通过金属离子亲和层析法的肽纯化的制作方法

专利名称：通过金属离子亲和层析法的肽纯化的制作方法
技术领域：
本发明尤其涉及通过固定化金属离子亲和层析法的肽的分离和纯化领域，所述肽特别为多肽，如重组蛋白。
背景技术：
重组(基因工程化)肽包括寡肽和多肽，特别是人类和动物中倾向于治疗用途的蛋白，其生产的一个重要部分是所述肽的纯化，以至达到足够高水平的纯度，尤其是使得所需蛋白基本上不含污染物，其中的污染物特别带有(a)在生产过程(典型的，发酵过程或使用适当微生物的选择或基因修饰菌株的类似方法)中可能出现的任何外源蛋白和(b)在生产过程中可能被引入的不希望的金属离子(特别是重金属离子)。
固定化金属离子亲和层析法(IMAC)是利用许多生物聚合物所表现出来的与金属离子在亲和力上的差别的一种通用分离方法。这种技术包括在表面预先被多齿配体化学修饰的固体载体基质上合适的金属离子的螯合。所得的固定化金属离子螯合复合物从而具有与相作用的蛋白表面上一个或多个电子供体基团配位的潜力(Sulkowski，E.Trends in Biotechnology，3(1985)1-6；Porath，J.，Carlsson，I.，Ols-son，1.and Belfrage，G.，Nature，258(1975)598-599；Kagedal，L.，in″Protein Purification″(Ed.，J.C.Janson，和L. Ryden)，VCHPublishers(1989)pp.227-251；Zachariou，M.和Hearn，M.T.W.，Bio-chemistry，35(1996)202-211)。分离选择性是基于吸附的蛋白/固定化金属离子复合物在热力学稳定性中的差别而实现的。吸附复合物最不稳定的蛋白最先被洗脱，同时，形成更稳定复合物的蛋白较后被洗脱。平衡结合常数的差别越大，即各个蛋白/固定化金属离子配位复合物之解离常数(KD)的差别越大，就越能获得高解析度。因此，氨基酸组分、特定氨基酸残基的表面分布，还有蛋白质构象在决定蛋白对于特定IMAC体系的亲和力中均起到重要作用。结果，就电荷、分子大小和氨基酸组成成分而论具有非常相似性质的，但是三级结构具有差别的蛋白就可以被分辨。
在过去20年中所有关于IMAC的使用的研究都围绕着临界硬度的第一行过渡金属离子(见下文)，如Cu2+、Zn2+和Ni2+的应用。这些金属离子证明了过渡金属离子对于所有芳香族和脂肪族胺类，还有羧酸(酯)官能团的稳定常数，如logβ值在5-10之间(Wong，J.W.，Alright，R.L.和Wang，N.H.L.，Separation and Purification Methods，20(1991)49-57；Zachariou，M.，Traverso，I.，Spiccia，L.和Hearn，M.T.W.，Journal of Physical Chemistry，100(1996)12680-12690)。许多显示出与M2+离子结合性质的自由三齿螯合物可以以化学方法固定到载体材料上。尽管它们关于相应logβ值大小的局限性和它们造成的相对较低的选择性能力，螯合化合物的自由类型如亚氨二醋酸(IDA)构成了所述IMAC研究中至今所用的螯合配体的要素类型[参见，如Kagedal，L.，in″Protein Purification″(Eds.J.C.Janson和L.Ryden)，VCH Publishers(1989)pp 227-251]。基于固定化M2+-IDA的IMAC体系的使用的例证应用包括使用固定化Cu2+-IDA对来自发芽小麦中α-淀粉酶的纯化[Zawistowska，U.，Sang ster，K.，Zawistowski，J.，Langstaff，J.和Friessen，A.D.，Cereal Chemistry，65(1988)5413-5418]；和使用固定化Zn2+-IDA对来自人类血浆中的人类凝固因子VII[Weeransinghe，K.M.，Scully，M.F.和Kadder，V.V.，Biochimica Biophysica Acta，839(1985)57-65]和α1-巯基蛋白水解酶[Otsuka，S.和Yama naka，T.(Eds)，″Metalloprotein-ChemicalProperties and Biological Effects″in″Bioactive Molecules″，KodanshaLtd，Tokyo(1988)，pp 18-45]的纯化。基于IDA的IMAC方法的使用的扩展，就是使用固定化Ni2+-氨基三乙酸(Ni2+-NTA)[Hochuli，E.，Bannwarth，W.，D_beli，H.和Stuber，D.，BiolTechnology，6(1988)1321-1324](NTA是IDA的结构同系物)对重组蛋白的纯化，依赖于在多核苷酸序列(相应于多组氨酸肽，典型的六-组氨酸)的基因水平的加入，其赋予蛋白结合到固定化Ni2+-NTA螯合复合物上的高亲和力，从而使蛋白被选择性的滞留在IMAC吸附剂上。本申请中，术语“吸附剂”和“吸附剂”主要用于表示一种带有配位结合的金属离子的官能化聚合物底物(带有经固定于其上之配体的聚合物底物)，但这些术语偶尔也被用于表示没有金属离子与其结合的官能化聚合物底物。
根据基于IDA和基于NTA的IMAC体系应用的上述描述，一种改变蛋白与IMAC体系结合选择性的替代方法是通过螯合配体的结构变化。然而在最近几年中，仅引入了少数新的IMAC螯合配体。这些包括了基于如下的体系二齿螯合剂氨基异羟肟酸(AHM)和8-羟基喹啉(8-HQ)[Zachariou，M.，Traverso，I.，Spiccia，L.和Hearn，M.T.W.，Journal of pHysical Chemistry，100(1996)12680-12690]；对Ca2+的亲和力高于IDA的羧甲基氨基丁二酸(CM-ASP)[Porath，J.，Trends in Analytical Chemistry，7(1988)，254-256；Mantovaara，T.，Pertofz，H.和Porath，J.，Biotechnology Applied Biochemistry，11(1989)，564-569]；正磷酸丝氨酸(OPS)，由于磷酸基的参与其能螯合“硬”金属离子如Fe3+、Al3+、Ca2+和yb3+[Zachariou，M.，Traverse，I和Hearn，M.T.W.，Journal of ChromatograpHy，646(1993)，107-115]；和其它三齿配体配体，如(2-吡啶基甲基)氨基乙酸酯(CPMA)，二吡啶甲基胺(DPA)和顺式或反式羧甲基脯氨酸[Chaouk，H.，Middleton S.，Jackson W.R.和Hearn，M.T.W.，IntemationalJournal of BioChromatogra phy，2(1997)153-190；Chaouk，H.和Hearn，M.T.W.，Joumal of Biochemical and Biophysical Re-searchMethods，39(1999)161-177]；四齿配体，如氨基三乙酸(NTA)[Hochuli，E.，Bannwarth，W.，Dobeli，H.，Gentz，R.和Stuber，D.Bio/Technology，6(1988)1321-1325]，由于它们的四齿性质，与IDA型三齿配体相比，丧失了一个配位点因而显示出低蛋白结合常数，从而对M2+离子的亲和力高于IDA；和五齿配体，如四亚乙基五胺(TEPA)[Hidaka Y.，Park，H.和Inouye，M.，FEBS Letters，400(1997)238-242]或N，N，N′-三(羧甲基)乙二胺(TED)[Porath，J.，PnteinExpression&Purification，3(1992)263-281]，其通过五个供电子原子配位金属离子(即，对TEPA而言，其中的伯胺基团的2个氮原子和仲胺基团的3个氮原子；和对TED而言，其中的仲胺基团的2个氮原子和来自3个羧酸基团的3个氧原子)。
已经发现当在层析法中使用较温和的洗脱条件时，固定化金属离子亚氨二醋酸螯合(im-Mn+-IDA)体系有金属离子的明显泄漏[Oswald，T.，Hornbostel，G.，Rinas，U.和Anspach，F. B.，Biotechnology Applied Biochemistry，25(1997)109-115；Kagedal，L.in protein Purification(eds.J.C.Janson and L Ryden)VCHPublishers，New York(1989)，pp 227-251]。因此，除选择性调整之外，为了获得相比较于目前使用的基于IDA或基于NTA体系在金属离子稳定常数上有显著增长的螯合物新类型的开发已经成为一种必需[Zachariou，M.，Traverso，I.，Spiccia，L.和Hearn，M.T.W.，Analytical Chemistry，69(1996)813-822]。
发明概述令人惊奇的发现，在“融合蛋白”形式中所需蛋白的金属离子配位结合的强度和/或选择性可以显著增加，方法是利用含有至少一个环状、金属离子配位配体基团的官能团官能化的聚合物底物，所述底物作为待与所述融合蛋白发生结合的一种或多种金属离子的基质，其中“融合蛋白”除目标蛋白的多肽链以外，(作为所需蛋白本身氨基酸序列的延伸)还包括掺入一个或多个适当位置的、能与金属离子形成配位键的氨基酸残基的共价结合寡肽链(有时术语称为“标记”)。一般来说，相比较于外源蛋白，融合蛋白与这些基质结合的强度和/或选择性显著加强，因此有利于融合蛋白从含有融合蛋白以及一种或多种外源蛋白组成的混合物中的分离和离析。
本发明的第一个方面是要提供一种用含有至少一个环状、金属离子配位配体基团的官能团官能化的聚合物底物，其中的配位配体基团含有至少三个独立地选自N、O和S的金属离子配位供电子原子。本发明的第二个方面涉及一种如下类型的官能化聚合物底物，其进一步含有与官能团中至少一个环状配体基团配位的金属离子。本发明的其它方面包括这些官能化聚合物底物的制备方法。
本发明的另一重要方面涉及非常适合作为“标记”掺入本发明上下文所述的融合蛋白中的寡肽；所述类型的融合蛋白，含有在目标蛋白的氨基端或羧基端或两端上或作为替代在目标蛋白内部氨基酸序列的位置内融合至少一个上述寡肽的目标蛋白；编码所述融合蛋白的多核苷酸构建体，如载体；含有所述多核苷酸构建体的宿主细胞；所述类型的融合蛋白的制备方法，其中后一类型的宿主细胞在融合蛋白表达条件下在生长培养基中培养，然后将融合蛋白从培养基中回收；和纯化目标蛋白的方法，其中用含有所述融合蛋白(包括目标蛋白)和其它蛋白(外源蛋白)的蛋白样品与根据本发明的含金属离子的官能化聚合物底物接触。

发明内容
如上所述，本发明的第一个方面涉及用含有至少一个环状、金属离子配位配体基团的官能团官能化的聚合物底物，该环状配体基团含有至少三个独立地选自N、O和S的金属离子配位供电子原子。通常来讲，环状配体基团中金属离子配位供电子原子中的至少一个，优选两个，更优选所有三个是环原子，即形成环状、金属离子配位配体基团的环的一部分。
本发明上下文中有用的聚合物底物包括水溶性聚合物和基本上水不溶性聚合物，可以在聚合材料的很大范围内进行选择。关于这点的实例如下所述。
多糖类及其衍生物，包括琼脂糖类，葡聚糖类，纤维素类，半纤维素类，淀粉类，木糖类等，以及这些多糖的衍生物。通常，适合的多糖衍生物包括所述多糖的羟基某些部分衍生以形成醚类(例如低级烷基醚类，如甲基醚类)或酯类(例如低级羧酸酯类，如醋酸酯，丙酸酯等)的衍生物，还有如下衍生物，其中起始多糖材料或其衍生物已用适当的交联剂处理而交联。
一般来讲，本发明中基于基本上水不溶性聚合物的官能化聚合物底物为例如非常适合用于填入色谱柱的，用于直接引入培养基的(分批发酵用途)等等，和非常适合于本发明上下文中的应用类型的多糖类，包括琼脂糖类、葡聚糖类及其衍生物，这样的许多种适合类型都非常容易购买到。例如，由Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典生产的，以商品名为SepharoseTM出售的，可用等级包括SepharoseTM2B，4B和6B的许多种琼脂糖产品。这些各种等级的琼脂糖经交联的衍生物(用2，3-二溴丙醇对SepharoseTM进行交联)也可由相同的公司提供，分别以商品名为SepharoseTMCL-2B、CL-4B和CL-6B，SepharoseTM4和6 Fast Flow，SepharoseTM6MB，和SuperposeTM6和12出售。
许多适合本发明上下文中使用的基于葡聚糖的或葡聚糖-琼脂糖组分材料也可由Amersham Pharmacia Biotech提供，商品名为SephadexTM、SuperdexTM(如SuperdexTM30、75和200)和SephacrylTM。SephadexTM类产品通过用表氯醇交联葡聚糖制得，并具有以下等级SephadexTMG-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150和G-200，，交联度随G数目的增加而减少。SephacrylTM类产品用N，N′-亚甲基双丙烯酰胺交联烯丙基葡聚糖制得，包括SephacrylTMS-100，S-200，S-300，S-400，S-500和S-1000；后面六种产品的孔径和粒度分布之范围有差别。SuperdexTM类产品通过用不同组分的琼脂糖衍生物交联烯丙基葡聚糖制得。
