌性子宫的细胞或雌性子宫的天然细胞，包括子宫颈中的所有细胞。子宫上皮细胞包括子宫内膜细胞。子宫上皮细胞包括单层柱状细胞，它可以是纤毛和非纤毛柱状细胞。
这里所用的术语“子宫颈上皮细胞群体”和“子宫颈上皮细胞”是指来源于雌性子宫颈的细胞或雌性子宫下部的天然细胞。子宫颈上皮细胞包括子宫内膜细胞。子宫颈上皮细胞包括柱状细胞和鳞状上皮细胞。子宫颈上皮细胞包括纤毛和非纤毛柱状细胞。
这里所用的术语“输卵管上皮细胞群体”和“输卵管上皮细胞”是指来源于雌性输卵管的细胞或雌性输卵管的天然细胞。输卵管上皮细胞包括子宫内膜细胞。输卵管上皮细胞包括柱状细胞，它可以是纤毛和非纤毛柱状细胞。
在细胞群体同质性范围内，所用术语“基本上”是指超过50％的细胞来源于同一细胞群体，例如，阴道上皮细胞。优选，70％的细胞来源于同一细胞群体。更优选，85％的细胞来源于同一细胞群体，甚至更优选超过95％、96％、97％、98％和99％的细胞来源于同一细胞群体。
这里所用的术语“多层”是指包含多层相互层压的同种培养细胞群体的排列。产生“多层”的方法包括使一层细胞群体沉积在表面，例如生物相容性基底上。将沉积的细胞在生长培养基中培养，直到它们发育并增殖产生具有所需表型和形态学的细胞第一单层。一旦第一单层达到所需的细胞密度，同一细胞群体的第二层在第一单层上沉积。在可供给第二细胞层和第一单层营养的生长培养基中培养第二层沉积的细胞，直到第二层的细胞发育并增殖到所需细胞密度，从而产生具有所需表型和形态学细胞的双层。同一细胞群体的第三层沉积在双层上，在供给双层和第三层细胞营养的生长培养基中培养该细胞，直到第三层的细胞发育并增殖到所需密度，产生具有所需表型和形态学的三层。重复该过程，直到产生含有多层同源细胞群体的多层。多层的特征是它与体内器官等价实质组织的形态学和功能特征非常类似。例如，含有平滑肌细胞群体的多层可能具有阴道或子宫的平滑肌组织，即子宫肌层的功能特征。
这里所用术语“偶联”是指彼此接触的两个不同细胞群体之间的密切相互作用。这些相互作用包括细胞-细胞相互作用、生长、发育、和增殖。负责组织发育、修复和维持的细胞行为很大程度上是通过细胞与它们微环境成分之间的相互作用调节的。这些相互作用是由结合生长因子、酶的细胞表面分子，和诱导应答的其它分子介导的，其导致细胞表型改变。这些相互作用还可导致新细胞的产生，其能够产生具有独特的、不同于各不同细胞群体功能性的细胞物质。
这里所用的术语“嵌合界面”是指在两个不同细胞群体之间形成的边界。
这里所用的术语“间质生物物质”是指细胞物质在嵌合界面上的形成，两种不同细胞群体在嵌合界面上相互接触。广义的术语“间质生物物质”包括当两种或多种不同细胞群体相互接触时，任何新的细胞物质的形成。新细胞物质与在器官的正常体内细胞发育中产生的功能等价细胞物质类似。例如，在人造阴道、输卵管、或子宫的重构中，彼此相互接触的两种不同细胞群体是平滑肌细胞群体，例如，子宫肌层，和上皮细胞群体。在这两个群体的界面上产生的“间质生物物质”因此与粘膜下层的类似。在一个实施方案中，生物相容性基质降解形成粘膜下层。
这里所用的术语“功能等价物”是指一种结构，例如，通过本发明的方法产生的人造器官，它们以和天然器官相同、或相似的方式发挥作用，例如，人造阴道具有与体内阴道相同的功能特性。
这里所用的术语“调节化合物”是指引起细胞活性改变的化合物。这种改变可以是毒性的，例如，诱导会导致流产的过早收缩，或有益的，例如，加强胚胎植入。所述改变可改变细胞功能，例如，诱导收缩、增殖、编程性细胞死亡。所述调节剂还可增加，降低，升高或抑制涉及靶基因或靶蛋白的过程或信号转导级联，从而导致细胞活性改变。
这里所用的术语“个体”是指能够引发免疫应答的任何活的生物。术语个体包括，但不限制于，人，除人以外的灵长类动物，如黑猩猩，和其它猿及猴；饲养动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物，如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如小鼠，大鼠和豚鼠等。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，成年和新生的个体，以及胎儿都包括在内。
本发明提供用于重构人造雌性生殖器官的组合物和方法。人造雌性生殖器官的构造包括将培养雌性生殖细胞的至少一个群体灌注到生物相容性基质中，如此培养的雌性生殖细胞与生物相容性基质粘附，并形成至少一个雌性生殖组织层。培养的雌性生殖细胞的其它群体可与生物相容性基质粘附，并被培养产生人造雌性器官或组织结构。
I.解剖学a.阴道阴道是一种肌管，顺复层鳞状上皮排列，与子宫颈和外阴粘膜在组织学方面类似，并将子宫颈(子宫下部，或子宫)与肌体外部连接在一起。阴道或产道不包括腺或毛囊，但个体细胞、隐窝，可产生粘液。粘液有助于阻止细菌进入子宫，还可在卵子将要受精时，帮助精子进入子宫。表层没有角质化。儿童和绝经后妇女的阴道非常相似，其上皮层薄，容易受损伤并易受各种感染。正常成人的阴道含有类白喉的德得来氏杆菌，和厌氧的链球菌。这种菌丛可将阴道细胞的糖原转化成乳酸，从而维持阴道的酸性pH并促进正常分泌。在月经期，阴道具有被称作皱褶的横襞。绝经后，在无雌激素的情况下，阴道壁变薄并萎缩，反映出缺少雌激素，就像儿童时期所见到的那样。成人阴道的深度为12-13cm。
阴道上皮对激素敏感。随着细胞中糖原的积聚，雌激素可刺激上皮的增殖和成熟。上皮中糖原的存在构成Schiller试验的基础。给上皮提供Lugol’s溶液(强碘)。糖原与碘结合，产生深棕褐色。没有染色(阳性试验)表示异常上皮，如瘢痕组织，柱状上皮(腺病)，和瘤形成或前体损害。然而，孕激素会抑制上皮的成熟。
阴道是一种部分萎陷的管状结构，它从外阴前庭延伸至子宫。前后壁彼此接触，但在尖端，阴道围绕着外子宫颈和穹隆样隐窝，也被称作fornices，将阴道和子宫颈分开。后穹窿比前穹窿更深。尿道和膀胱的基底在阴道的前面，而直肠在它的后面。阴道的血液有两个主要的供给来源子宫和阴部的动脉。内阴动脉从下到上供给阴道。常常是子宫动脉分支的阴道动脉，和子宫动脉自身供给阴道的上部位置。
成年妇女的子宫肌层通常要经历自发的节律性收缩。去生殖腺者的子宫则失去了这种节律收缩性。当雌激素水平较高时，子宫肌层常常会出现肥大，绝经之后出现子宫萎缩。子宫内膜通常可反映雌激素和孕酮的水平。雌激素引起子宫内膜及其血管的增殖。孕酮可将增殖子宫内膜转化成分泌子宫内膜，具有促进可能植入的腺和基质特征。子宫内膜的活组织检查可准确解释卵巢激素的产生。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例1-3所描述的人造阴道。所述人造阴道是正常阴道的功能等价物。该人造阴道包含正常阴道的细胞结构、功能和生理学。人造阴道是如下产生的提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为阴道上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；培养生物相容性基质中的细胞群体。