聚亚烷基二醇类及其衍生物，包括，特别是，聚乙二醇类(PEG)，即通式为HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH或H(OCH2CH2)nOH，典型的具有平均分子量为200至6000的乙二醇缩聚物。PEG类中的许多(包括平均分子量分别为400，600，1500，4000和6000的PEG)由多种商业渠道以不同的名称出售(如MacrogolTM，PEGTM，CarbowaxTM，NycolineTM，Pluracol ETM，Poly-GTM，Polyglycol ETM，SolbaseTM)。PEG类通常可溶于水或能与水混和，也能溶于乙醇和许多其他有机溶剂，包括芳香烃。类似的聚丙二醇类[通式为H(OC3H6)nOH]，其中低分子量的能溶于水，也与本发明上下文相关。所述聚亚烷基二醇类的相关衍生物包括部分醚化的衍生物，如端羟基中的一个转变为低级烷基醚基团，如甲醚基的衍生物。
所述的聚合物易于被固定到载体材料上，产生可随后被活化的底物，然后由根据本发明方法用大环金属离子结合螯合配体官能化或衍生化。
聚乙烯聚合物类，包括聚乙烯醇类及其衍生物，所述聚乙烯醇类即为通常通过聚乙酸乙烯酯的多种分子量部分水解(″醇解″)，典型的通过碱或酸水解制得的羟基聚合物类。″醇解″度可以变化方法是允许聚乙酸乙烯酯中的乙酸酯基水解的开始到基本完成，或通过在所需醇解度时停止。市售的聚乙烯醇类通常在四种分子量范围内，即约250,000-300,000(称作超高粘度)，约170,000-约220,000(称作高粘度)，约120,000-150,000(称作中粘度)和约25,000-约35,000(称作低粘度)。通常，聚乙烯醇类的分子量越低，它们的水敏感性或易溶于水性就越高；然而，醇解度在聚乙烯醇类的水溶性和其它性质方面也起作用。所有上述列举范畴中的聚乙烯醇类以及，例如，它们的醚衍生物，如甲基醚衍生物均包括在本发明中。
其它目的聚乙烯聚合物材料包括如用于培养基和低压液相色谱的多孔的半硬质球形凝胶颗粒ToyopearlTMHW类材料。所述材料，经活化和官能化/衍生化后，为用于本发明上下文中相关的IMAC吸附剂的制备提供了另一个选择。ToyopearlTMHW凝胶(可来自TosohCorp，Yamaguchi，日本和其它供应商)由排他性的含有C、H和O原子的亲水乙烯基聚合物合成。所供级别(颗粒和孔径不同)包括ToyopearlTMHW-40，HW-40C，HW-40F，HW-40S，HW-50，HW-50F.HW-50S，HW-55，HW-55F，HW-55S，HW-65F，HW-65S和HW-75F.。
聚丙烯酰胺类及其衍生物，包括基于聚丙烯酰胺和琼脂糖的材料，如UltrogelTMAcA凝胶(Amersham Pharmacia Biotech提供的珠状复合聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶)。Uttrogel AcA凝胶类包括AcA 22，AcA34，AcA 44和AcA 54，，其中的数字表示丙烯酰胺和琼脂糖的百分数，即AcA 22含有2％丙烯酰胺和2％琼脂糖。这些载体材料中羟基的活化提供了制备IMAC吸附剂的途径。
表面改性的二氧化硅类，包括经缩水甘油丙氧基改性的多孔二氧化硅，如LiChroSpherTMDiol(E.Merck，Darmstadt，德国)，ToyosodaTMTSKSW3000(Tosoh Corp.，Yamaguchi，日本)；经氨丙基改性的二氧化硅，通过(在适合的催化剂存在下)氨丙基二乙氧基硅烷与具有适当孔径和适当平均直径的二氧化硅类反应制得；和巯基丙基二氧化硅，通过(在适合的催化剂存在下)巯基丙基二乙氧基硅烷与具有适当孔径和适当的平均直径的二氧化硅反应制得。另外，具有适当孔径和适当平均直径的葡聚糖改性或丁二烯-乙烯共聚合物改性的二氧化硅类能用作色谱载体材料。适于衍生化和随后的改性以产生各自新的IMAC吸附剂的″裸露的″多孔二氧化硅类能容易的从许多供应商获得，包括E.Merck，(Darmstadt，德国)，Tosoh Corporation，Yamaguchi，日本)，Eka-Nobel AB(Gteborg，瑞典)和Grace DavisonGmbH(Worms，德国)。
表面改性的金属氧化物，包括经缩水甘油丙氧基改性的多孔氧化锆、二氧化钛或氧化铝，还有它们基于各自的金属氧化物并用第二金属氧化物“掺杂的”的改性体/变体；经氨丙基改性的氧化锆、二氧化钛或氧化铝，其通过(在适合的催化剂存在下)氨丙基二乙氧基硅烷与具有适当孔径和适当平均直径的氧化锆、二氧化钛或氧化铝反应制得；和经巯丙基改性的氧化锆、二氧化钛或氧化铝，其通过(在适合的催化剂存在下)巯丙基二乙氧基硅烷与具有适当孔径和适当平均直径的氧化锆、二氧化钛或氧化铝反应制得。另外，经葡聚糖改性或丁二烯乙烯共聚物改性的具有适当孔径和平均直径的氧化锆、二氧化钛或氧化铝能被用作色谱载体材料。适于衍生化和随后的改性以产生各自新的IMAC吸附剂的″裸露的″多孔氧化锆、二氧化钛或氧化铝能容易的从许多供应商获得，包括YMC Co.Ltd.(Kyoto，日本)，GraceGmbH(Worms，德国)和BioSepra Corp.(Paris，法国)。
本发明上下文中非常适合的聚合物底物包括琼脂糖类、葡聚糖类及其衍生物，如选自上述所列的材料。
本发明的一个方面，根据本发明的官能化聚合物底物中的环状、金属离子配位配体基团是杂环基团，其中至少三个金属离子配位供电子原子存在于具有至少六个环原子的环中。在所述官能化聚合物底物中，杂环基团的特别适合的类型看来是从具有至少六个环原子的三氮杂环烷类衍生而得的，这类的官能化聚合物底物中官能团(如上定义的)的优选类型是具有通式(I)的官能团通式(I) 其中n是0或1至3的整数；每个三氮杂环烷环中的每个a、b和c，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，为1至3的整数；每个三氮杂环烷环中每个-CH2-基团中的一个或所有氢原子，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以用取代基任选地和独立地取代；每个三氮杂环烷环中每个-NH-基团中的氢原子，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以用取代基任选地取代；当n为0时，R是H或取代基；当n为1时，即所述官能团含有两个三氮杂环烷环，R是连接(即互相之间共价键合)两个三氮杂环烷环的双官能基团，该双官能基团任选地含有一个或多个金属离子配位供电子原子；当n为2或3时，即所述官能团分别含有三个或四个三氮杂环烷环，R分别是连接(即互相之间共价键合)三个或四个三氮杂环烷环的(n+1)-官能团，(n+1)-官能团任选地含有一个或多个金属离子配位供电子原子；和X是连接/间隔基团。
与本发明的后一方面相关的是，取代如上定义的通式(I)的官能团中环-CH2-基团和/或环-NH-基团中的氢原子的上述任选取代基适当地选自任选的经取代的低级烷基基团和任选的经取代的芳基基团；取代如上定义的通式(I)的官能团中环-CH2-基团中氢原子的任选取代基的又一例子包括任选经取代的低级烷氧基。所述低级烷基、低级烷氧基或芳基上的任选取代基可以任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子，特别是一个或多个N、O或S供电子原子。
作为取代一个或多个环-N-基团中氢原子的任选取代基的低级烷基基团(甲基，乙基，丙基等等)，与具有确定金属离子[特别是“硬”金属离子或“临界硬度”的金属离子(见下文)，如Ca2+，Mg2+，Fe3+或Zn2+]官能团的金属离子配位性质可能相关联的其上的含氧取代基，包括羧基/羧酸根(-COOH/-COO-，依赖于pH)，环N原子上所述取代基的例子是羧基取代的低级烷基基团，特别是羧甲基(-CH2COOH)(更特别的是相应的去质子化形式，即-CH2COO-)。相似的，在附加于一个或多个环N原子的低级烷基基团上作为取代基的相关含N基团包括氨基取代的低级烷基基团，特别是2-氨乙基(-CH2CH2NH2)或3-氨丙基(-CH2CH2CH2NH2)。
作为取代一个或多个环N原子上氢原子的任选取代基的其它相关类型，其与某些金属离子[特别是“硬”金属离子或“临界硬度”的金属离子(见下文)，如Ca2+，Mg2+，Fe3+或Zn2+]官能团的金属离子配位性质可能相关联，包括-PO3H2，(或它们的去质子化形式，如-PO3H-)。
本发明上下文中所用的术语″低级烷基基团″是指具有1到6个碳原子的任何线性的(直链)、支链的或环状烷基基团。线性烷基基团的例子有甲基，乙基，丙基，丁基，戊基和己基；支链烷基基团的例子有异丙基，仲丁基，叔丁基，异戊基和异己基；环状烷基基团的例子有环丙基，环丁基，环戊基和环己基。一般来讲，本发明上下文中适合的低级烷基基团具有1到3个碳原子。
本发明上下文中所用的术语“低级烷氧基基团”是指具有1到6个碳原子的任何线性的(直链)、支链的或环状烷氧基基团。线性烷氧基基团的例子有甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，戊氧基和己氧基；支链烷氧基基团的例子有异丙氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，异戊氧基和异己氧基；环状烷基基团的例子有环丙氧基，环丁氧基，环戊氧基和环己氧基。一般来讲，本发明上下文中适合的低级烷氧基基团具有1到3个碳原子。
本发明中术语“芳基”是指任何芳香族基团，包括碳环和杂环芳香族基团。它们的例子有苯基，萘基，吡啶基，四唑基，噻唑基，咪唑基，吲哚基，喹啉基，嘧啶基，噻二唑基，吡唑基，噁唑基，异噁唑基，噻吩基，呋喃基或噁二唑基。本发明上下文中，芳基上适合的任选的取代基包括卤素，氨基，羟基，低级烷基和低级烷氧基。
术语“卤素”是指氟，氯，溴或碘。
与如上定义的通式(I)的官能团中的环-CH2-基团和/或环-NH-基团上的任选取代基相关的取代基包括杂环中含有一个或多个氮、氧或硫原子的杂环芳族基团。此外，与如上定义的通式(I)的官能团中的环-CH2-基团和/或环-NH-基团上的任选取代基相关的取代基还包括杂环中含有一个或多个氮、氧或硫原子的饱和杂环基团；通常N-杂环基团是非常适合的。上下文中相关的饱和杂环基团的例子包括2-吖丙啶基(aziridyl)，2-和3-氮杂环丁烷基(azetidyl)，2-和3-吡咯烷基，2-，3-和4-哌啶基等等。在所述饱和杂环基团中可以任选的存在一个或多个取代基，例如如上定义的低级烷基，低级烷氧基或卤素。
上下文中所用的术语“金属离子配位供电子原子”是指原子，特别是氮、氧或硫原子，其存在于出现的基团/取代基中，能与本发明上下文中相关的金属离子形成配位键(络合键，供体键)。本发明上下文中特别感兴趣的金属离子是如下定义的(见下文)“硬”“软”和“临界”金属离子(许多过渡金属离子和某些非过渡金属离子)。
如上定义的通式(I)的官能团中的连接或间隔基团X可以是连接或间隔基团的任何适合的类型，但典型的是衍生自双官能有机化合物(如具有选自如羧基、巯基、氨丙基、卤素和环氧基的至少两个活性官能基的有机化合物)的一个，衍生方法是其中的双官能有机化合物，在一方面，与聚合物底物上的适当的活性官能团反应，在另一方面，与环状、金属离子配位配体基团上的适当的活性官能团(典型的为氨基或经取代的氨基)反应。本发明上下文中一般非常有用的连接或间隔基团X类型是可衍生自表氯醇的一种，方法是其卤素端与如所述聚合物底物表面上的例如羟基反应，然后其表氧基与环状配体基团中的氨基或经取代的氨基的反应。这些在实施例122中的路线8中进行图示(见下文)。
本发明的多方面中，本发明的官能化聚合物底物中的聚合物底物是琼脂糖或琼脂糖衍生物(如SepharoseTM凝胶)，金属离子配位官能团是通式(I)所示的类型，如上所述，含有1到4个三氮杂环烷环(即n为0，1，2或3)，如含有1，2或3个三氮杂环烷环的官能团。每个所述的三氮杂环烷环可以非常适合的为1，4，7-三氮杂环壬烷-1-基基团[即衍生自1，4，7-三氮杂环壬烷(tacn)]，即其中参数a，b和c[参见通式(I)]的值均为2。
当官能团仅含有一个所述环(即n＝0)，则基团R适当的为氢，当官能团含有两个所述环(即n＝1)，R非常适当的选自如下之中-[CH2]m-，其中m为2，3或4， 和
或其经取代的衍生物，相关任选的取代基包括上述提及的那些。
当所述官能团含有三个所述环时(即n＝2)，R适合的是下述基团或它们经取代的衍生物；同样，相关的任选取代基包括上述提及的那些 当所述官能团含有四个所述环时(即n＝3)，R适合的是下述基团或它们经取代的衍生物；同样，相关的任选取代基包括上述提及的那些 连接或间隔基团X非常适当的是衍生自表氯醇的基团，方法是通过它们与以琼脂糖或琼脂糖衍生物形式的聚合物底物反应，所得产物随后与三氮杂环烷环的与X结合的环-NH-基团反应。
如显然于此披露的，根据本发明分离和纯化所需蛋白(目标蛋白)所使用的材料(官能化聚合物底物)的一个重要特征是材料中的金属离子本身被配位结合到官能团中的环状配体基团(如三氮杂环烷基，如1，4，7-三氮杂环壬烷-1-基基团)上，然后反过来其能够配位结合于(并适当地选择性地)融合蛋白的寡肽“标记”部分氨基酸残基中的供电子原子，其中寡肽″标记″与目标蛋白的氨基酸序列结合。本发明的另一方面涉及上述的官能化聚合物底物，其中官能团中的至少一个环状配体基团具有与它们配位的金属离子。通常，二价(2+-电荷)和三价(3+-电荷)金属离子(包括非过渡金属离子和过渡金属离子)，如选自Ca2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+，Ni2+，Mn2+，Co2+，Fe3+，Al3+和Cr3+的金属离子在上下文中是非常适合的。作为在此公开的操作实施例(见下文)，Cu2+被发现是在本文中最通用的金属离子。
如已经简要指出的，本发明的进一步方面涉及一种制备根据本发明的官能化聚合物底物的方法，该方法包括以下步骤选择具有活性官能团的聚合物底物，该活性官能团能与具有与第一和第二官能团的双官能试剂之第一官能团发生第一次反应；所述的第一次反应导致聚合物底物和双官能试剂之间共价键的形成；所得共价结合试剂的第二官能团随后能与活性官能团发生第二次反应，所述的活性官能团存在于含有环状、金属离子配位配体基团的种类中，其中该配体基团含有至少三个独立地选自N，O和S的金属离子配位供电子原子；第二次反应导致所述种类与共价结合试剂之间共价键的形成；聚合物底物与双官能试剂反应；和所得共价结合试剂与所述种类反应。
根据本发明后面的方法，方法中所用聚合物底物，和所用活性种类中的环状、金属离子配位配体基团，可以选自上述讨论过的根据本发明的官能化聚合物底物。所用的双官能试剂典型的可以是一种双官能有机化合物，如具有选自如羧基、巯基、氨丙基、卤素和环氧基的至少两个活性官能团的有机化合物。表氯醇是对于许多聚合物底物类型，包括多糖及其具有表面羟基的衍生物特别有用的双官能试剂。
如来自上述讨论可知，根据本发明的官能化聚合物底物，含有环状、金属离子配位配体基团的活性种类非常适当的为上述通式(I)中所示类型的官能团(在所得官能化聚合物底物产品中)。
用于本发明方法的适当的活性种类包括下列通式(II)的种类
式(II)参数n，a，b和c的大小和基团R的性质可相应于已经在上述涉及根据关于本发明的官能化聚合物底物中讨论过的那些。而且，每个三氮杂环烷环中每个-CH2-基团中的一个或所有的氢原子，彼此相互独立且独立于任一其它三氮杂环烷环，分别任选的独立的用取代基取代，任选取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子(典型的为N，O和S)。另外，每个三氮杂环烷环中每个-NH-基团中的氢原子，除H*之外，彼此相互独立且独立于任一其它三氮杂环烷环，可以任选的用取代基取代，所述取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子。本发明中任选的取代基适当的选自如上提及的关于通式(I)的官能团。
如前述讨论可知，琼脂糖类和琼脂糖衍生物(如上述提及的SepharoseTM产品)非常适于作为本发明上下文中所述方法的聚合物底物，特别是其与通式(II)的种类结合。非常适合的双官能试剂是表氯醇，更有利的，是进一步加入还原剂(如硼氢化钠)，当聚合物底物与表氯醇反应时在反应混合物中加入。
本发明的范围进一步包括通过上述用于制备官能化聚合物底物的方法获得的或可获得的官能化聚合物底物。
另外，本发明的范围还包括用于制备与本发明一致的官能化聚合物底物的方法，其更进一步含有与其中环状、金属离子配位基团配位的金属离子，该方法包括将根据本发明的官能化聚合物底物与所述金属离子(如上述提及的金属离子中的一种)的无机盐水溶液[如硝酸盐，卤化物(氟化物，氯化物，溴化物或碘化物)，硫酸盐，高氯酸盐，四氟硼酸盐，六氟磷酸盐，或磷酸盐]或有机盐水溶液[如羧酸盐(如甲酸盐，醋酸盐，丙酸盐或苯甲酸盐)，四苯基硼酸盐或磺酸盐]接触。通过所述方法获得的或可获得的含有金属离子的官能化聚合物底物均在本发明范围内。
根据本发明的官能化聚合物底物中的大环、金属离子配位配体选择的标准，以及涉及优选肽标记的位置，结构和特性的标准。
A大环、金属离子配位配体选择的标准上述已经明确指出的是，本发明上下文中所定义的官能化聚合物底物的非常重要和有价值的应用是在蛋白纯化中其含金属离子的实施方案的使用，所述蛋白是融合蛋白的形式，其中目标蛋白在其氨基或羧基端融合了寡肽″标记″，特别是根据本发明的含组氨酸的寡肽。另外，目标蛋白或多肽的两分子同时融合，或可替代地两种不同的目标蛋白或多肽分别与寡肽″标记″，特别是根据本发明的含组氨酸的寡肽在其氨基端或羧基端融合，以产生一种新的融合蛋白结构，籍此寡肽″标记″位于连接目标蛋白或多肽两个分子的桥位(即内部位置)。基于发明者所完成的研究中涉及本发明的结果，发明者相信-不拘泥于特定理论的束缚和限制-本发明中潜在的现象可以被适合的认作″分子盒″，即允许金属离子/配体复合物和作为N端、C端或桥位(endo-position)寡肽″标记″存在于融合蛋白中的补充性寡肽序列之间的分子相互作用，并取决于金属离子/配体复合物分子大小和面取向，以及“标记”的肽序列之内它的同族结合对等物。因此，似乎本发明的官能化聚合物底物中螯合、金属离子结合配体体系，相比较于所有之前描述的螯合体系而言，对通过掺入肽“标记”的重组蛋白的捕获之关键贡献和优点，可能涉及如下至少一个但不仅限于此的特征(a)本发明的螯合配体体系具有非常高的稳定常数(即金属离子结合常数)，超过了基于亚氨二醋酸(IDA)、氨基三乙酸(NTA)等配体所得到的体系；结果，由于缓冲诱导的或蛋白脱除之金属离子泄漏的不利/不良影响将会大大的减少。
(b)本发明的含金属离子之官能化聚合物底物中含金属离子复合物的配位几何形状，不同于已经发现的IDA或NTA螯合配体。从而，对于电荷n+的金属离子(M)，Mn+-IDA或Mn+-NTA(n＝2)的配位几何通常为八面的(参见下示意图1)。
示意图1.图示了带有一般的IDA-或NTA-型螯合配体的Mn+复合物的配位结构的八面排列，其中配体在配位八面体上占有一面。配体的更进一步的排列也是可能的，其中来自羧酸盐基团的两个氧供电原子彼此相互排列(即反式排列)。
然而，与变形的三角形双锥体或正方形锥体相应的配位几何形状也能出现。这就意味着IDA-或NTA-类螯合配体体系能用作自由的螯合体系，从而所能达到的选择性是有限的和不可预知的。还值得一提的是，对于所述螯合配体体系，Cu2+偏向5-或6-配位几何，而Ni2+采取占优势的6-配位结构。相反，例如Mn+-tacn，Mn+-dtne/-dtnp配体体系和如双-，三-和四(tacn)配体体系[其制备和使用在实施例部分(见下文)描述，其在本发明上下文中是非常有用的配体体系]与如Cu2+所采取的配位几何形状，主要是正方形锥体，其中配体上的所有金属离子配位供电子原子在相同的平面，且占据配位多面体的三角形面。对于其它大环配体，如带有两个氮供电子原子和1个氧供电子原子的配体(N2O)，带有2个氮供电子原子和1个硫原子的配体(N2S)，带有1个氮供电子原子和2个硫原子的配体(NS2)，能获得相似的“三角形的”几何形状。另外，双(tacn)(N6)，三(tacn)(N9)和四(tacn)(N12)配体体系采取相似的几何形状。结果，本发明中所用的环状或大环配体体系导致受拘束的和可预知的配位结构，其非常适合于新的固定化金属离子亲和层析体系(IMAC)，并依赖于金属离子、与金属离子相互作用的溶剂化/缓冲液成分的性质，或甚至依赖于肽序列中的氨基酸残基的性质和取向，可给出用于选择优选的肽(寡肽)“标记”结构的原理。
本发明上下文中所用的寡肽“标记”序列的设计和选择指导原则之一，是实际上所有tacn-，双(tacn)-，三(tacn)-和四(tacn)-衍生的金属离子/大环配体复合物和它们结构上相关的类似物和衍生物对于配位点具有三角几何形状，即当与金属离子配位时，事实上所有大环配体均占据金属离子配位多角体上三角形面。这些值得注意的特性已经成为本发明的一个因素，并用于实现结合到寡肽″标记″上(或者对于目标蛋白的肽序列中的氨基酸残基那些物质)超过至今所用的较高专一性/选择性。一旦被发明者认识到，在此披露的本发明开发中结构基本原理即成为一个重要原理。本发明的环状或大环配体体系与先前所用的配体体系关于配位键的排列之间的根本差别是，就环状/大环配体复合物而言，金属离位于大环配体的“折叠”面，导致对于加入的″标记的″蛋白(融合蛋白)的寡肽“标记”的方向一致的接近和取向。结构组织中与先前使用的IDA或NTA体系所述的重要差别的例子通过下述示意图2的排列进行图示(图解了相对于固定化的、含有Mn+之N-羧甲基化的tacn配体，组氨酸残基的加入的咪唑基的取向排列)。
示意图2.八面配位的Mn+离子与N-羧甲基化tacn螯合配体的″折叠″取向排列，显示加入的His残基(作为N-供体)的咪唑基团的接近取向。
N-羧甲基化tacn示例突出了用于控制许多提供给加入的寡肽“标记”的位点和用于调和固定化金属复合物上的全部电荷的进一步可能性，从而对于控制结合相互作用提供了另外的机会。类似结构能被用于其他形成本发明的部分的单环三齿大环，其进一步显示了如下事实，即适当的配体设计和金属离子的结合能控制与加入的寡肽“标记”的结合相互作用。此外，类似的tacn-，双(tacn)-，三(tacn)-和四(tacn)-衍生的金属离子/大环配体复合物和他们结构上相关的类似物和具有侧结合单元的衍生物，如羧甲基、氨乙基、氨丙基等等，也能被用在单核大环配体中，其中两个金属配位位点被用于形成含水合的或水解复合物。例如，示意图3显示了邻二甲苯基-桥合的双(tacn)-类配体的(固定化)二-铜(II)复合物的取向排列，显示在苯环(在邻二甲苯基桥中)和寡肽“标记”或融合蛋白咪唑环(存在于组氨酸残基中)之间的π-电子体系相互结合的额外可能性。侧结构的进一步加入(化学附加一个或多个仲氨基酸基团)，如N-羧甲基、N-氨乙基、N-氨丙基等等单元将提供另外的(依赖于侧臂的电荷状态)能进行金属离子螯合的结构类似物。
示意图3.含Cu2+α，α′-双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)-邻-二甲苯螯合配体的取向排列，显示了在π→π情形中咪唑基团和螯合配体中邻二取代的苯环之间相互作用的显著特征。注意这些双体系提供了来自靶目标蛋白中氨基酸残基可及面所差异显示的的两个供体基团与配体同时互相作用的可能性。另外，这些残基能作为标记的氨基酸序列结构中的一部分存在。这是用于组成本发明一个方面的特定寡肽标记的优选氨基酸序列之设计和选择所需要考虑的情况之一。
在双体系中，关于复合物是否以″开放″形式存在(如示意图3中所示)或以″夹层″形式存在(参见示意图6)的问题(如已发现的一些Ni2+体系)也需要考虑。所述类型的大环配体，特别是双-，三-和四-类配体的非常特殊的特征导致就如下方面而言相灵活(a)对于新加入的寡肽“标记”(或目标蛋白的表面可及氨基酸残基)的接近的几何形状；(b)pH的影响；(c)对寡肽″标记″的结合选择性，所述标记具有就O-和/或N-供电子效应相互作用而言不同的、优选的氨基酸序列；(d)高特异性缓冲离子和所包括的许多大环环单元相互作用的结果。所有特性促成本新发明的创造性和意义，而以前就我们所知未显示过将寡肽“标记”融合蛋白用于先前的IMAC体系。
(c)对于目前研究的所有2+-和3+-电荷的金属离子，即Cu2+，Ni2+，Zn2+，Ca2+，Mn2+，Cr3+和Fe3+，关于洗脱条件的选择研究(参见实施例部分)明确显示，如可能，在新加入的蛋白(即在寡肽“标记”和/或蛋白本身)上的金属离子结合供体基团和固定化金属离子/大环配体复合物中金属离子上的可填配位点(如配位点最初由易被置换水分子、卤化物离子等等占据)之间的配位键合(电子给予)是优势结合机制，尽管金属离子/大环配体复合物形式上载有部分正电荷(虽然复合物总体上是电中性的)。事实看来结合蛋白的解吸要求高选择性的洗脱缓冲液条件。通过比较，例如，先前使用的基于IDA-或NTA IMAC体系，可使用非常多的选择性洗脱条件，其是根据用由包括寡肽“标记”结构中超过一个的氨基酸残基的合作结合效应介导的相互作用的不同(高)结合亲和力的指征。因此，惊奇的发现就离子强度依赖性和pH依赖性而言，相对于先前使用的自由IDA-或NTA-类螯合配体更为有利的洗脱条件。如示意图3中的图解，对于双体系(还有三-和四-体系)，存在来自蛋白中不同显示的表面可及的氨基酸残基的两个(或多个)供体基团与IMAC配体现有种类同时相互作用的可能性。然而，为了获得最佳的相互作用，适当安置寡肽“标记”序列中适合氨基酸残基的前提是优选的，因为在这种情形中，所形成的希望亲和力范围的氨基酸序列能被精细调整用于螯合金属离子和所述特定寡肽“标记”之间分别的相互作用。寡肽“标记”氨基酸残基侧键中取向放置的供体基团的概念的利用，已经成为用于构成本发明一个方面的特定寡肽″标记″的优选氨基酸序列模式设计和选择所需考虑的事项之一(参见下面的部分B和D)。
为显示的便利和简单性，本方法能被认为是形成了分子盒体系，籍此固定化金属离子/配体体系和寡肽“标记”之定制氨基酸序列的性质形成了一种″分子镊子″体系，其中固定化金属离子/配体体系中的结合位点空间定位于正确的原子间距，以能正确识别寡肽“标记”中的共有序列。
(d)作为面取向″折叠″三角配位结构的利用结果，其已经被证明对于Mn+离子当结合到所述螯合大环配体现有类型上时的特性特征，IDA-或NTA-类螯合配体与金属离子临界″硬度″如Cu2+，或与″硬″金属离子，如Fe3+，的不同的水解行为通过所提供类型的大环复合物显示。值得注意的是本发明说明书中所用术语″硬″，″硬度″和″软″涉及的金属离子是根据R.G.Pearson(见例如，S.F.A.Kettle，Coordination Chemistry，Thomas Nelson and Sons Ltd.，1969，pp.48-49)所述的那些。在范围的一端，″硬″金属离子是那些就其与配体结合时类似于质子的那些，其是小的，并经常为高电荷，并缺乏能被轻易的变形或去除的价壳层电子；硬金属离子包括，如Ca2+，Mg2+，Mn2+，Cr3+和Fe3+。在范围的另一端，“软”金属离子是大的，具有低电荷或具有能被轻易的变形或去除的价壳层电子；软金属离子包括，如Cu+，Ag+和Cd2+。性质位于硬和软之间的金属离子，即临界硬度的，包括Zn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+和Cu2+。
这就意味着本IMAC体系的pH和盐依赖性不同于先前所用的体系，且在填充或洗脱缓冲液中任何有机溶剂(如乙醇或乙腈)存在的影响也是不同的。而且，本IMAC体系可采取的配位几何形状的类型不同于已经发现的用于不甚受拘束的IDA-或NTA-类IMAC体系的那些。这些特征将分别以举例方式显示，示意图4中为Cu2+和Ni2+的开放结构双核双(tacn)配体复合物，示意图5为Cu2+和Ni2+的单核非夹层结构，示意图6为tacn和双(tacn)配体的单核Cu2+和Ni2+夹层复合物。
R＝(CH2)n，n＝2-4，邻、对和间二甲苯基；X＝H2O，卤化物，...
示意图4非夹层形式的双核铜(II)和镍(II)双(tacn)复合物
X＝H2O，卤化物，...