b.子宫颈子宫颈是子宫的下部。子宫颈是一种用复层鳞状上皮细胞覆盖的纤维肌肉器官。子宫颈的部分阴道开始于在阴道穹窿，并在子宫颈内道入口处的外子宫颈口终止。这种鳞柱接合点是鳞状上皮细胞癌起源的最常见位点。子宫颈内道排列的是柱状上皮，而顺类似上皮排列的葡萄状腺是在纤维肌性基质中发现的。这种腺，如果被阻塞，可在子宫颈表面上形成纳博特氏囊肿。未经产的子宫颈口是圆形的，但生产将其改变为水平方向平坦的口。子宫颈是妇女生殖恶性肿瘤的第二个最常见的位置。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造人造子宫颈。该人造子宫颈是正常子宫颈的功能等价物。该人造子宫颈包含正常子宫颈的细胞结构、功能和生理学。人造子宫颈可如下产生提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为子宫颈上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；培养生物相容性基质中的细胞群体。
c.输卵管输卵管起自子宫侧缘的上部，高于圆韧带的附件，并且是开放的。远端伞部通往腹腔，近端通往子宫腔。输卵管是由单层下柱状上皮排列形成的，有些有纤毛，以分支或叶状方式排列。该结构分为有间隙、峡状、壶腹状、和伞状部分。壁较薄，在阔韧带的上缘内有两层肌肉层和一层腹膜外层。
输卵管上皮还可反映周期性改变、成熟过程中的卵巢激素变化，和退行变化。输卵管肌肉系统具有帮助输卵管转运的内在蠕动作用。某些输卵管细胞纤毛的作用也涉及转运。雌激素似乎可影响这些活性。
输卵管与任何一侧上子宫的上部连接，长约10cm。输卵管是较为狭窄的肌管，可作为卵子从卵巢移动到子宫的通道。每个月在排卵时，由卵巢释放出成熟的卵子。伞部，输卵管末端的边缘，将卵子牵引到输卵管中。每个输卵管是由上百万个被称作纤毛的微毛排列形成的，它们可有节奏地将卵子向前推进。概念上，精子对卵子的授精通常是在输卵管中发生的。然后，受精卵移动到子宫，在那里，它植入到子宫壁。输卵管还可执行其它功能，包括营养腔中的卵子和早期胚胎。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例4中描述的人造输卵管。该人造输卵管是正常输卵管的功能等价物。该人造输卵管包含正常输卵管的细胞结构、功能和生理学。人造输卵管可如下生产提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为输卵管细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；并培养生物相容性基质中的细胞群体。
d.卵巢正常卵巢是白色、杏仁状的结构，大小为2×3×3cm，位于阔韧带的后表面上，在输卵管下方。卵巢可产生卵子(卵细胞)，即雌性的生殖细胞，并产生激素。神经、淋巴管和血管在与阔韧带连接处，即门进入卵巢。卵巢的外侧由漏斗骨盆韧带提供支持，其延伸至骨盆侧壁，中间由子宫-卵巢韧带支持延伸到子宫。卵巢具有皮质和髓质。生殖上皮，一种单层的立方形细胞，覆盖了压缩的纤维组织，白膜。卵泡源于卵巢皮质内，由基础胚胎补体组成；生产后，不再形成新的卵泡。卵巢的髓质部分被血管、淋巴管、神经、和结缔组织占据，含有午非氏体前体的残留物。卵巢是一种内分泌腺和生殖器官。卵泡旁粒层细胞产生雌激素，且在排卵和黄体形成之后，产生孕激素。雄激素是由基质细胞产生的，特别是在门中。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造人造卵巢。该卵巢是正常卵巢的功能等价物。人造卵巢包含正常卵巢的细胞结构、功能、和生理学。
e.子宫子宫是由腺粘膜排列形成的雌性生殖道的肌器官，其具有专门的血管形成。这种中空的梨形器官位于膀胱和直肠间插入的骨盆腔中。没有怀孕的妇女子宫长度约为8cm，重30-100g。输卵管和子宫颈管与子宫腔连接，子宫腔是由子宫内膜排列形成的。膨胀的上部被称作体。体的肌肉非常发达，因此可扩张容纳正在发育的婴儿。靠近两根输卵管与子宫连接处的区域常被称作基底。除了下面的前部之外，子宫基底被腹膜覆盖，在那里，膀胱与下面的子宫部分邻接，腹膜显现出来，并与阔韧带的襞侧面连接。基底下面的收缩部分被称作峡，其下面有一个被称作子宫颈的圆柱形部分。该器官从内到外各层分别为粘膜(子宫内膜)，肌层(子宫肌层)，和绒膜(子宫外膜)。血清雌二醇和孕酮水平的波动可引起所有这三层经历连续的结构性周期改变。子宫是由骨盆内筋膜和纤维肌肉组织在阔韧带基础上的侧面压缩支持的。圆韧带提供侧面支持，子宫膀胱襞提供前面的支持。
子宫内膜大约5mm厚，但会随着漱素周期而变化。该层是由凹入形成管状子宫腺的分泌单层柱状上皮排列形成的。某些有纤毛的柱状细胞还可被发现作为上皮的一部分。子宫内膜由上层功能组成，其在每次月经过程中脱落。营养表面子宫内膜中大量毛细血管床的卷曲或螺旋状动脉可供给两层的血管形成。虽然腺和腔的上皮彼此邻接，且通过光学和电子显微镜观察，在形态学方面类似(Davies等，Am.J.Ahat.137(4)423-445(1973)；Davies等，Am.J.Ahat.142(3)335-365(1975))，但它们对激素刺激的反应不同。
子宫上皮是由静止和增殖亚群体组成的，其对雌激素和孕酮表现出不同的增殖反应(Conti等，Endocinology 114(2)345-351(1984))。施用雌激素导致静止腺细胞重新回到细胞循环中，并降低腔细胞损失的速率。孕酮可通过缩短腺和腔中的细胞周期长度来诱导增殖速率加速(Nawaz等，Am.J.Pathol.127(1)51-59(1987))。
子宫内膜基质类似间充质，包含具有大量卵形核的星形细胞。由于蜕膜转化，据信基质细胞在植入和妊娠维持方面起作用，这是通过胚泡的营养、内分泌腺分泌(催乳激素)，和胚胎保护而达到的。子宫肌层由4层组成。由于复杂的互连束，这些层不能很清楚地分开，它们上面散布有大量结缔组织。这4层很容易识别粘膜下层包括具有纵纤维的粘膜下的薄层。血管层包含很多大型血管，可赋予它海绵状的外观，纤维是圆形、斜的。血管上层的纤维主要是圆形、纵向的。绒膜下层由较薄的纵肌肉层组成。腹膜由单层的扁平细胞组成，其围绕在输卵管和子宫周围。该薄层还可起神经和血管上的鞘的作用。围绕在子宫周围并侧面伸向骨盆壁的腹膜部分被称作子宫外膜(Baez和Atala，“Uertus”，组织工程学方法Academic Press 2002(1189-1194)。