示意图5tacn和双(tacn)配体的单核铜(II)和镍(II)非夹层复合物 M＝Cu或Ni示意图6单核铜(II)和镍(ll)tacn和双(tacn)夹层复合物要注意与本发明相关的一些特征。首先，本发明固定化螯合大环配体的配位几何形状导致空间电子效应的不同模式，并导致就金属离子结合常数而言的不同亲和规律。第二，如示意图4-6中所示，对于单核和双核开放结构金属离子螯合复合物的固定化，非夹层和夹层结构导致根本上不同性质的吸附剂，具有从纯配位类型相互作用转换为纯阴离子交换类型相互作用的分子识别平衡，特别依赖于金属离子、螯合配体的化学结构、双(还有三-和四-)结构中桥连基团R的空间和构象，和溶剂组分的性质。值得注意的是控制夹层和非夹层结构的形成能通过在仲氨基上的大环用非配位基官能化实现。所有这些的性质均影响所述IMAC体系以高亲和力识别寡肽″标记″的序列属性的能力。事实上，桥连基团R的特性限定了这些新IMAC体系的几个关键方面，包括金属离子结合中心之间的分子间距，用于金属离子结合中心相互作用的配位点的面可及性，用于与寡肽“标记”序列中特定氨基酸残基相互作用的配位点的面可及性，这些中心的极性化和溶剂化潜力，和分别用于相互作用的结合能，和相应的亲和力。
(e)许多固定化金属离子/大环复合物是有色的，它们的可见光紫外吸收光谱特征对于特定的配位金属离子是特征性的；从而，结合蛋白现象及含有固定化吸附剂的填充柱的一般状态/条件能比较容易的被观察。
(f)本大环配体的同族集合的一个有吸引力之特征是它们就其的合成途径及其结合(官能化)性质而言的″组合的″亲缘关系。这些特性导致基于体系和化学基本上相同类型可产生不同选择性范围。就已知的IDA-和NTA-类体系等等而言没有这类合成可能性。
(g)作为通过多种固定化金属离子/螯合大环配体复合物所显示的不同pH依赖性的结果，不同金属离子与所给的大环配体的使用能产生涉及负电性、空白d-轨道几何形状和金属离子填充效应的新选择性；因此，Cu2+的行为例如以令人惊奇的方式不同于Ni2+，也不同于Zn2+等等[如此处工作实施例所例证(见下)]。
(h)如上所提及的，本双(大环)配体(以及三-和四-体系的那些)的拓扑性质在如下方面能″细微调整″例如，它们的疏水性、空间电子性质、金属离子结合中心的间距、固有电荷、超分子集合倾向、金属离子结合常数、或对于不同缓冲离子或不同的溶剂种类的参数选择，方法是以已知IDA-或NTA-类型的体系或基于N，N，N′-三(羧甲基)乙二胺(TED)的体系或不受拘束之螯合体系的相关类型所不能实现的。在本文中，且如此处工作实施例中所示(见下)，看来这些性质在很多情况中通过金属离子、大环配体体系(如在此披露的双-三-或四-体系)和条件(洗脱培养基，pH等等)的慎重选择，能被用于获得″非标记的″(天然)蛋白/多肽的非常满意的纯化。而且，根据本发明的金属离子/配体吸附剂体系的所述选择性和结合性质可能使“标记”在原位自吸附剂体系上的融合蛋白上剪切(不同于在洗脱/纯化之后于溶液中)变得可行和有利的。
(i)本发明单-，双-，三-和四-类配体的合成途径不同于那些常规的不受拘束的IDA，NTA等等体系采用的，且具有含进一步供电子原子的侧臂的配体之本发明类型的变体，如N-羧甲基取代的变体，可以容易的通过组合合成制得；因此，间隔基的不同类型(即连接大环螯合配体到载体材料上的侧链基团，或另外的，在双(tacn)，三(tacn)和四(tacn)体系情形中插入控制螯合复合物中金属离子的间距结构部分)，不同的配体几何形状以及不同的配体密度，原则上能够获得。因此，除了在配体的大环区之间引入不同类型的间隔区的能力，可以通过用配位基团或非配位基团对大环上仲氨基团的官能化而实现配体配位性质的控制。
(1)相同的″核心″结构可以用3个氮供电子原子，即N3配体(N6用于双-配体，N9用于三-配体，N12用于四-配体)，或类似物N2O，N2S，O2N或S2N配体(用适当的它们的倍数对应双-，三-和四-配体)制得。值得提及的是，本发明上下文中所用的配体的高级同系物(五-，六-，七-....等等)也是可行的并与本发明相关的。
(k)如上部分(i)中所指出的，固定化大环″核心″配体能容易的被化学衍生化以引入一个或多个含有供电子原子的侧取代基；因此可产生IMAC吸附剂的又一类型，就选择性而言其具有不同的性质。含有例如侧羧甲基基团的这类体系包括在本发明的范围中，并是有价值的，例如Ca2+-特异性IMAC体系。带有所述侧取代基的配体体系的相应类型以IDA、NTA和螯合体系的其它不受拘束类型的类似方式不能产生。
B与本发明上下文中所用的大环、金属离子螯合配体相关的肽标记的优选序列和结构排列如A部分中所列的，采用一些客观标准以从计算机产生的数据库中挑选适当的氨基酸序列，用于适当的寡肽″标记″的构建。根据组分或结构，这些寡肽″标记″的一些共同的或遗传特性将其从其它类已知寡肽″标记″中区别出来。这些共同的或遗传特性概述如下(a)一种氨基酸序列排列，其中酸性氨基酸残基(如天门冬氨酸残基或谷氨酸残基)相对于寡肽“标记”的氨基酸序列中的序列数是i的组氨酸残基(或其它适当的N-供体残基)而言位于i→i+1，i→i+2，i→i+3或i→i+4，其中所述酸性氨基酸残基的侧链部分和组氨酸残基之间的原子间距(即酸性氨基酸残基和组氨酸残基之间的平均距离)相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(b)一种氨基酸序列排列，其中组氨酸残基相对于其它组氨酸残基(或其它适当的N-供体残基)位于i→i+1，i→i+2，i→i+3或i→i+4序列位置，其中两个组氨酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(c)一种氨基酸序列排列，其中非极性或中性氨基酸残基(如丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天(门)冬酰胺或谷氨酰胺残基)相对于组氨酸残基位于i→i+l，i→i+2，i→i+3或i→i+4序列位置，其中所述非极性或中性氨基酸残基的侧链部分和组氨酸残基之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(d)一种氨基酸序列排列，其中第一，第三，第五，第七，第九...(等等)氨基酸残基优选为组氨酸残基或极性氨基酸残基(如丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基)，只要氨基酸残基的分布导致第一和第三，和/或第三和第五，和/或第五和第七，和/或第七和第九，...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(e)一种氨基酸序列排列，其中第二，第四，第六和第八...(等等)氨基酸残基优选可离子化或极性氨基酸残基(如精氨酸，赖氨酸，组氨酸或酪氨酸残基)或非极性氨基酸残基(如亮氨酸，丙氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，天(门)冬酰胺或谷氨酰胺残基)，只要氨基酸残基的分布导致第二和第四，和/或第四和第六，和/或第六和第八，...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(f)一种氨基酸序列排列，其中C端氨基酸残基优选为组氨酸或精氨酸残基或非极性氨基酸残基(如亮氨酸，天(门)冬酰胺或谷氨酰胺残基)，只要氨基酸残基的分布导致至少两个氨基酸残基，优选第一和第三，和/或第三和第五，和/或第五和第七，和/或第七和第九...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(g)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其中寡肽的N端位不是生物合成性乙酰化的或酰化的。
(h)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其中寡肽“标记”的疏水矩(т)[计算和定义是根据Nozaki和Tanford(J.Biol Chem.238(1963)4074-4081；出处同前245(1970)1648-1652)和Eisenberg，D.，Weiss，R.M.和Terwilliger，T.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)140-144)]为1≤＜τ≤25，重组融合蛋白(具有寡肽“标记”的宿主蛋白)的疏水性[计算是根据Richards，F.M.(Annual Reviews of Biophysics and Bioengineering 6(1977)151-176)和Wilce，M.C.J.，Aguilar，M.I.和Hearn，M.T.W(Anal.Chem.67(1995)1210-1219)]的总变化不超过0.3。
(i)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其中寡肽“标记”序列对于重组融合蛋白的等电点(pI)值贡献不超过0.5，当相比较于野生类型(不标记)宿主蛋白(目标蛋白)的值。
(j)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其在pH7.0时携带净电荷(q)的范围为1.5≤q≤1.0。
(k)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其中寡肽的等电点(pI)的范围为5.8≤pI≤8.5。
(l)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，其中在自由溶液中或在毛细管区带电泳条件下，寡肽显示出对于软、边界、或硬金属离子的亲和力。pH在7.0附近和离子强度(I)≤50mM时其亲和常数(Kassoc)在范围100nM≤Kassoc≤100mM。
(m)一种寡肽“标记”的氨基酸序列，在pH7.0下在磷酸缓冲盐液中摩尔浓度≤300μM时，该寡肽不会形成卷曲螺旋结构。
在更具体的水平上，如果(作为本发明的非常有用的方面)通过使用氨肽酶(而不是使用内肽酶或蛋白酶，如肠激酶或因子IXa，或替代性的基于使用如溴化氰、羟胺、N-溴琥珀酰亚胺、亚碘酰基苯甲酸、3-溴-3-甲基-2-(2-硝基苯基亚磺酰)-假吲哚-粪臭素或其它适合的化学试剂的化学方法)从融合蛋白上剪切所述寡肽“标记”是必要的和重要，那么适合的氨肽酶包括二肽基氨肽酶，如DAP-1(还有已知的如组织蛋白酶C或DPP l；E.C.3.4.14.1；可得自如Aldrich-Sigma，St Louis，MO，美国，或Unizyme Laboratories，Horsholm，丹麦)，其中对于用于在大肠杆菌中重组蛋白和其它适当的原核生物表达体系/宿主细胞的表达的所述“标记”的所需性质似乎要满足如下标准(n)一种氨基酸序列排列，其中第一，第三，第五，第七，第九...(等等)氨基酸残基不是脯氨酸、精氨酸或赖氨酸残基，只要氨基酸残基的分布导致第一和第三，和/或第三和第五，和/或第五和第七，和/或第七和第九，...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(o)一种氨基酸序列排列，其中第二，第四，第六和第八...(等等)氨基酸残基不是脯氨酸残基，只要氨基酸残基的位置导致第二和第四，和/或第四和第六，和/或第六和第八，...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
另外，本发明的另一个重要方面，如果通过使用内肽酶从融合蛋白上剪切所述寡肽“标记”是可能的，那么对于所述“标记”的合适标准包括如下(p)寡肽“标记”的氨基酸序列与目标蛋白的氨基酸序列的连键经由含有剪切基序的短氨基酸序列完成，该剪切基序适于内肽酶，如内肽酶如因子IIa，因子Xa，肠激酶，链激酶，凝血酶、弗林蛋白酶或Kex(如Kex1或Kex2)。
而且，本发明的又一方面，如果通过化学反应从融合蛋白上剪切所述寡肽“标记”是可能的，那么对于所述“标记”的合适标准包括如下(q)寡肽“标记”的氨基酸序列与目标蛋白的氨基酸序列的连键经由含有剪切基序的短氨基酸序列完成，该剪切基序适于化学试剂，如羟胺，溴化氰，N-溴琥珀酰亚胺，亚碘酰基苯甲酸，3-溴-3-甲基-2-(2-硝基苯基亚磺酰)-假吲哚-粪臭素或其它适合的化学试剂。
更进一步的是，本发明的又一方面，如果通过自剪切/自剪接伪酶反应，如酰基巯基自身连接重排的使用，从融合蛋白上剪切所述寡肽“标记”是可能的，那么对于所述“标记”的合适标准包括如下(r)寡肽“标记”的氨基酸序列与目标蛋白的氨基酸序列的链合经由含有用于亲和分离的自剪切intein域的氨基酸序列完成(参见如Wood，D.W.，Derbyshire，V.，Wu，W，Chartrain，M，Belfort，M.和Belfort，G.Biotechnology Progress，16(2000)1055-1063；Wood，D.W.，Wu，W，Belfort，G.，Derbyshire，V.和Belfort，M.Nature Biotechnology，17(1999)889-892)。
在真核表达体系中，例如哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，来自草地夜蛾(Spodoptera furgiperda)的杆状病毒转染的昆虫Sf9细胞，或各种商业重要的酵母细胞(包括酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))，通常被用于重组蛋白的生产，使用这些体系是可行的，寡肽“标记”序列带有(s)一种氨基酸序列排列，其中第一氨基酸残基是脯氨酸残基，只要寡肽“标记”中的其它氨基酸残基的位置导致第一和第三，和/或第三和第五，和/或第五和第七，和/或第七和第九，...(等等)氨基酸残基，或第二和第四，和/或第四和第六，和/或第六和第八，...(等等)氨基酸残基的侧链部分之间的原子间距相当于或相似于分隔本发明类型的金属离子/大环配体复合物中所提供的结合位点的原子间距。
(t)一种氨基酸序列排列，其中第二和所有后来的氨基酸残基不是脯氨酸残基(那些情况中，包括氨肽酶的酶剪切，所述氨肽酶如DAP-1，代表用于切除寡肽“标记”优选的方法)。
显示一个或多个上述特性[(a)至(t)]的寡肽″标记″均包括在本发明所述的范围内。
C肽标记的定位使用公知的分子生物学方法和技术，优选基于多聚酶链反应(PCR)方法，实现本发明寡肽“标记”引入目标蛋白中的氨基端，羧基端或内部(桥-)位置。结果，C端定位的寡肽“标记”的实施仍能够使所述的IMAC方法与本发明大环螯合配体体系一起使用。而且，寡肽“标记”，特别是根据本发明的含组氨酸的寡肽，能同时融合于目标蛋白或多肽的两个分子，或两种不同的目标蛋白或多肽，位置分别在寡肽的氨基端或羧基端，从而形成新的融合蛋白结构，其中寡肽“标记”位于连接目标蛋白或多肽两个分子的桥位(即在内部位置)。如工作实施例所述(参见实施例部分)，已经发现C端寡肽″标记的″重组蛋白能非常有效的被新IMAC体系捕获并选择性的纯化。为了随后切除位于重组蛋白C端的寡肽“标记”，可以使用特异性羧肽酶，或独特的化学剪切位点必须被引入宿主蛋白的C端残基和“标记”肽的N端残基的接合处。这些剪切位点的化学特性的选择标准能从科学文献中预见，同时最优化羧肽酶剪切的动力学能基于文献方法。取决于寡肽“标记”的序列和宿主蛋白C端氨基酸序列的性质，适合的羧肽酶可以为，例如，羧肽酶Y(CpY)或锌依赖羧肽酶。适合的羧肽酶可以来自如下的供应商，包括Worthington BiochemicalsCorporation，Lakewood，New Jersey，美国。
D优选的寡肽标记的取代要求如上述B部分所示，尤其是其中的小节(a)-(c)，可接受的氨基酸取代能被用来产生大量的变体，最容易经由组合合成方法产生。关于优选氨基酸的选择，可在上述B部分中所示的标准中寻找指导，特别是参考组合衍生变体的氨基酸序列对于通过外肽酶剪切位于如C部分中所述靶蛋白的N端或C端的寡肽“标记”的敏感性，或对于通过二氨肽酶，如二肽基氨肽酶如DAP-1(见上文)的敏感性。结果，就合成概率总数上的局限性而言可引入大量分子约束，能被利用的合成概率基于优选寡肽“标记”的遗传定义，例如原核生物表达体系(如大肠杆菌)含脯氨酸的变体通常不包括在内。在如下情形中序列变体中第一，第三，第五，第七...(等等)氨基酸残基是对于使用二氨肽酶(如DAP-1)的剪切″被禁止的″残基，其作为序列终止，即在n-1剪切反应之后动力学上不适合于在此位点的剪切(Pro，Arg和Lys用作说明所述的“被禁止的”氨基酸残基)，或序列变体中第二，第四，第六，第八...(等等)氨基酸残基是非优选的，因为其动力学上不适合在此位点的剪切(Met用作说明所述氨基酸残基)，于是来自寡肽“标记”基因库的所述变体已经被计算方法排除在外。考虑到这些因素，完全组合文库变体(对于例如经由相应cDNA的多重平行PCR反应在DNA水平产生的寡肽“标记”序列HHHNSWDHDINR(此后称作NT1)或HTNIHQDQHNHFHR(此后称作NT2))将不被认为对于预期效用要求是预示的或必然的。相反，子文库表示用于寡肽“标记”序列的产生之结构变体的适合基团，其能亲和成熟，即对于特定大环配体具有亲和性的所需特征和通过所选肽酶(如DAP-1)被切除的能力，用特殊的蛋白成员(或相关蛋白家族)作为它们与新的固定化金属离子/大环配体复合物结合相互作用的一部分。上下文中术语″亲和成熟″是指基本结构与亲本寡肽“标记”(如NT1或NT2；见上)相关的寡肽“标记”序列(即变体)的选择使用，使得所述这些寡肽“标记”变体表示与所选作为分子识别盒的固定化金属离子亲和复合物产生较高或较低结合亲和力的氨基酸取代，上述披露的所选寡肽“标记”序列变体和固定化金属离子亲和复合物的亲和力性质经选择与靶目标蛋白的特殊性质相一致。
E优选的肽标记的截短要求倘若满足上述B、C和D部分所述的标准，那么从N-和/或C-端组成上根据本发明优选的寡肽“标记”的氨基酸序列(如NT1或NT2)的截短，允许与相关寡肽“标记”利用二肽基氨肽酶(如DAP-1；见上)或其它氨肽酶，二氨肽酶或三氨肽酶的切除同时发生。此情况中，截短导致如下情况(对于去uno-寡肽“标记”结构的图解5′1-2-3-4-5-6-7-[靶蛋白]→5′2-3-4-5-6-7--[靶蛋白])。在此的一个重要方面就是证明截短不会导致氨基酸序列的″异相″移位。这些可能对纯化过程中的寡肽”标记和固定化金属离子/配体复合物之间的相互作用上没有影响，但是可导致氨基酸残基的不利排列，从而使寡肽“标记”自融合蛋白的蛋白水解剪切效果降低。如此，″同相″截短变体表示亲本寡肽“标记”序列″库″的一种特殊亚型(T-亚型)，且经由它们在组成合性和顺序性特征中的相似性和通过它们IMAC结合潜力或酶剪切特性与各自的亲本寡肽“标记”相关联。
F优选的肽标记的缺失要求内部氨基酸残基的切除将扰乱确定的氨基酸残基的次序，从而会有两个后果。第一个后果涉及对用于通过固定化金属离子/大环螯合配体对多用途寡肽“标记”的分子识别之优选的结合基序的影响。该影响可以显示为氨基酸序列中的相移，其中在缺失变体中氨基酸残基″m″变为″m-x″残基，其中″x″是缺失的氨基酸或序列。如此的改变可以有第二个影响，就是DAP-1剪切的倾向可以大大地消除。该情况中，缺失导致如下情况(图解说明去二肽“标记”结构5′1-2-3-4-5-6-7--[靶蛋白]→5′1-2-3-6-7--[靶蛋白])。