供给阴道、子宫、输卵管和卵巢的动脉血通过4对动脉卵巢动脉，子宫动脉，阴道动脉，和内阴动脉。子宫、子宫颈、和上部阴道位于膀胱的后面，其通过膀胱子宫襞与子宫分开。在该腹膜襞下，膀胱通过蜂窝组织与子宫颈和上部阴道连接。
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于构造实施例5和6中描述的人造子宫。该人造子宫是正常子宫的功能等价物。该人造子宫包含正常子宫的细胞结构、功能、和生理学。该人造子宫可如下生产提供一种生物相容性基质，将第一细胞群体灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中，第一细胞群体基本为子宫上皮细胞群体，将细胞类型不同于第一细胞群体的第二细胞群体，例如平滑肌细胞，灌注在生物相容性基质上或生物相容性基质中；并培养生物相容性基质中的细胞群体。
(f)雌性生殖系统的功能生殖年龄的雌性重复经历间隔约为1个月的激素活性周期。每个周期，妇女的肌体都要准备可能的妊娠。术语月经是指子宫内层的周期性脱落。平均月经周期约为28天，发生下列阶段卵泡期，排卵期(排卵)，和黄体期。有4种主要的激素、即可刺激或调节细胞或器官活性的化学品，涉及月经周期促卵泡激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)，雌激素和孕酮。
第一期，卵泡期，在月经周期的第一天开始，即月经开始那天。在此期间，促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)是由位于脑基底的垂体释放的。这些激素在血液中移动至卵巢。在那里，该激素刺激大约15-20个卵子的生长，每个卵子都位于其各自的卵泡中。卵泡是一种小的充满液体的囊泡，可容纳卵子并支持负责卵子生长和营养卵子的细胞。FSH和LH还可使卵泡增加雌激素的产生。
随着雌激素水平在自然月经周期中的升高，垂体产生较少的FSH。激素的平衡可使肌体限制完全成熟的卵泡数。随着卵泡期的发展，一个卵巢中一个卵泡变得更占优势，并继续成熟。该占优的卵泡抑制所有其它的卵泡，终止其生长并退化。发育中的卵泡可产生其自身的激素，包括雌激素。
第二期，排卵期，或排卵，是月经周期的中点，通常在妇女下一次月经周期开始前约2周。在此期间，雌激素的升高引发LH从垂体大量释放。从而引起占优的卵泡自卵巢释放其卵子。随着卵子的释放，其被称作排卵，它被输卵管末端的手指样突出(伞部)捕获。伞部将卵子集中到输卵管中。还是在此期间，妇女的子宫颈粘液增加，其准备接受和营养男人的精子(雄性生殖细胞)。粘液还可帮助精子通过子宫颈管移动。
第三期，黄体期在排卵后立即开始。一旦它释放其卵子，空的卵泡就会发育成被称作黄体的新结构(因此称作黄体期)。黄体分泌雌激素和孕酮。孕酮为子宫准备植入受精卵所需的丰富内层。如果卵子已经由男人的精子授精，那么受精卵(胚胎)将通过输卵管移动，从而植入到子宫中，并进行妊娠。如果卵子没有受精，它就会穿过子宫。无需支持妊娠，子宫内层损坏并脱落，下一个月经周期开始。
II.生物相容性基底在本发明的其中一方面，所述人造雌性器官借助于支持结构，如聚合结构，生物相容性基质，或去细胞化的器官。
a.聚合结构生物相容性基底是指对生物功能没有毒性或损伤作用的物质。可生物降解是指可被患者肌体吸收或降解的材料。可生物降解材料的例子包括，例如，可吸收的缝线。用于形成可生物降解结构的代表性材料包括天然或合成的聚合物，例如，胶原、聚(α酯)如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚原酸酯和聚酐以及它们的共聚物，其以可控速率通过水解而被降解并重吸收。这些物质提供可降解性，易处理性，大小和构型的最大控制。优选的可生物降解聚合物材料包括聚乙醇酸和聚polygalactin，它们可被研制成可吸收的合成缝线材料。聚乙醇酸和聚polygalactin纤维可由制造商提供使用。其它生物降解材料包括纤维素醚，纤维素，纤维素酯，氟化聚乙烯，酚醛聚合物，聚-4-甲基戊烯，聚丙烯腈，聚酰胺，聚酰胺酰亚胺，聚丙烯酸酯，聚苯并噁唑，聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟代烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚噁二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚，聚三唑，聚氨酯，聚乙烯基化合物，聚偏二氟乙烯，再生纤维素，聚硅氧烷，脲-甲醛，或这些物质的共聚物或物理混合物。所述物质可用适宜的抗菌剂浸渍，并用彩色添加剂着色，从而提高可见度并有助于手术过程。
在某些实施方案中，细胞与聚合物的粘附是通过用化合物，如基膜成分，琼脂，琼脂糖，明胶，阿拉伯胶，胶原，如I，II，III，IV，和V型胶原，纤连蛋白，层粘连蛋白，糖胺聚糖，其混合物，和其它具有与细胞培养领域技术人员已知的生物基质分子类似性质的亲水和肽粘附物质涂覆聚合物而提高的。所有聚合物必需满足为随后生长和增殖的细胞提供适宜支持所需的机械和生化参数。此外还可将因子，包括营养物，生长因子，分化或去分化的诱导剂，分泌产物，免疫调制剂，炎症抑制剂，退行因子，提高或使淋巴网或神经纤维向内生长的生物活性化合物，和药物掺入到基质中或与基质联合提供。同样，还可合成含有肽，如附着肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物用于形成基质。
在一个实施方案中，生物相容性聚合物是polyglactin和聚乙醇酸。Polyglactin被研制成可吸收的合成缝线材料，一种乙交酯和丙交酯的90∶10共聚物，由Vicryl制造的编织可吸收缝线(EthiconCo.，Somerville，N.J.)(Craig P.H.，Williams J.A.，DavisK.W.等Polyglactin 910与聚乙醇酸合成可吸收缝线的生物学比较，Surg.141；1010，(1975))。Polyglactin和聚乙醇酸纤维可由制造商提供使用。生物相容性聚合物可使用下列方法成型，如，溶剂浇铸，压模，缝合，拉丝，形成网眼，沥滤，编织和涂覆。在溶剂浇铸法中，可将一种或多种聚合物溶于适当溶剂，如二氯甲烷中的溶液浇铸为分支模型浮雕结构。溶剂蒸发后，获得一层薄膜。在压模法中，以30,000磅/平方英寸的压力将聚合物压成适当的形状。拉丝法包括自熔融的聚合物拉丝，形成网眼包括通过将纤维压缩成毡样材料而形成网状物。在沥滤法中，将含有两种物质的溶液涂成与基质最终形状接近的形状；接着，用溶剂溶解其中一种成分，导致孔的形成。(见Mikos，US 5,514,378，其引入此处作为参考)。在成核作用中，使基质形状的薄膜与放射性裂变产物接触，建造放射性损害物质的轨迹。在一个实施方案中，生物相容性基质可以是由纤维组成的可生物降解聚合物网。