假如上述B，C和D部分中所列际准仍然满足，则利用缺失变体的可能性也可被加入，作为对于优选寡肽“标记“的氨基酸序列选择要求的一部分。如此，″同相″缺失变体表示亲本寡肽“标记”序列″文库″的特殊亚型(D-亚型)，且经由它们在组成性和顺序性特征中的相似性与亲本寡肽“标记”序列的IMAC结合潜力或酶剪切特性相关联。
G优选的寡肽标记的模块性要求依据在上述C，D，E和F部分中所列的考虑，可提出寡肽“标记”序列模块性标准。该情况中分子的重排导致如下情况(图解说明重排-肽“标记”结构如下5′1-2-3-4-5-6-7-........-14-15-16-17-[靶蛋白]→5′1，2-3-14-15-16-17--4-5-6-7-......-[靶蛋白])。这些考虑提出了还包括一个或多个优选的”全″-长″标记″的片段性部分序列作为新肽“标记”设计的基础的可能性。这样，序列将仅有部分被改变，其结果代表了亲本序列的额外亚型(M-亚型)。该情况中，来自产生新肽″标记″的模块的亲本肽″标记″之用于替换的模块大小必须符合上述用于IMAC相互作用和酶剪切的标准。
H优选的寡肽标记的序列方向性关于生物合成性制备的优选的寡肽“标记”融合蛋白，出现了关于在优选序列中氨基酸残基的次序是否可被颠倒的问题。在例如寡肽“标记”序列NT2(见上)的情形中，这将产生序列--R-H-F-H-N-H-Q-D-Q-H-I-N-T-H--。关于这个，值得注意的是在很多情况中这样的序列次序颠倒会导致在位置1(也有可能在别处)不利的残基。
I优选的肽标记的盒序列的可能性关于优选的寡肽“标记”序列和所用特异性IMAC配体性质的互补相互作用行为的问题上在述已经讨论过。关于氨基酸序列的选择的主要(尽管不是排他性的)标准，涉及关于互补角的氨基酸残基侧链的间距，和角取向，以及相应的固定化金属离子/配体复合物体系在一个分子水平而不是批量水平上的结合能量能力。因此，优选的寡肽“标记”的选择也取决于IMAC配体的选择，因此涉及两个相关配偶体的盒相互作用的概念更早产生。这个一般概念在所述的新寡肽“标记”体系的许多特殊结合性质的特性中得到帮助。
与如上的讨论相关，但是在更具体的水平，寡肽”标记″显示出非常适合用于蛋白纯化方法中，其中来自融合蛋白(本身是个多肽)的寡肽“标记”的剪切经由氨肽酶，例如二肽基氨肽酶(如DAP-1)完成，包括含有氨基酸序列的寡肽选自如下HHHNSWDHDINR(在此省略为NT1)(SEQ.ID No.1)
HTNIHQDQHNHFHR(在此省略为NT2)(SEQ.ID No.2)HAMLDRAHDHGTR(SEQ.1D No.3)SLHEHHSGDNLR (SEQ.ID No.4)THYNAVHSHNTLQ(SEQ.ID No.5)DIHHWTDHLQSSTH (SEQ.ID No.6)LYNHYSHTAHVNHL (SEQ.ID No.7)还将了解的是所述肽(寡肽)“标记”除了所示氨基酸序列之一以外可包含一个或多个附加的氨基酸残基，如2至6个或更多的附加氨基酸残基，其结合于寡肽“标记”的C端或N端。所述序列延伸可，例如，适当的为二肽单元，如位于位置-2和-1的Met-Lys(其中位置-1，Lys，是从寡肽“标记”的N端编号的第一个氨基酸残基)，当延伸是在寡肽“标记”的N端，且“标记”体系意在用于原核生物表达体系，如大肠杆菌(E.coli)以产生重组蛋白；原核生物表达体系这种情况中，没有胞质分泌，寡肽“标记”的N端延伸的优选的第一氨基酸残基含有序列Met-Xaa，其中Xaa是不为脯氨酸的任一氨基酸残基。这些氨基酸序列延伸的加入有可能会造成增加在原核宿主细胞中靶蛋白表达的附加优点。
在真核生物表达体系的情况中，寡肽”标记的N端延伸将非常适合含有至多10个，通常少于10个的氨基酸残基，一般的前提是延伸的第二个氨基酸残基不是脯氨酸残基。
以类似的方式，序列延伸可以，例如，合适的为二肽单元，如位于位置+1和+2的Val-Asp(其中位置+1，Val，是来自寡肽“标记”C端编号的第一个氨基酸残基)，当延伸是在寡肽“标记”的C端，“标记”体系意在用于原核生物表达体系，如大肠杆菌以用于重组蛋白的制备。
本发明的更进一步方面包括如下一种多肽，其是含有在目标蛋白的氨基端或羧基端融合至少一个符合上述一个或多个标准的寡肽的目标蛋白的融合蛋白，所述寡肽如涉及上述提及的寡肽中与SEQ.IDs Nos.1-7相关的寡肽；已经讨论的(见上)，所述类型的融合蛋白，包括这样的融合蛋白其中两分子目标蛋白或多肽(或另外的，两种不同的目标蛋白或多肽)分别在他们的氨基或羧基端同时结合于一个同样的寡肽(即寡肽“标记”)，适当的，所述寡肽为根据本发明的含组氨酸的寡肽，以形成融合蛋白结构，其中寡肽(即“标记”)位于连接两分子目标蛋白或多肽的桥位(即内部位置)；这些类型的融合蛋白结构中，寡肽“标记”的氨基酸序列的侧翼适当地为一个或多个酶或化学剪切位点；编码所述多肽的多核苷酸构建体，如载体；一种可如下获得的多肽，方法是在适当的生长培养基中，在允许多肽表达的条件下，培养含有所述多核苷酸构建体的宿主细胞(如原核生物，例如大肠杆菌)，然后从培养物培养基中回收所述多肽；一种宿主细胞，更具体的是含有所述多核苷酸构建体的原核生物细胞(如大肠杆菌的菌株)或真核生物细胞(如酿酒酵母菌株，Pichiapastoris细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或其他哺乳动物细胞系如BHK，HEK或COS)；和一种制备所述类型多肽的方法，包括在适当的生长培养基中，在允许多肽表达的条件下，培养所述类型的宿主细胞，并从培养物培养基中回收多肽；本发明的另一个方面涉及一种纯化目标蛋白的方法，该方法包括如下步骤用根据本发明的含金属离子的官能化聚合物底物接触蛋白样品，所述蛋白样品含有多肽和其他(外源)蛋白，所述多肽是含有在目标蛋白的氨基端或羧基端融合至少一个根据本发明的寡肽(即寡肽“标记”)的目标蛋白的融合蛋白(即上述提及类型中的一个融合蛋白，包括这样的融合蛋白，其中寡肽(即“标记”)如上述位于桥位)；籍此，多肽(融合蛋白)结合于含金属离子的官能化聚合物底物以形成它们的复合物；用缓冲液洗涤复合物以除去其他(外源)蛋白；和将结合的多肽从经洗涤的复合物中洗脱出来。
后面的方法还含有一个步骤，其中寡肽(“标记”)例如通过化学方法或酶法(例如二肽基氨肽酶，对于“标记”含有如SEQ.IDs Nos.1-7中所列氨基酸序列的情形)自目标多肽或蛋白上剪切，。
本发明还包括通过后面的方法所得的或能得到的纯化蛋白。
涉及本发明上下文中教导的纯化方法的相关多肽或蛋白(目标多肽或蛋白)，包括下述哺乳动物蛋白，例如生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；a-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝固因子，如因子VII(包括因子VIIa)，因子VIII，因子IX，组织因子和Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调整正常的T细胞表达的和分泌的活性)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-a)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒(氏)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；鼠促性腺素相关肽；DNA酶；活化素(如活化素A，活化素B，活化素C，活化素D或活化素E)；抑制素(如抑制素A或抑制素B)；血管内皮生长因子(VEGF)；激素类或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4和或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；去(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD3，CD4，CD8，CD19或CD20；促红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白1-7(BMP 1-7)；干扰素，如干扰素-α，-β或-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF，GM-CSF或G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-12；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原，如，AIDS外壳部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘合素；抗体；上述提及的多肽或蛋白的生物学上的活性片段或变体。
在此所用的术语“多核苷酸”是指自5′至3′末端阅读的脱氧核苷酸或核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，能从自然来源分离，体外合成或从天然的或合成的分子组合中制得。所给多核苷酸分子的长度是根据核苷酸(省略为″nt″)或碱基对(省略为″bp″)。上下文允许则所用的术语″核苷酸″同时用于单链或双链分子。当使用的术语表示双链分子时，是指总体长度，且应理解为等于术语″碱基对″。本领域普通技术人员可以认识到双链多核苷酸的两条链可以在长度上有微小的不同，其末端可以错开，作为酶剪切的结果；从而在双链多核苷酸分子中的全部核苷酸可以不是配对。所述不成对的末端通常在长度上不超过20nt。
在此所用的术语″宿主细胞″是指任何细胞，包括杂合细胞，其中异源DNA能被表达。典型的宿主细胞包括，但不仅限于细菌细胞，昆虫细胞，酵母细胞和哺乳动物细胞，包括人细胞，如BHK，CHO，HEK，和COS细胞。
在此所用的术语“载体”是指在宿主细胞中能够增殖的任何核苷酸实体。因此，载体可以作为自主复制载体，如作为染色体外实体存在，即它的复制不依赖于染色体的复制，如质粒。另外地，当导入宿主细胞中时，该载体可以被结合到宿主细胞染色体组中，与已经结合的染色体一起复制。载体的选择经常依赖于将要导入的宿主细胞。载体包括，但不仅限于质粒载体，噬菌体载体，病毒或粘粒载体。载体通常含有复制起点和至少一个可选择的基因，即编码产物的基因，它能容易的被检测到，或者它的存在是细胞生长所必需的。
本发明说明书中，氨基酸残基使用经关于生物化学命名(CBN)的IUPAC-IUB委员会批准使用的缩写表示。关于氨基酸，通过下列缩写表示的是天然存在的L型。更进一步的是，除非有特别说明的，肽的氨基酸序列的左右端，分别是N-端和C-端。
氨基酸残基的缩写


本发明说明书与权利要求中所用的酶分类法与国际生化和分子生物联合会的命名委员会的推荐相一致，它的最新版本可在互联网http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/.上获得。


本发明进一步参考所附图来举例说明，图如下图1.当使用结合缓冲液(20mM碳酸钠缓冲液/0.1M NaCl)，pH9.5，时，人类血清蛋白在带有不同的金属离子的im-Mn+-dtne和im-Mn+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱上的结合行为，其中Mn+分别为Cu2+，Co2+，Zn2+和Ni2+。洗脱通过实施例中表1中概述的方法完成(见下文)。被洗脱蛋白的百分比＝(被洗脱蛋白的总量/上样蛋白的总量)×100％。
图2.在不同的上样条件下，收集自im-Cu2+-dtne和im-Cu2+-dtnp SepharoseTMCL-6B批量柱的所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1＝人血清样品；泳道2和3＝当上样pH为4.0时，自im-Cu2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道4和5＝当上样pH为9.5时，自im-Cu2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道6和7＝当上样pH为4.0时，自im-Cu2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道8至11＝当上样pH为9.5时，自im-Cu2+-dtnpSepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分。洗脱用NaCl浓度的增加和pH值的减少来完成。泳道9＝1M NaCl和pH9.5，泳道10＝pH4.0，泳道11＝pH4.0和250mM咪唑；泳道12表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa。
图.3.当结合缓冲液为20mM磷酸钾缓冲液/0.1M NaCl，pH7.0时，人类血清蛋白在带有不同金属离子的im-Mn+-dtne和im-Mn+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱上的结合行为，其中Mn+分别为Cu2+，Co2+，Zn2+和Ni2+。洗脱按照表2中的方法完成。被洗脱蛋白的百分比＝(被洗脱蛋白的总量/上样蛋白的总量)×100％。
图.4.当结合pH为7.0时，收集自im-Cu2+dtne、im-Cu2+-dtnp、im-Ni2+-dtne和im-Ni2+-dtnp SepharoseTMCL-6B批量柱的所选部分的SDS-PAGE分布图。洗脱用NaCl浓度增加至1.0M和0.2MEDTA的使用，pH为4.2来完成。泳道1＝人血清样品；泳道2和3＝自im-Ni2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道4＝自im-Ni2+-dtnp柱的穿透点/洗液部分；泳道5和6＝使用1M NaCl pH7.0缓冲液或0.2M EDTA pH4.2，自im-Ni2+-dtnpSepharoseTM CL-6B柱的被洗脱部分；泳道7＝自im-Cu2+dtne柱的穿透点/洗液部分；泳道8和9＝使用1M NaCl pH7.0缓冲液或0.2M EDTA pH4.2，自im-Cu2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的被洗脱部分；泳道10＝自im-Cu2+-dtnp柱的穿透点/洗液部分；泳道11和12＝使用1M NaCl pH7.0缓冲液或0.2M EDTA pH4.2，自im-Cu2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的被洗脱部分；泳道13表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa.。
图.5.当结合缓冲液为20mM醋酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH4.0时，人类血清蛋白在带有不同金属离子在im-Mn+-dtne和im-Mn+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱上的结合行为，其中Mn+分别为Cu2+，Co2+，Zn2+和Ni2+。洗脱按照表3中的方法完成。被洗脱蛋白的百分比＝(被洗脱蛋白的总量/上样蛋白的总量)×100％。
图.6.在不同上样条件下，收集自im-Ni2+-dtne和im-Ni2+-dtnpSepharoseTMCL-6B批量柱的所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1＝人血清样品；泳道2和3＝当上样pH为4.0时，自im-Ni2+-dtne柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道4和5＝当上样pH为9.5时，自im-Ni2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道6和7＝当上样pH为4.0时，自im-Ni2+-dtnp柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道8至13＝当上样pH为9.5时，自im-Ni2+-dtnpSepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；洗脱用NaCl浓度的增加和pH值的减少来完成；泳道9＝1M NaCl和pH9.5；泳道10＝pH8.0，泳道11＝pH7.0；泳道12＝pH6.0，泳道13＝pH4.0和250mM咪唑；泳道14表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa。
图.7.在不同上样条件下，收集自im-Zn2+-dtne和im-Zn2+-dtnpSepharoseTMCL-6B柱的所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1＝人血清样品；泳道2和3＝当上样pH为4.0时，自im-Zn2+-dtneSepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道4和5＝当上样pH为9.5时，自im-Zn2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道6和7＝当上样pH为4.0时，自im-Zn2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道8和9＝当上样pH为9.5时，自im-Zn2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道10和11＝当上样pH为7.0时，自im-Zn2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道12和13＝当上样pH为7.0时，自im-Zn2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱的穿透点/洗液和被洗脱部分；泳道14表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa.。
图.8.在im-Cu2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱上(内径为50mm×5mm)上分离的人血清蛋白洗脱分布图，使用下述洗脱方法(I)pH梯度从pH9.5至pH4.0，(II)NaCl浓度梯度从100mM至1000mM，和(III)咪唑浓度梯度从0至250mM。流速为0.5ml/min。平衡缓冲液为含有100mM NaCl的20mM碳酸钠缓冲液，pH9.5。
图.9.图8中所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1表示人血清样品；泳道2表示穿透点/洗液部分；泳道3和4表示从pH9.5至pH4.0的pH梯度洗脱下的洗脱峰；泳道5表示NaCl梯度洗脱下的洗脱峰；泳道6表示在咪唑梯度洗脱下的洗脱峰；泳道7表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa。
图.10.在im-Cu2+-dtnp SepharoseTMCL-6B柱上(内径为50mm×5mm)上分离的人血清蛋白洗脱分布图，使用下述洗脱方法(I)pH梯度从pH9.5至pH4.0，(II)NaCl浓度梯度从100mM至1000mM，和(III)咪唑浓度梯度从0至250mM。流速为0.5ml/min。平衡缓冲液为含有100mM NaCl的20mM碳酸钠缓冲液，pH9.5。