聚碳酸酯板可用酸或碱蚀刻，将放射性-损害物质的轨迹变成孔。最后，使用激光成型，并穿过多种物质灼烧出单个的洞，形成具有均匀孔径的基质结构。涂覆是指用物质，如液态共聚物(聚-D，L-丙交酯共-乙交酯(PLGA，50∶50)80mg/ml二氯甲烷或氯仿(5％w/v))涂覆或渗透聚合结构，从而改变其机械性能。涂覆可以一层或多层进行，直到获得所需的机械性能。这些成型技术可联合使用，例如，可将聚合基质编织、压模并胶粘在一起。
此外，可将通过不同方法成型的不同聚合材料连接在一起，形成复合形状。复合形状可以是层状结构。例如，可将聚合基质与一种或多种相同或不同组成的聚合基质粘附在一起，形成多层假体阴道结构。粘附可通过任何适宜的方法进行，如用液体聚合物胶粘、装订，缝合、或这些方法的组合。此外，聚合基质还可形成实心的块状物，并利用激光或其它标准机械技术成型为所需的终形式。激光成型是指使用激光除去材料的方法。
聚合物可使用机械性能，如拉伸强度和应力来表征。
在优选实施方案中，使用聚乙醇酸(PGA)作为生物材料。PGA已经广泛用于组织改造。PGA支架可很容被处理成各种三维结构，并为细胞的支持和转运提供最佳方式(Christenson L，Mikos AG，Gibbons DF等用于组织改造的生物材料概述，Tissue Eng.3(1)71-73；讨论73-76页，1997)。如实施例2和3所示，已经成功在PGA构造上共同培养了阴道上皮和平滑肌细胞。实施例5和6举例说明PGA可用于建造人造子宫。
在植入之前、用培养的细胞涂覆生物相容性基底之前或之后，可用因子，如血管生成因子、细胞因子、胞外基质成分、和其它生物活性物质或药物处理生物相容性基底，例如，从而在植入后促进新组织的形成和促进移植物愈合。还可将因子，包括药物掺入到生物相容性基底中，或与生物相容性基底联合提供。生长因子和其它添加剂(例如，表皮生长因子(EGF))，血管内皮生长因子(VEGF)，肝素-结合表皮-样生长因子(HBGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，细胞因子，基因，蛋白等)可以超出这种生长因子的任何量(如果加入的话)加入，如果使用的是加入的细胞，可通过在聚合基质上接种细胞而产生。优选这种添加剂的量足以促进新的雌性器官形成，如促进新的阴道组织形成。其它有用的添加剂包括抗细菌和抗真菌剂，以通过抑制感染而促进愈合。
一种优选的支持基质是由交叉丝组成的，一旦植入细胞支持基质，其可通过使营养物穿过较短距离扩散而使细胞存活。
可将生物相容性基质制成具有可控的孔结构，使营养物从培养基到达沉积的细胞群体，但防止培养的细胞穿过孔迁移。在体外，细胞粘附和细胞存活力可使用扫描电子显微镜、组织学以及放射性同位素定量评估而测定。
生物相容性基质可被制成任何数量的所需构型，从而满足任何数量的整个系统，几何或空间限制。例如，在使用聚合基底构造雌性生殖器官时，可将基底制成与器官，例如阴道或子宫的全部或一部分一致的维数和形状。生物相容性基质可被制成不同的大小，从而与不同大小患者的阴道或子宫一致。聚合基底还可被制成满足患者的特殊需要，例如，具有不同腹腔空间的残疾患者可能需要重构适合该空间的阴道或子宫。
在其它实施方案中，生物相容性基质用于处理肌体中的层状结构，如输卵管。在那些应用中，所述聚合基底可被制成中空的管。
b.去细胞化的结构生物结构，例如，整个器官，或器官的一部分可通过除去器官的全部细胞和组织内容物而被去细胞化。在其中一个实施方案中，去细胞化的雌性生殖器官或组织，如阴道、子宫、输卵管、和子宫颈可用于本发明中。去细胞化的方法包括一系列连续的提取。这种提取方法的其中一个重要特征在于可避免阻碍或破坏生物结构的复杂基础结构的粗提。第一步包括除去细胞碎片，并溶解细胞膜。接着溶解核的胞质成分，一种核成分。
优选，生物结构，例如器官，是使用温和的机械破裂方法，通过除去器官周围的细胞膜和细胞碎片而去细胞化的。所述温和的机械破裂方法必须是以破坏细胞膜。然而，去细胞化的方法应避免损害或阻碍生物结构的复杂基础结构。温和的机械破裂方法包括刮擦器官或组织的表面，振摇器官或组织，或在适宜体积的液体，例如蒸馏水中搅动器官或组织。在一个优选实施方案中，温和的机械破裂方法包括在适宜体积的蒸馏水中搅动器官或组织，直到细胞膜破裂，且已经除去器官的细胞碎片。在另一实施方案中，器官或组织暴露于低渗条件下，从而使血细胞溶解，而保留细胞基质。
除去细胞膜后，再除去生物结构的核及胞质成分。这可在不使基础结构破裂的情况下，通过溶解细胞及核成分而进行。为了使核成分溶解，可使用非离子型洗涤剂或表面活性剂。非离子型洗涤剂或表面活性剂的例子包括，但不限制于，Triton系列，从Rohm and Haas ofPhiladelphia，Pa.商购，包括Triton X-100，Triton N-101，TritonX-114，Triton X-405，Triton X-705，和Triton DF-16，可从多家销售商购得；吐温系列，如单月桂酸酯(Tween 20)，单棕榈酸酯(Tween40)，单油酸酯(Tween 80)，和聚氧乙烯-23-十二烷基醚(Brij.35)，聚氧乙烯醚W-1(Polyox)等，胆酸钠，脱氧胆酸盐，CHAPS，皂苷，正癸基β-D-吡喃葡萄糖苷，正庚基β-D吡喃葡萄糖苷，正-辛基α-D-吡喃葡萄糖苷和Nonidet P-40。
本领域的技术人员应认识到，属于上述分类和销售商的化合物描述可商业获得，并在“化学分类，乳化剂和洗涤剂”，McCutcheon′s，Emulsifiers and Detergents，1986，North American andInternational Editions，McCutcheon Division，MC PublishingCo.，Glen Rock，N.J.，U.S.A.和Judith Neugebauer，A Guideto the Properties and Uses of Detergents in Biology andBiochemistry，Calbiochem.R.，Hoechst Celanese Corp.，1987中找到。在优选实施方案中，非离子型表面活性剂是Triton系列，优选Triton X-100。