图.11.图10中所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1表示人血清样品；泳道2和3表示穿透点/洗液部分；泳道4和5表示从pH9.5至pH4.0的pH梯度洗脱下的洗脱峰；泳道6至8表示NaCl梯度洗脱下的洗脱峰；泳道9至11表示在咪唑梯度洗脱下的洗脱峰；泳道12表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa。
图.12.在im-Cu2+-dtne SepharoseTMCL-6B柱上(内径为50mm×5mm)上分离的人血清蛋白洗脱分布图，使用NaCl浓度梯度和pH梯度相结合的洗脱。实线(——)是指在280nm的波长下部分的紫外(UV)吸收度。虚线(------)是指NaCl浓度。短条-点-点-短条线(-··-··-)是指pH.。流速为0.5ml/min。平衡缓冲液为含有100mM NaCl的20mM碳酸钠缓冲液，pH9.5。
图.13.图12中所选部分的SDS-PAGE分布图。泳道1表示人血清样品；泳道2表示穿透点/洗液部分；泳道3表示NaCl梯度洗脱下的洗脱峰；泳道4表示用含有1M NaCl的pH9.5缓冲液洗脱下的洗脱峰；泳道5表示在从pH9.5至pH6.75的pH梯度洗脱下Nacl浓度为1M的洗脱峰；泳道6表示用含有1M NaCl的pH6.75的缓冲液洗脱下的洗脱峰；泳道7表示从pH6.75至pH4.0的pH梯度洗脱和含有1M NaCl的pH4.0缓冲液的无梯度洗脱下的洗脱峰；泳道8表示分子量标准，肌球蛋白212kDa，还原的α2-巨球蛋白170kDa，β-半乳糖苷酶116kDa，转铁蛋白76kDa，和谷氨酰胺脱氢酶53kDa。
图.14.使用批量吸附方法，来自重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)表达的大肠杆菌细胞提取物的回收部分中的总蛋白的百分比和酶活性，所述r-GST结合到由im-Cu2+-，im-Ni2+-和im-Zn2+-tacn，-dtne和-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂和im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B吸附剂制备的不同层析柱。用于这些结合研究的平衡缓冲液为50mMNa2HPO4/300mM NaCl和10％甘油，pH8.0。
图.15.该图显示了用含125mM和250mM咪唑的洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4/300mM NaCl和10％甘油，pH7.0)可从im-Cu2+-，im-Ni2+-和im-Zn2+-tacn，-dtne和-dtnp SepharoseTMCL-6B柱和im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱洗脱的结合蛋白的量(依照上样入柱的总蛋白的百分比)，和相应的来自重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)表达的大肠杆菌细胞提取物部分的回收部分的GST比活性。
图.16.来自含有重组GST-δ ATPase-HiS6蛋白的粗制大肠杆菌提取物的色谱分离的粗制部分、柱穿透点和被洗脱部分的SDS-PAGE分布图。分子量标准如下卵清蛋白46kDa，碳酸酐酶30kDa，胰蛋白酶抑制剂21.5kDa，溶菌酶14.3kDa，抑肽酶6.5kDa，和胰岛素B链3.4kDa。面板上(a)的相应径迹泳道1，粗制大肠杆菌提取物；泳道2至4，分别得自im-Cu2+-tacn，-dtne和-dtnp SepharoseCL-6B柱得穿透点部分；泳道5，蛋白标准；泳道6至9，分别得自im-Zn2+-tacn，im-Zn2+-dtne，im-Zn2+-dtnp，im-Ni2+-tacn和im-Ni2+-dtne Sepharose CL-6B柱的穿透点部分。类似的，面板上(a)的相应径迹泳道1至3，分别来自im-Cu2+-tacn，-dtne和-dtnpSepharose CL-6B柱的被洗脱部分；泳道4，蛋白标准；泳道5至7，分别来自im-Ni2+-tacn，im-Ni2+-dtnp，和im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱的被洗脱部分；泳道8和9，分别来自im-Ni2+-NTA和im-Ni2+-dtnp柱的穿透点部分。重组GST-δATPase-HiSδ蛋白的迁移位置通过箭头指示。
图.17 pH8.0时，用50mM Na2HPO4/300mM NaCl和10％甘油平衡的im-Ni2+-tacn SepharoseTMCL-6B吸附剂流速0.5ml/min，将粗制大肠杆菌提取物中的重组GST-δATPase-HiSδ蛋白与其它蛋白色谱分离。将含有重组GST-δATPase-HiS6蛋白粗制大肠杆菌提取物(2ml粗制大肠杆菌提取物/ml吸附剂)上样入填充柱中。不结合或弱结合蛋白用15倍体积的平衡缓冲液洗掉。然后结合蛋白使用含0至250mM咪唑线性梯度缓冲溶液洗脱20分钟以上。梯度洗脱完成之后，色谱柱用含200mM EDTA的洗脱缓冲液冲洗。回收部分中的GST活性已被测定，通过虚线(-----)表示。短条-点-点-短条线(-··-··-)和实线(——)分别是指咪唑的梯度和回收部分中的蛋白在280nm波长时的紫外吸收。
图.18.粗制大肠杆菌提取物(泳道2)和收集自粗制大肠杆菌提取物在im-Ni2+-tacn SepharoseTMCL-6B柱上经色谱分离的含有重组GST-δ ATPase-His6蛋白的被洗脱部分(图.17中所显示)的SDS-PAGE分布图。分子量标准(泳道1)如下卵清蛋白46kDa，碳酸酐酶30kDa，胰蛋白酶抑制剂21.5kDa，溶菌酶14.3kDa。
图.19.重组C-端六组氨酸标记的肝片吸虫(Fasciola hepatica)组织蛋白酶L5(rF.h组织蛋白酶L5)的酶活性使用荧光底物N-苄氧羰基-pHe-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素通过荧光读数来表示，该酶活性来自收集自纯化的rF.h组织蛋白酶L5在im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱上和粗制的酵母上清液在im-Cu2+-tacn和im-Ni2+-tacnSepharoseTMCL-6B柱上经色谱分离的部分中。洗脱步骤通过50mMNa2HPO4/150mM NaCl，pH8.0的平衡缓冲液完成。洗脱步骤1至4用含有0mM，125mM，250mM或500mM咪唑的50mMNa2HPO4/500mM NaCl，pH6.0的洗脱缓冲液进行。
图.20使用im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B吸附剂从粗制的啤酒酵母上清液中将重组C-端六组氨酸标记的肝片吸虫组织蛋白酶L5(rF.h组织蛋白酶L5)与其它蛋白分离的洗脱分布图。粗制酵母上清液以流速0.2ml/min上样于用50mM Na2HPO4/150m MNaCl，，pH8.0的溶液平衡过夜的填充柱中。不结合或弱结合蛋白分别用50倍体积的平衡缓冲液和洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4/500mM NaCl，pH6.0)洗掉。结合蛋白以0.5ml/min，使用含0至500mM咪唑线性梯度的洗脱缓冲溶液(50mM Na2HPO4/500mM NaCl，pH6.0)洗脱。梯度洗脱完成之后，色谱柱用含200mM EDTA的洗脱缓冲液冲洗。回收部分中rF.h组织蛋白酶L5的活性通过荧光测定法测定并用短条-点-点-短条线(-··-··-)表示。通过虚线(-----)和实线(——)分别指示部分中的咪唑浓度和蛋白浓度。
图.21.重组C-端六组氨酸标记的肝片吸虫组织蛋白酶L5(rF.h组织蛋白酶L5)在im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B柱上纯化的如图20中所示部分的SDS-PAGE分布图。泳道1＝粗制样品，酵母上清液；泳道2＝穿透点部分；泳道3＝用平衡缓冲液(50mMNa2HPO4/150mM NaCl，pH8.0)的洗液部分；泳道4＝用洗涤缓冲液(50mM Na2HPO4/150mM NaCl，pH6.0)的洗液部分；泳道5＝用洗液缓冲液中含0至500mM咪唑浓度梯度的洗脱部分，其中在分子范围约28.5kDa至约34.1kDa中较小的带是由于rF.h组织蛋白酶L5自溶产生的片段带。在低蛋白浓度时，这些带不能在SDS-PAGE中鉴别出来。泳道6＝分子量标准，磷酸化酶B 103kDa，牛血清白蛋白81kDa，白蛋白46.9kDa，碳酸酐酶34.1kDa，大豆胰蛋白酶抑制剂28.5kDa，和溶菌酶20.2kDa；泳道7＝rF.h组织蛋白酶L5自im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱得到的部分。
图.22.含有六组氨酸标记的顶膜抗原-1(AMA-1)蛋白(收集自im-Ni2+-tacn(a)，im-Cu2+-tacn(b)，im-Cu2+-dtnp(c)，和im-Ni2+-dtnp(d)SepharoseTMCL-6B柱的部分)的蛋白质印迹分布图。泳道1＝分子量，肌球蛋白，209kDa，β-半乳糖苷酶124kDa，牛血清白蛋白80kDa，和卵白蛋白49kDa；泳道2＝使用平衡缓冲液(50mMNa2HPO4/150mM NaCl，pH8.0)的洗液部分；泳道3＝使用含50mMNa2HPO4/500mM NaCl，pH6.0的缓冲液的被洗脱部分；泳道4＝使用含50mM Na2HPO4/500mM NaCl和125mM咪唑，pH6.0的缓冲液的被洗脱部分；泳道5＝使用含50mM Na2HPO4/500mM NaCl和250mM咪唑，pH6.0的缓冲液的被洗脱部分；泳道6＝使用含50mM Na2HPO4/500mM NaCl和500mM咪唑，pH6.0的缓冲液的被洗脱部分；泳道7＝上样样品，酵母上清液；泳道8＝对照样品，氏鼠疟原虫(Plasmodium chabaudi adami)裂解产物。重组AMA-1蛋白在酵母菌酿酒酵母中表达。
图.23.六组氨酸标记的重组蛋白谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)使用im-Ni2+-tacn和im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B柱从酿酒酵母BJ3505菌株分离的回收部分之SDS-PAGE分布图。该SDS-PAGE分布图包括了如下部分的分析组1＝用含125mM咪唑的缓冲液自im-Ni2+-tacn柱被洗脱的部分；组2＝用含125mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn柱被洗脱的部分；组3＝用含250mM咪唑的缓冲液自im-Ni2+-tacn柱被洗脱的部分；组4＝用含250mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn柱被洗脱的部分；组5＝用含500mM咪唑的缓冲液自im-Ni2+-tacn柱被洗脱的部分；组6＝用含500mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn柱被洗脱的部分；组7＝来自im-Ni2-tacn柱的非结合蛋白部分；组8＝来自im-Cu2-tacn柱的非结合蛋白部分；组9＝上样样品，通过im-Ni2+-NTA柱分离的重组蛋白GAD67/65；组10＝使用含40mM咪唑浓度的洗涤缓冲液自im-Ni2+-tacn柱的洗液部分；和组11＝使用含40mM咪唑浓度的洗涤缓冲液自im-Cu2+-tacn柱的洗液部分。
图.24.含回收的六组氨酸标记的重组蛋白谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)的部分(其为使用im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B柱从酿酒酵母BJ3505菌株分离)的SDS-PAGE和蛋白质印迹分布图。上样样品使用im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱分离自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。(A)实验1的SDS-PAGE泳道1分子量标准；泳道2通过im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱纯化的上样样品；泳道3im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的穿透点部分；泳道4使用平衡缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗液部分；泳道5使用含250mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗脱部分；(B)实验2的SDS-PAGE泳道1分子量标准；泳道2通过im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱纯化的上样样品；泳道3im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的穿透点部分；泳道4使用平衡缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗液部分；泳道5和6使用含250mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+tacn SepharoseTMCL-6B的洗脱部分；泳道7使用含0.1M组氨酸自im-Cu2+-tacnSepharoseTMCL-6B的洗脱部分；泳道8使用含1％SDS的缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗脱部分；(C)实验3的SDS-PAGE泳道1分子量标准；泳道2通过im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B柱纯化的上样样品；泳道3im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的穿透点部分；泳道4使用平衡缓冲液自im-Cu2+-tacnSepharoseTMCL-6B的洗液部分；泳道5使用含250mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTM CL-6B的洗脱部分；泳道6使用含0.2M EDTA的缓冲液自im-Cu2+-tacn Sepharosew CL-6B的洗脱部分；(D)实验3的蛋白质印迹泳道1通过im-Ni2+-NTA SepharoseTMCL-6B纯化的上样样品；泳道2im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的穿透点部分；泳道3使用平衡缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗液部分；泳道4使用含250mM咪唑的缓冲液自im-Cu2+-tacn SepharoseTMCL-6B的洗脱部分；泳道5使用含0.2MEDTA的缓冲液自im-Cu2+-tacn Sepharosew CL-6B的洗脱部分。
图.25.在不同的pH条件下，马肌肉肌红蛋白与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。本研究中，所用的缓冲液条件如下 -缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0; -缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； --缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； -缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； --缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴(q*/c*)，作为容量因子，显示平衡时基于结合在吸附剂上之蛋白量与溶液中蛋白量之比的IMAC吸附剂对蛋白的表观亲和力。
图.26.在不同的pH条件下，马肌肉肌红蛋白与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。本研究中，所用的缓冲液条件如下 -缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； -缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； -缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； -缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； ---缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴，相对结合常数，Krel(1/μmol)，显示平衡时基于固定在吸附剂上的每摩尔金属离子的相对结合能力。
图.27.在不同的pH条件下，马心cyctochrome c(HCC)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如下 -缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； -缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； -缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； ．缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； -缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴(q*/c*)，作为容量因子，显示平衡时基于结合在吸附剂上之蛋白量与溶液中蛋白量的比例的IMAC吸附剂对蛋白的表观亲和力。
图.28.在不同的pH条件下，马心cyctochrome c(HCC)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如下 -缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； -缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； -缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； -缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； --缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴，相对结合常数，Krel(1/μmol)，显示平衡时基于固定在吸附剂上的每摩尔金属离子的相对结合能力。