非离子型洗涤剂的浓度可根据所要去细胞化的生物结构类型而改变。例如，对于柔弱的组织，例如血管而言，应降低洗涤剂的浓度。非离子型洗涤剂的优选浓度为约0.001-约2.0％(w/v)。更优选，约0.05-约1.0％(w/v)。甚至更优选约0.1％(w/v)-约0.8％(w/v)。这些的优选浓度范围约0.001-约0.2％(w/v)，特别优选约0.05-约0.1％(w/v)。
细胞骨骼成分，包括密集的胞质丝网，胞间复合物和尖端微细胞结构可使用碱性溶液，如氨水溶解。包括铵盐或其衍生物的其它碱性溶液也可用于溶解细胞骨骼成分。其它适宜铵溶液的例子包括硫酸铵，醋酸铵和氨水。在优选的实施方案中，使用氨水。在一个实施方案中，温和碱是氢氧化物或非氢氧化物碱。非氢氧化物碱的非限制性例子包括醋酸，苯甲酸，丙酸和苯酚的铵或钠盐或它们的衍生物。氢氧化物碱的非限制性例子包括氨水，三甲铵氢氧化物，三乙铵氢氧化物，一乙醇铵氢氧化物，和苄铵氢氧化物。
碱性溶液，例如氨水的浓度，可根据所要去细胞化的生物结构的类型而改变。例如，对于柔弱的组织，例如输卵管而言，应降低洗涤剂的浓度。优选的浓度范围是约0.001-约2.0％(w/v)。更优选，约0.005-约0.1％(w/v)。甚至更优选约0.01％(w/v)-约0.08％(w/v)。
去细胞化的器官可通过本领域已知的任何方式脱水，如烘焙，冷冻干燥，低压升华干燥法(lyphylization)。去细胞化的器官可在脱水过程中被固定在元件上。
去细胞化的、脱水的结构可在适宜的温度下贮藏，直到需要使用。使用前，可将去细胞化的结构在适宜的等渗缓冲液或细胞培养基中平衡。适宜的缓冲液包括，但不限制于，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，生理盐水，MOPS，HEPES，Hank’s平衡盐溶液等。适宜的细胞培养基包括，但不限制于，RPMI 1640，Fisher’s，Iscove’s，McCoy’s，Dulbecco’s培养基等。
III.培养细胞组织改造可为攻克缺少局部组织的疾病提供一种解决方法。在实验室中，自表型正常的自体衍生细胞成功建造预制器官可导致正常的功能发展。在实施例2和3中，本发明的方法和组合物可用于证实体外培养的阴道细胞可用于体内建造重构的、能生长发育的阴道组织。
本发明描述用于雌性器官重构的组合物和方法。通常，本发明提供含有至少2种不同细胞群体的多细胞器官。该器官构造包括源自第一细胞群体的细胞第一培养群体，和源自不同于第一细胞群体的第二细胞群体的细胞第二培养群体，其中第二细胞群体通过嵌合界面与第一细胞群体偶联，产生一种构造，该构造是天然生物结构的功能等价物。
本发明还提供使用器官形状的生物相容性基底生产人造雌性器官的方法，即在生物相容性基底的一个区域上建造源自第一细胞群体的细胞第一培养群体，使第一培养细胞群体与生物相容性基底粘附；建造源自不同于第一细胞群体的第二细胞群体的细胞的第二培养细胞群体，使第二细胞群体通过嵌合界面与第一细胞群体偶联，这样所述构造在植入后，可提供天然生物结构的功能等价物，由此产生人造雌性器官构造。
(a)细胞采集大量容易获取的组织来源的可用性对于涉及动物模型和组织改造的任何实验设计的成功是必需的。重构的人造雌性器官可以是同种异体的，细胞群体源自受治疗者的自身组织。例如，阴道上皮细胞可源自受治疗者阴道并在体外培养。
重构的人造雌性生殖器官还可以是异种的，细胞群体源自不同于受治疗者的哺乳动物种类。例如，所述的不同的细胞可源自哺乳动物，如猴，狗，猫，小鼠，大鼠，母牛，马，猪，山羊和绵羊的器官。
这种器官可通过适宜的活组织检查或在尸体解剖后获得。尸体器官可用于提供内皮细胞和元件。分离的细胞优选通过活组织检查从受治疗者获得的自体细胞。例如，手臂，前臂，或下肢骨骼肌的活组织检查样品，或皮下注射少量利多卡因进行局部麻醉区域的平滑肌活组织检查样品，并在培养时扩增。活组织检查可使用活组织检查针，一种快速作用的针获得，从而使过程快速且简单。然后按照实施例所述，扩增并培养骨骼肌或平滑肌的较小活组织检查核心。源自亲缘关系或相同物种其它供体的细胞也可在适当的免疫抑制下应用。
子宫内膜细胞可从子宫活组织检查样品或子宫切除样品获得。应当将活组织检查样品立即转移到运送培养基DMEM/P-12(Dulbecco改进的Eagle培养基，含有Ham’s F-12营养培养基)中。4℃时，直径超过2cm的活组织检查样品可在该培养基中保持可见达3天。在实施例部分中，新西兰白兔是阴道组织的极好来源，它可通过在采集组织过程中较好暴露的简单、中线、经腹方法采集。兔子的阴道具有充足的大小和周长，可在每次过程中，产生极好的组织。将采集的样品运送到实验室的无菌培养基中，开始分离各组织层的过程。
(b)细胞分离和培养Freshney，Culture of Animal Cells.A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，1987，Ch.9，pp.107B126和Fauza等(1998)J.Ped.Surg.33，7-12讨论了用于分离和培养细胞的方法将其引入此处作为参考。细胞还可使用本领域技术人员已知的技术分离。例如，组织或器官可被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，削弱相邻细胞之间的连接，从而将组织分散成单个细胞的混悬液，而不会使细胞破裂。醇离解可通过切碎组织，并用任意数量的消化醇单独或联合处理切碎的组织而完成。这些包括但不限制于胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白醇，和分散酶。机械破裂也可通过各种方法完成，包括但不限制于，剖擦器官的表面，使用研磨机，搅拌器，筛网，匀浆器，压榨细胞，或insonators等。组织解聚技术的概述见Freshney，(1987)，Culture of Animal Cells.A Manual of BasicTechnique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126。
优选的细胞类型包括，但不限制于，子宫上皮细胞，子宫肌细胞，阴道上皮细胞，子宫颈上皮细胞，输卵管上皮细胞，子宫上皮细胞，卵巢上皮细胞和平滑肌细胞。在优选实施方案中，人阴道上皮细胞和平滑肌细胞是分开的。在其它实施方案中，人子宫颈上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在其它实施方案中，人输卵管上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在其它实施方案中，人卵巢上皮细胞和平滑肌细胞是分离的。在另一优选实施方案中，人子宫上皮细胞和子宫肌细胞是分离的。