图.29.在不同的pH条件下，鸡卵白溶菌酶(HEWL)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如下 -缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； -缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； -缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； -缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； ---缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴(q*/c*)，作为容量因子，显示平衡时基于结合在吸附剂上之蛋白量与溶液中蛋白量的比例的IMAC吸附剂对蛋白的表观亲和力。
图.30.在不同的pH条件下，鸡卵白溶菌酶(HEWL)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如下 ---缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； --缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； -缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； --缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； ---缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴，相对结合常数，Krel(1/μmol)，显示平衡时基于固定在吸附剂上的每摩尔金属离子的相对结合能力。
图.31.在不同的pH条件下，牛α-乳白蛋白(αLAC)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如入下 --缓冲液A，20mM醋酸钠/500mMNaCl，pH4.0； --缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； --缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0； --缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0; --缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴(q*/c*)，作为容量因子，显示平衡时基于结合在吸附剂上之蛋白量与溶液中蛋白量的比例的IMAC吸附剂对蛋白的表现亲和力。
图.32.在不同的pH条件下，牛α-乳白蛋白(αLAC)与im-M2+-dtne和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B吸附剂的结合。研究中，所用的缓冲液条件如下 --缓冲液A，20mM醋酸钠/500mM NaCl，pH4.0； --缓冲液B，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH6.0； --缓冲液C，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH7.0; -缓冲液D，20mM磷酸钾/500mM NaCl，pH8.0； --缓冲液E，20mM碳酸氢钠/500mM NaCl，pH9.5。Y-轴，相对结合常数，Krel(1/μmol)，显示平衡时基于固定在吸附剂上的每摩尔金属离子的相对结合能力。
图.33.离子强度对模型蛋白HMYO与im-M2+-dtne和im-M2+dtnp Sepharose CL-6B吸附剂的结合的影响。固定化金属离子如下 和 缓冲液条件为缓冲液A，20mM磷酸钾缓冲液/100mM NaCl，pH8.0；缓冲液B，20mM磷酸钾缓冲液/500mM NaCl，pH8.0；缓冲液C，20mM磷酸钾缓冲液/1M NaCl，pH8.0；缓冲液D，20mM磷酸钾缓冲液/2M NaCl，pH8.0；缓冲液E，20mM磷酸钾缓冲液/3M NaCl，pH8.0。
图.34.离子强度对模型蛋白HCC与im-M2+-dtne和im-M2+dtnpSepharose CL-6B吸附剂的结合的影响。固定化金属离子如下 和 缓冲液条件为缓冲液A，20mM磷酸钾缓冲液/100mM NaCl，pH8.0；缓冲液B，20mM磷酸钾缓冲液/500mM NaCl，pH8.0；缓冲液C，20mM磷酸钾缓冲液/1MNaCl，pH8.0；缓冲液D，20mM磷酸钾缓冲液/2M NaCl，pH8.0；缓冲液E，20mM磷酸钾缓冲液/3M NaCl，pH8.0。
图.35.离子强度对模型蛋白HEWL与im-M2+-dtne和im-M2+dtnp Sepharose CL-6B吸附剂的结合的影响。固定化金属离子如下 and 缓冲液条件为缓冲液A，20mM磷酸钾缓冲液/100mM NaCl，pH8.0；缓冲液B，20mM磷酸钾缓冲液/500mM NaCl，pH8.0；缓冲液C，20mM磷酸钾缓冲液/1M NaCl，pH8.0；缓冲液D，20mM磷酸钾缓冲液/2M NaCl，pH8.0；缓冲液E，20mM磷酸钾缓冲液/3M NaCl，pH8.0。
图.36.N-端(His)6-标记的经标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT1按照小规模表达的不同克隆的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分(参见实施例90和105)与SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热1分钟。随后样品被上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并电泳分离持续适当的时间。大约60μl细胞裂解产物和30μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)和10kDa蛋白梯(Gibco BRL)]被上样入凝胶中。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，从而在电泳分离中大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。为了观察条带，凝胶用考马斯蓝色染色。
如图.36中所示凝胶1的解释泳道1，GST-CT1克隆1；泳道2，GST-CT1克隆2；泳道5，GST-CT1克隆3；泳道6，GST-CT1克隆4；泳道7，GST-CT1克隆5；泳道11，GST-CT1克隆6；泳道12，GST-CT1克隆7；泳道13，GST-CT1克隆8；泳道14，GST-CT1克隆9；泳道15，GST-CT1克隆10；泳道8，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道9，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照。分子量标记为泳道3，4和10中所示。
图.37.N-端(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT2按照小规模表达的不同克隆的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分(参见实施例90和105)与SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热1分钟。随后样品被上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并电泳分离持续适当的时间。大约60μl细胞裂解产物和30μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)和10kDa蛋白梯(Gibco BRL)]被上样入凝胶中。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，因此电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。为了观察条带，凝胶用考马斯蓝色染色。
如图.37中所示凝胶2的解释泳道1，GST-CT2克隆1；泳道2，GST-CT2克隆2；泳道5，GST-CT2克隆3；泳道6，GST-CT2克隆4；泳道7，GST-CT2克隆5；泳道11，GST-CT2克隆6；泳道12，GST-CT2克隆7；泳道13，GST-CT2克隆8；泳道14，GST-CT2克隆9；泳道15，GST-CT2克隆10；泳道8，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道9，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照。分子量标记为泳道4，5和10中所示。
图.38.N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1按照小规模表达的不同克隆的SDS-PAGE分析如下。细胞裂解产物的等分部分(参见实施例90和107)与SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热1分钟。随后样品被上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并电泳分离持续适当的时间。大约60μl细胞裂解产物和30μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)和10kDa蛋白梯(Gibco BRL)]被上样入凝胶中。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，因此，电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照带。为了观察条，凝胶用考马斯蓝色染色。
如图.38中所示凝胶3的解释泳道1，GST-NT1克隆1；泳道2，GST-NT1克隆2；泳道5，GST-NT1克隆3；泳道6，GST-NT1克隆4；泳道7，GST-NT1克隆5；泳道11，GST-NT1克隆6；泳道12，GST-NT1克隆7；泳道13，GST-NT1克隆8；泳道14，GST-NT1克隆9；泳道15，GST-NT1克隆10；泳道8，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道9，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照。分子量标记为泳道5，6和10中所示。
图.39.N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2按照小规模表达的不同克隆的SDS-PAGE分析如下。细胞裂解产物的等分部分(参见实施例90和108)与SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热1分钟.。随后样品被上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并电泳分离持续适当的时间。大约60μl细胞裂解产物和30μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)和10kDa蛋白梯(Gibco BRL)]被上样入凝胶中。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本的GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，从而电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。为了观察条带，凝胶用考马斯蓝色染色。
如图.39中所示凝胶4的解释泳道1，GST-NT2克隆1；泳道2，GST-NT2克隆2；泳道5，GST-NT2克隆3；泳道6，GST-NT2克隆4；泳道7，GST-NT2克隆5；泳道11，GST-NT2克隆6；泳道12，GST-NT2克隆7；泳道13，GST-NT2克隆8；泳道14，GST-NT2克隆9；泳道15，GST-NT2克隆10；泳道8，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道9，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照。分子量标记为泳道6，7和10中所示。
图.40来自具有高表达水平的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白按照小规模蛋白表达的粗制细胞裂解产物的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分(参见实施例90和108)与SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热1分钟。随后样品被上样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并电泳分离持续适当的时间。大约2μl细胞裂解产物和1μl分子量标记[基准蛋白梯(GibcoBRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入凝胶中。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，从而电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。为了观察条带，凝胶用银染色。
如图.40中所示凝胶5的解释泳道1，GST-CT1克隆7；泳道2，GST-CT2克隆6；泳道6，GST-NT1克隆1；泳道7 GST-NT2克隆7；泳道4由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道5由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照。分子量标记为泳道3中所示。
图.41收集自按照其表达水平所选的克隆的N-端(His)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT1的批量纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分及收集自批量纯化的部分(参见实施例93)与SDS裂缓冲液(还原的)混合并在100℃加热90秒。大约10μl纯化部分样品，5μ1阳性和阴性细胞裂解产物和1.25μl含重组融合蛋白的细胞裂解产物和1μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离持续适当的时间。为了观察条带，凝胶银染。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，从而电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。
如图41中所示凝胶6的解释泳道3-5含有收集自Ni2+-tacnSepharoseTMCL-6B柱的GST-CT1样品；同时泳道6-8含有收集自Ni2+-NTA Sepharose CL-6B柱的样品；泳道3和6，与洗涤步骤2相应；泳道4和7与洗脱步骤1相应；泳道5和8，与洗脱步骤2相应；泳道1，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道2，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照；泳道10，粗制细胞裂解产物。分子量标记显示在泳道9中。
图.42.收集自具有高表达水平的克隆的N-端(His-Gln)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT2的批量纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分与收集自批量纯化的部分(参见实施例111)及SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热90秒。大约10μl纯化部分样品，5μl阳性和阴性细胞裂解产物和1.25μl含重组融合蛋白的细胞裂解产物和1μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中并电泳分离持续适当的时间。为了观察条带，凝胶银染。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，因此电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。
如图42中所示凝胶7的解释泳道3-5含有收集自Ni2+-tacnSepharoseTMCL-6B柱的GST-CT2样品；同时泳道6-8含有收集自Ni2+-NTA Sepharose CL-6B柱的样品；泳道3和6与洗涤步骤2相应；泳道4和7与洗脱步骤1相应；泳道5和8与洗脱步骤2相应；泳道1，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道2，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照；泳道9，粗制细胞裂解产物。分子量标记显示在泳道10中。
图.43.收集按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的批量纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分与收集自批量纯化的部分(参见实施例112)及SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热90秒。大约10μl纯化部分样品，5μl阳性和阴性细胞裂解产物和1.25μl含重组融合蛋白的细胞裂解产物和1μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中并电泳分离持续适当的时间。为了观察条带，凝胶银染。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本的GST表达为附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，因此电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。