一旦已经将组织分解成单个细胞的混悬液，那么可将混悬液分离成亚群体，从而获得细胞元件。这一点还可使用细胞分离的标准技术来完成，包括但不限制于，特殊细胞类型的克隆和选择，多余细胞的选择性破坏(消极选择)，基于混合群体中不同细胞可凝集性的分离，冻融过程，混合群体中细胞的不同粘着性，过滤，常规的区带离心，离心淘析(反流离心)，单位重力分离，逆流分布，电泳和荧光活化细胞分选(见，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.AManual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168页)。例如，内皮细胞可通过荧光活化细胞分选而富集。
(c)细胞扩增分离的细胞可体外培养，从而增加可注入到三维支架中的细胞数。同种异体细胞，更优选自体细胞的使用可防止组织排斥。然而，如果在植入重构的人造器官后，受治疗者出现了免疫应答，那么可用免疫抑制剂，如环孢菌素或FK506治疗受治疗者，从而降低排斥的可能性。在某些实施方案中，可将嵌合细胞，或转基因动物的细胞灌注到三维支架上。
在涂覆基因物质前，可转染分离的细胞。有效的基因物质可以是，例如，能够减少或消除宿主免疫应答基因序列。例如，可抑制细胞表面抗原，如I类和II类组织适合性抗原的表达。从而减少移植细胞被宿主排斥的机会。此外，转染也可用于基因送递。在灌注到三维支架中前，阴道上皮细胞可用特殊的基因转染。人造重构器官可携带宿主或重构人造器官长期存活所需的基因信息。
在生物相容性基质上生长的雌性生殖道细胞可被基因工程改造产生对移植有益的基因产物，例如，抗炎因子，例如，抗-GM-CSF，抗-TNF，抗-IL-1，和抗-IL-2。可选择性地，内皮细胞可被基因工程改造为“敲除”促进炎症的天然基因产物，例如GM-CSF，TNF，IL-1，IL-2的表达，或“敲除”MHC的表达，从而降低排斥的风险。此外，内皮细胞还可被基因工程改造用于基因疗法中，调节患者的基因活性水平，帮助或改善组织移植结果。
用逆转录病毒载体，聚乙二醇对细胞进行基因工程改造的方法，或本领域技术人员已知的其它方法都可使用。这些包括使用表达载体，其可转运并在细胞中表达核酸分子。(见Geoddel；Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))。
经由常规的转化或转染技术，可将载体DNA引入到原核生物或真核生物细胞中。转化或转染宿主细胞的适宜方法可见Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，和其它实验室教科书。
细胞在三维支架中的生长可通过加入，或用蛋白(例如，胶原，弹性纤维，网状纤维)，糖蛋白，糖胺聚糖(例如，硫酸类肝素，软骨素-4-硫酸盐，软骨素-6-硫酸盐，硫酸皮肤素，硫酸角蛋白等)，细胞基质，和/或其它物质涂覆三维支架而提高。
在将雌性生殖道细胞灌注或铺层后，应将三维支架在适宜的营养培养基中培养。很多商购的培养基，如RPMI 1640，Fisher培养基，Iscove培养基，McCoy培养基，Dulbecco培养基等都适合使用。还应当定期更换培养基，从而除去使用过的培养基，减少释放的细胞，并加入新鲜的培养基。重要的是，使雌性生殖道细胞生长至雌性生殖道组织层发育的阶段。
可将生长因子和调节因子加入到培养基中，从而提高，改变或调节培养物中的增殖和细胞成熟及分化。细胞在培养物中的生长和活性可受到各种生长因子，如胰岛素，生长激素，生长调节素，集落刺激因子，红细胞生成素，表皮生长因子，肝红细胞生成因子(hepatopoietin)，和肝细胞生长因子的影响。调节增殖和/或分化的其它因子包括前列腺素，白介素，和天然存在的抑素。
本发明在生物相容性基质上生长的细胞在多层中生长，该多层可形成类似体内生理条件的细胞基质。具有至少一层雌性生殖组织层的三维支架可支持不同类型细胞的增殖和众多其它不同组织的形成。在其中一个实施方案中，其中一个细胞群体可以是内皮细胞群体。血管生成是一种新血管发育的过程，且在雌性生殖周期，例如，排卵，月经和胎盘发育中起重要作用。内皮细胞群体可用于刺激血管形成。
当人造重构的雌性生殖器官被用于体内移植或植入时，它可优选从将要接受移植或植入的个体获得雌性生殖细胞，例如，阴道上皮细胞和平滑肌细胞。该方法可能对于移植和/或移植物抗宿主痰病的免疫排斥特别有利。
一旦灌注在生物相容性基质上，雌性生殖细胞将在基质上增殖并发育，形成雌性生殖组织层。在体外培养过程中，雌性生殖细胞发育并分化，产生雌性生殖组织层，它能够支持其它细胞的生长并产生具有与体内类似结构相似形态学的结构。所产生的雌性生殖组织的生理学类似正常雌性生殖组织的生理学。例如，人造雌性器官对激素敏感。
青春期时，下丘脑增加促性腺激素释放素(GnRH)的释放。然后垂体前叶产生促性腺激素，促卵泡成熟激素(FSH)和促黄体素(LH)，由GnRH和卵巢激素雌激素和孕酮控制。FSH刺激卵泡的发育。LH引起排卵。这些促性腺激素刺激性激素、雌激素和孕激素的产生。促性腺激素与卵巢激素的相互作用可控制生殖周期。促黄体素(LH)的突然增加致使成熟的卵泡释放卵子。卵子释放后，破裂的卵巢卵泡发育成黄体，然后分泌雌激素和孕酮。这些卵巢激素对于子宫内膜内层的维持非常重要，胚泡本身即植入在子宫内膜内层。在一个实施方案中，人造雌性生殖器官是能够对激素作出反应的人造子宫。在另一实施方案中，人造子宫能够对性激素作出反应并产生性激素，如雌激素和孕酮。在另一实施方案中，人造子宫能够激素调节周期事件，例如，构造并使子宫内膜内层脱落，使子宫准备接受受精胚胎。在另一实施方案中，人造子宫能够植入胚泡并支持正在生长的胎儿。人造子宫可被植入到自体受治疗者中。例如，可从植入人造雌性器官的同一受治疗者培养细胞。在另一实施方案中，人造子宫可用于支持同种受治疗者外部的胎儿生长。因此，人造子宫可用于支持胎儿在体外生长。可选择性地，人造子宫可被植入到异种受治疗者中。
在另一实施方案中，人造阴道具有与正常阴道类似的、对激素和感觉刺激的反应。人造阴道的细胞能够产生粘液。人造阴道包括对激素敏感的阴道上皮。雌激素可刺激阴道上皮的增殖和成熟，而孕激素则抑制上皮的成熟。人造阴道能够收缩。
在另一实施方案中，人造输卵管类似正常输卵管的生理学。人造输卵管对激素敏感，且能够蠕动。人造输卵管能够将卵子从卵巢运送到子宫，而且是精子对卵子授精的位置。
培养时，再建造体内细胞微环境对于重构特定的雌性生殖器官而言非常重要。体内使用前，雌性生殖细胞的生长程度可根据所重构的雌性生殖器官类型而改变。
在一个实施方案中，在灌注培养的雌性生殖道细胞，例如阴道上皮细胞之前，可用例如胶原对三维支架进行预处理，从而提高雌性生殖道细胞与三维支架的粘附。在另一实施方案中，可向支架或雌性生殖细胞中加入各种因子，它们选自营养物，生长因子，细胞因子，胞外基质成分，分化诱导剂，分泌产物，免疫调制剂，可提高或使细胞网或神经纤维生长的生物活性化合物。
可使用放在三维支架一定位置的针将培养的雌性生殖道细胞灌注到生物相容性基质中，或铺层到支架上。在将其放到支架中，或支架上以前，通过体外培养到所需的细胞密度而使雌性生殖道细胞扩增。实施例2和3证实本发明如何用于体内建造重构阴道组织。实施例5和6证实本发明如何用于体内建造重构子宫组织。培养的上皮和平滑肌细胞类型可维持正常的表型表达，并繁殖成一个适合组织替换的大细胞库。细胞接种的聚合物支架将形成管状化的阴道和子宫组织，它们具有与天然阴道和子宫类似的表型和功能性。本发明可用于获得临床使用的管状化改造的阴道、子宫、输卵管和子宫颈组织。
(d)组织加工和细胞培养按照本领域已知的方法加工并培养组织。在优选实施方案中，使用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)进行若干次洗涤循环。可将样品放在干净的培养基贮器中，直到开始显微解剖的过程。
各种商业制造的培养基都可用于上皮和平滑肌细胞的生长。在优选实施方案中，平滑肌细胞使用补充了10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM/FBS)，而阴道上皮细胞(keratinocytes)是在专门用于keritinocytes的没有血清的培养基中生长的，其中补充了牛垂体的提取物和表皮生长因子(K-SFM)。
很多技术都可用于分离并培养上皮细胞，例如，子宫内膜细胞，这些技术包括基于酶消化和机械离解的方法(Watson等，J Reprod.Fertil.101(2)415-420(1994)；Akoum等，J.Reprod.Med.41(8)551-561(1996)；Barberini等，Cell Tissue Res.190(2)207-222(1978)；Bentin-Ley等，J.Reprod.Fertil.101(2)327-332(1994))。同源细胞群体可在其中细胞基本为单一细胞群体的情况下建造。在优选实施方案中，上皮和平滑肌细胞分开生长，各细胞类型的分离包括外植法或酶消化中的任一方法。这些方法的描述见下列参考文献，将其整体引入此处作为参考Williams等，Methods Mol.Biol.5139-149(1989)；Baez，C.E.和Atala，A.“Uterus”InMethods of Tissue Engineering.Academic Press1189-1194(2002)；De Filippo，R.E.和Atala，A.“表皮细胞培养阴道细胞重构”，Methods of Tissue Engineering.AcademicPress 273-275(2002)。
在一个实施方案中，外植法用于分离细胞。外植法开始先在环路放大的条件下，用无菌器械小心地进行显微解剖，分离上皮和血清肌肉层。在一个实施方案中，将阴道去管状化(detubularizing)成扁平节段，从而有助于解剖。将组织的一小部分单独放在培养皿上，使它们干燥并与表面粘附。37℃下，将组织切片与适宜培养基在空气和5％CO2中培养，直到足量的祖代细胞集落自组织岛发育，这通常要花费大约5-7天。外植体可通过轻轻吸出而除去，定期替换培养基以维持细胞。
在另一实施方案中，酶消化用于分离细胞。培养的雌性生殖道细胞很容易通过将作为细胞来源的适宜器官或组织解聚而分离。这可使用本领域那些技术人员已知的技术进行。例如，组织或器官可被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，减弱相邻细胞之间的连接，从而能够将组织分散成单个细胞的混悬液，而没有明显的细胞破裂。酶解离可通过切碎组织，并用任意数量的消化酶单独或联合处理切碎组织而完成。这些包括，但不限制于，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胶原酶，弹性酶，和/或透明质酸酶，DNA酶，链霉蛋白酶和分散酶。机械破裂也可通过各种方法完成，包括但不限制于，使用研磨机，搅拌器，筛网，匀浆器，压榨细胞，或insonators等(见，例如Freshney，(1987)Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.9，pp.107-126)。
在一个实施方案中，酶消化法已经用于加工和培养上皮细胞。上皮细胞的挑剔性有时使它们很难大量生长。然而，使用酶消化已可成功获得大量集落。在优选实施方案中，将粉末形式的IV型胶原酶和分散酶，一种中性蛋白酶结合，并用K-SFM混悬。然后将这种胶原酶-培养基溶液过滤，以确保无菌。将阴道、子宫、子宫颈、或输卵管样品切成若干较大的碎片，浸入到酶溶液中，用力振摇。轻轻吸出，将细胞-流体混悬液转移到另一无菌试管中，低速旋转离心。最后，除去上清液，将细胞颗粒状物重悬浮在培养基中并分配到培养皿中。
(e)细胞扩增可使用本领域熟知的细胞扩增法。在一个实施方案中，细胞的传代是通过先除去培养基，然后用PBS-EDTA洗涤细胞而进行的。用胰蛋白酶-EDTA溶液培养细胞，并在显微镜下监测，直至观察到细胞分离。将细胞-胰蛋白酶溶液轻轻吸到无菌试管中，该无菌试管中装有含血清的培养基，从而灭活胰蛋白酶。将细胞低速旋转离心。用新鲜培养基把细胞颗粒状物重悬浮至预定体积，将它们等分到若干培养皿中进行扩增。
IV.细胞特征描述将组织分解为单个细胞的混悬液后，将混悬液分级成亚群体，从中获得雌性生殖道细胞。可获得同源细胞群体，其中每个细胞群体基本含有相同的细胞，例如阴道上皮细胞群体。这还可使用细胞分离的标准技术进行，这些技术包括但不限制于，特定细胞类型的克隆和选择，多余细胞的选择性破坏(消极选择)，基于混合群体中不同细胞可凝集性的分离，冻融过程，混合群体中细胞的不同粘着性，过滤，常规的区带离心，离心淘析(反流离心)，单位重力分离，逆流分布，电泳和荧光活化的细胞分选(见，例如Freshney，(1987)Culture ofAnimal Cells.A Manual of Basic Techniques，2d Ed.，A.R.Liss，Inc.，New York，Ch.11和12，137-168页)。例如，平滑肌细胞可通过荧光活化细胞的分选而富集，上皮细胞可被分解用于平滑肌细胞的收集。
细胞可通过使用特殊的分化标记来描述。子宫内膜上皮的标记包括角蛋白中间丝，胞质内糖原，孕酮受体，和雌激素受体(Centola等，In Vitro 20(6)451-4612(1984)；Cooke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(7)2109-2113(1986)；Johnson等，Biol.Reprod.61(5)1324-1330(1999)；Kirl等，14(8)651-662(1978)；Merviel等，Biol.Cell.53(3)636-646(1995)；Osteen等，Fertil.Steril.52(6)965-972(1989)；Schatz等，Biol.Reprod.62(3)691-697(2000).细胞角蛋白中间丝(Bongo等，Hum.Reprod.3(6)705-713(1988)；Classen-Linke等，Cell Tissue Res.287(1)171-185(1997)；Gerschenson等，Pathol.Res.Pract.174(3)285-296(1982))最常用于特性描述。
在优选实施方案中，细胞可用细胞特异性抗体描述。即把细胞转移到分室载玻片上培养，用4％缓冲甲醛固定，并加工。使细胞与施加到细胞表面的抗原-特异性初级抗体接触。细胞特异性抗体的非限制性例子是广泛反应性抗-细胞角蛋白和抗-平滑肌α-肌动蛋白抗体。阴性对照可用普通血清代替初级抗体处理。阳性对照由接触抗原的细胞组成。用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤后，用生物素化的次级抗体培养分室载玻片，并再次洗涤。加入底物后，还可加入过氧化物酶试剂，在抗体沉积处见到棕色沉淀物。复染色可用Gill’s苏木精进行。
可使用本领域熟知的任意类型的分子特性描述。在优选实施方案中，使用目标区域抗体，利用蛋白质印迹分析进行分子水平的细胞特性描述。例如，单克隆抗体α-肌动蛋白，肌球蛋白，和细胞角蛋白AE1/AE3可用于比较体外培养的细胞和对照组的蛋白表达，从而证实上皮和平滑肌细胞系的维持。将细胞在冷的溶解缓冲液中匀化，收集可溶性蛋白的上清液。可使用本领域已知的任何蛋白定量方法。例如，BioRad DC蛋白测定试剂盒可用于量化蛋白样品。将等浓度的蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶上分离，4℃下使用初级抗体作为探针杂交过夜。过氧化物-接合的抗-小鼠次级抗体是复合的，可用增强的化学发光系统检测。还可相伴进行聚合酶链反应，以进一步限定细胞类型。
V.多层a.在去细胞化的结构上形成多层在一个实施方案中，不同的培养的细胞群体可用于在生物相容性基质或去细胞化的结构，例如去细胞化的器官，或器官的一部分上产生不同的多层。使用在去细胞化的器官三维基础结构一定位置包埋的针将第一同源细胞混悬液灌注到去细胞化的结构中。灌注的细胞在基础结构的三维空隙间分布并生长，产生包裹基础结构的细胞层。灌注第一同源细胞混悬液后，37℃下在培养基中培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以产生与去细胞化的器官基础结构粘附的培养的细胞第一群体的单层。一旦建立了单层，再次将第一同源细胞混悬液灌注到单层上的去细胞化的结构中。培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以在第一单层上产生细胞的第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生第一同源细胞群体的多层。
第一多层与体内器官等价实质组织的功能性和形态学类似。例如，对于去细胞化的子宫而言，第一细胞群体是平滑肌细胞群体。将平滑肌细胞混悬液灌注到子宫，阴道，输卵管或子宫颈中，直到形成平滑肌组织的多层，其具有与子宫，阴道，输卵管或子宫颈的平滑肌组织(即子宫肌层)类似的功能性。
建造第一多层后，使用不同于第一细胞群体的第二培养细胞群体建造第二多层。将第二同源细胞群体的细胞混悬液灌注到去细胞化的器官的第一多层上。灌注的细胞沿着第一多层分布，培养去细胞化的器官，直到第二细胞群体的细胞发育并增殖成第一单层。一旦建立了第一单层，再次将第二同源细胞群体灌注到第一单层上的去细胞化的结构中。培养去细胞化的器官，直到细胞发育并增殖，以在第一单层上产生第二单层，由此产生双层。重复该过程，直到产生第二同源细胞群体的第二多层。
第二多层与体内器官等价实质组织的功能和形态性类似。例如，子宫，阴道，输卵管或子宫颈的第二多层是上皮多层，其与子宫，阴道，输卵管或子宫颈的上皮组织(即，粘膜)的形态和功能性类似。
本领域技术人员应认识到可产生很多异源多层，从而建造人造雌性生殖器官。每个多层都包含多层同源细胞群体，但该多层的细胞群体是不同的。在一个实施方案中，人造器官包括至少约5个多层。在另一实施方案中，人造器官包括至少约4个多层。在另一实施方案中，人造器官包括至少约3个多层。在优选实施方案中，人造器官包括至少约2个多层。
嵌合界面是在两个或多个异源多层彼此相互接触的地方产生的。从而使未受阻的相互作用在多层的细胞之间发生。不同细胞群体之间的广泛相互作用导致间质生物物质的产生，其不同于多层的各层。因为两个不同细胞群体之间的相互作用没有受到结构屏障，如生物相容性基底(例如，聚合物)的阻碍，因此嵌合界面上的细胞可恢复更自然的形状和构型。通过在嵌合界面提供更有益于体内器官的微环境，嵌合界面的细胞更自然地发育并产生生长因子和其它蛋白，促进正常的分裂和分化。这可导致间质生物物质的产生，提供独特的生物和功能性，从而建造更类似体内那些器官的人造器官。例如，平滑肌多层与人造子宫，阴道，输卵管或子宫颈上皮多层的相互作用产生一个嵌合界面，从而导致产生类似体内子宫，阴道，输卵管或子宫颈粘膜下层的细胞层。粘膜下层提供与平滑肌细胞和上皮细胞相比独特的功能性，其中当完全发育时，粘膜下层可为平滑肌细胞供给血液。
本领域的技术人员应认识到，当含有不同细胞群体的两个或更多异源多层相互作用时，所产生的任何间质生物物质都在本发明的范围之内。所产生的不同间质生物物质取决于异源多层中的细胞类型。
在一个实施方案中，可将附加胶原层加入到去细胞化的结构的内表面，从而建造平滑表面，如国际PCT
发明者A·M·D·阿塔拉, J·J·尤 申请人:儿童医疗中心有限公司