如图43中所示凝胶8的解释泳道5-7含有收集自Ni2+-tacnSepharoseTMCL-6B柱的GST-NT1样品；同时泳道8-10含有收集自Ni2+-NTA Sepharose CL-6B柱的样品；泳道5和8，与洗涤步骤2相应；泳道6和9与洗脱步骤1相应；泳道7和10，与洗脱步骤2相应；泳道1，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道2，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照；泳道3，粗制细胞裂解产物。分子量标记显示在泳道4中。
图.44.收集按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的批量纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。细胞裂解产物的等分部分与收集自批量纯化的部分(参见实施例113)及SDS上样缓冲液(还原的)混合并在100℃加热90秒。大约10μl纯化部分样品，5μl阳性和阴性细胞裂解产物和1.25μl含重组融合蛋白的细胞裂解产物和1μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中并电泳分离持续适当的时间。为了观察条带，凝胶银染。pGEX3XGST转化体(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)用作阳性对照。N-端-标记的r-GST融合蛋白的r-GST组分在C-端末截短1个氨基酸。亲本GST表达为带有附加的14个C-端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在其C-端末含有附加的15个氨基酸，因此电泳分离大于N-端标记的r-GST融合蛋白GST组分约1.65kDa。用pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105细胞作为阴性对照。
如图44中所示凝胶8的解释泳道5-7含有收集白Ni2+-tacnSepharoseTMCL-6B柱的GST-NT2样品；同时泳道8-10含有收集自Ni2+-NTA Sepharose CL-6B柱的样品；泳道5和8，与洗涤步骤2相应；泳道6和9与洗脱步骤1相应；泳道7和10，与洗脱步骤2相应；泳道1，由用pTrc转化的大肠杆菌JM105组成的阴性对照；泳道2，由用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105组成的阳性对照；泳道4，粗制细胞裂解产物。分子量标记显示在泳道3中。
图.45.收集自按其表达水平所选的克隆的N-端(His)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT1的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-CT1的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例97中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。洗脱部分的第一个1ml中的10μl等分部分和2.5μl细胞裂解产物被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-44中所述的带将凝胶银染。
如图45中所示凝胶10的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，100mM；泳道3，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。细胞裂解产物显示在泳道2中。
图.46.收集自按其表达水平所选的克隆的N-端(His-Gln)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT2的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-CT2的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例98中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。洗脱部分的第一个1ml中的10μl等分部分和2.5μl细胞溶解产物被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-44中所述的带将凝胶银染。
如图46中所示凝胶11的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道3，200mM；泳道4，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。细胞裂解产物显示在泳道5中。
图.47.收集自按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-NT1的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例99中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。洗脱部分的第一个1ml中的10μl等分部分和2.5μl细胞裂解产物被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-44中所述的带将凝胶银染。
如图47中所示凝胶12的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道2，100mM；泳道3，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。细胞裂解产物显示在泳道1中。
图.48.收集按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-NT2的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例100中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。被洗脱部分的第一个1ml中的10μl等分部分和2.5μl细胞裂解产物被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-44中所述的带将凝胶银染。
如图48中所示凝胶13的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。细胞溶解产物显示在泳道3中。
图.49.收集按其表达水平所选的克隆的N-端(HiS)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT1的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-CT1的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例101中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。大约每个被洗脱部分的第一个1ml中的16μl等分部分和0.5μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-44中所述的带将凝胶银染。
如图49中所示凝胶14的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道2，25mM；泳道3，50mM；泳道4，75mM；泳道5，100mM；泳道6，150mM；泳道7，200mM；泳道8，250mM；泳道9，300mM和泳道10，350mM。细胞裂解产物显示在泳道1中。
图.50.收集按其表达水平所选的克隆的N-端(His-Gln)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-CT2的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-CT2的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例102中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。大约每个被洗脱部分的第一个1ml中的16μl等分部分和0.5μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-45中所述的带将凝胶银染。
如图50中所示凝胶15的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，25mM；泳道3，50mM；泳道4，75mM；泳道5，100mM；泳道6，150mM；泳道7，200mM；泳道8，250mM；泳道9，300mM和泳道10，350mM。细胞溶解产物显示在泳道2中。
图.51.收集按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-NT1的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例103中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。大约每个被洗脱部分的第一个1ml中的16μl等分部分和0.5μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)1被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-45中所述的带将凝胶银染。
如图51中所示凝胶16的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。细胞裂解产物显示在泳道3中。
图.52.收集按其表达水平所选的克隆的N-端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的分步纯化的不同部分的SDS-PAGE分析。来自含GST-NT2的细胞裂解产物的分步洗脱的样品，如实施例104中所述，与SDS上样缓冲液(非还原的)混合并在100℃加热90秒。大约每个被洗脱部分的第一个1ml中的16μl等分部分和0.5μl分子量标记[基准蛋白梯(Gibco BRL，Bethesda，MD，美国)]被上样入12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。凝胶分离持续适当的时间，随后为了观察如图35-45中所述的带将凝胶银染。
如图52中所示凝胶17的解释使用缓冲液A(表1)体系补加如下浓度的咪唑来回收部分泳道1，50mM；泳道2，75mM；泳道3，100mM；泳道5，150mM；泳道6，200mM；泳道7，250mM；泳道8，300mM；泳道9，350mM和泳道10，400mM。细胞裂解产物显示在泳道4中。
图.53.谱1非-DAP-1-处理的GST(FL)-CT2融合蛋白，即阴性对照的MALDI-TOF MS谱。其显示了[M+H]+值为28,013±3.21道尔顿的单峰(标记为1)。GST(FL)-CT2的预期的理论上同位分子量为28,007.3道尔顿。通过同此比较，实测的质量与完整的GST(FL)-CT2蛋白相一致。
谱2DAP-1-水解的GST(FL)-CT2的MALDI-TOF MS光谱，该光谱证明了用DAP-1对融合蛋白处理2小时后，分子量将会减少。光谱2显示出平均[M+H]+值为26,154±6道尔顿的主峰(2a)，和平均[M+H]+值为25,931±7.51道尔顿的次峰(2b)。
图.54.
谱1非-DAP-1-处理的GST(FL)-NT1，即阴性对照的MALDI-TOF MS谱。其显示了[M+H]+值为27,972±3.51道尔顿的单峰(标记为1)。上GST(FL)-NT1的预期的理论分子量27,965.3道尔顿的分子量相比，实测质量与完整蛋白相一致。
谱2DAP-1-消化(2hr)的GST(FL)-NT1的MALDI-TOF MS谱，该谱证明用DAP-1处理后，分子量减少。谱2显示出平均[M+H]+值为26,659±6.81道尔顿的主峰(2a)，也显示了平均[M+H]+值为25,934±3.21道尔顿的次峰(2b)以及平均[M+H]+值为25,680±6.03道尔顿的又一次峰(2c)。
图.55.谱1非-DAP-1-处理的GST(FL)-NT2融合蛋白，即阴性对照的MALDI-TOF MS谱。其显示了[M+H]+值为28,223±2.89道尔顿的单峰(标记为1)。通过与GST(FL)-NT1的28,218.6道尔顿的预期的理论分子量相比，实测质量与完整蛋白相一致。
谱2DAP-1-消化(2hr)的GST(FL)-NT1的MALDI-TOF MS谱，该谱证明用DAP-1对处理后，分子量减少。谱2显示出平均[M+H]+值为25,910±9.16道尔顿的主峰(2a)，和平均[M+H]+值为25,648±12.86道尔顿的次峰(2b)。
图.56.对于凝胶的解释泳道4，DAP-1处理前的GST(FL)-CT2；泳道5，DAP-1处理后的GST(FL)-CT2；泳道6，DAP-1处理前的GST(FL)-NT1；泳道7，DAP-1处理后的GST(FL)-NT1；泳道8，DAP-1处理前的GST(FL)-NT2；泳道9，DAP-1处理后的GST(FL)-NT2；泳道1，3和10为空白。分子量标记显示在泳道2中。
图.57.时于凝胶的解释泳道2，在Ni2+-tacn柱上纯化的GST-CT1；泳道3，在Ni2+-tacn柱上纯化的GST-CT2；泳道4，在Ni2+-tacn柱上纯化的GST-NT1；泳道5，在Ni2+-tacn柱上纯化的GST-NT2；泳道6，在Cu2+-tacn柱上纯化的GST-CT1；泳道7，在Cu2+-tacn柱上纯化的GST-CT2；泳道8，在Cu2+-tacn柱上纯化的GST-NT1；泳道9，在Cu2+-tacn柱上纯化的GST-NT2。分子量标记显示在泳道1中。
实验部分除非有其它的说明，所用的试剂均是符合标准实验室试剂等级纯度或更高纯度的，并来自确定的供应商的。CH3CN对4A分子筛干燥。SepharoseTMCL-4B和其它类型的SepharoseTM及SuperoseTM和所涉及的基于琼脂糖的产品购买自Amersham Pharmacia(Uppsala，瑞典)。自始至终使用蒸馏水或Milli-QTM水。
金属离子配位配体金属离子配位配体1，4，7-三氮杂环壬烷(省略为tacn或TACN)(购买自Sigma-Aldrich Company，St.Louis，MO，美国)可以通过Richman-Atkins反应制得[J.E.Richman和T.J.Atkins，Journal ofthe American Chemical Society，96(1974)2268；J.E.Richman，WF.Oettle和T.J.Atkins，Organic Synthesis 58(1978)86]。后面所用的tacn的三氢溴酸盐通过来自5M氢溴酸的游离配体的结晶制得。
1，2-双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)乙烷(省略为dtne，DTNE或Leth)和1，3-双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)丙烷(省略为dtnp，DTNP或Lprop)可以通过如Wieghardt等人[Inorg.Chem.24(1985)1230]中所述的制备。1，4-双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)丁烷(省略为dtnb，DTNB或Lbut)可以通过如Sessler等人[Inorganic Chemistry，29(1990)4143]或Zhang等人[Inorganic Chemistry，34(1995)2883]中所述的制备。后面的三个化合物作为六-氢溴酸盐分离。
可制备具有有来自邻位、间位或对位二甲苯桥基的后面的双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)配体的类似物，也就是说 或 在两个1，4，7-三氮杂环壬烷基之间，替代-(CH2)n-桥基(n＝2，3或4)，可作为六-氢溴酸盐，如Graham等人[Inorganic Chemistry，36(1997)6366]或Farrugia，L.J.，Lovatt，P.A.和Peacock，R.D.[Joumal of the Chemical Society，Dalton Transactions(1997)911-912]中所述的制备。这些配体在此分别省略为Lox，Lmx和Lpx。
可分别制备具有结合到中心均三甲苯衍生基团上的三个1，4，7-三氮杂环壬烷基团的相应三(1，4，7-三氮杂环壬烷基)配体，即 和具有结合到中心均四甲苯衍生基团上的四个1，4，7-三氮杂环壬烷基团的四(1，4，7-三氮杂环壬烷基)配体，即 的九-和十二-氢溴酸盐，方法分别如Spiccia等人[Journal of theChemical Society，Dalton Transactions(1997)1092]和Graham等人[Inorganic Chemistry，39(2000)1092]中所述制备。
分析确定和物理测量通过Dairy Technical Services Ltd.，Melbourne，澳大利亚完成氮分析。铜和镍分析在Varian AA-1475原子吸收分光仪上进行。分散反射系数电子光谱通过Cary 5G分光光度计记录。ESR光谱在VarianE-12光谱仪上(于约9.6GHz(X-band)操作)，在77K记录，并参考a，a′-联苯β-二间三硝苯基偕腙肼(DPPH)，其g值为2.0036。样品在正常的3mmID管中分离，在液氮流动低温恒温器中冷冻。
实施例1含有固定化1，4，7-三氮杂环壬烷(im-TACN)的吸附剂(官能化底物)的制备在基质(底物)上鳌合剂(TACN)固定化的第一步包括应用表氯醇(或其他适合的活性化合物，如羰基双咪唑)对基质的共价活化。由此，SepharoseTMCL-6B凝胶(10克，湿重)与10ml 2M的NaOH和37.5mg硼氢化钠(98％)混合。混合物在25℃下孵育2小时后，加入12ml表氯醇，混合物25℃轻摇过夜。用吸滤器回收所产生的环氧活化的SepharoseTM凝胶，然后用Milli-QTM水彻底洗涤以去除残留的未反应的表氯醇。配制0.1M的tacn配体溶液，配制方法如下取5mmol tacn的三氢溴酸盐溶于30ml水中，加入固体NaOH调整pH至11，加水至终体积为50ml。取等份所述溶液(20ml)，然后加入上述方法制备的10g(抽吸干燥后的重量)环氧活化的SepharoseTMCL-6B。悬液于25℃水浴震荡混合过夜。吸滤(应用水泵)回收所产生的官能化凝胶部分，依次用Milli-QTM水(5×200ml)和含有0.1M KNO3(pH4.0)的50mM乙酸钠缓冲液(50ml)充分洗涤，最后用Milli-QTM水(5×200ml)洗涤。随后，im-tacn吸附剂部分用20ml20％(体积/体积)乙醇/水溶液悬浮，并储存在4℃备用。
实施例2含有固定化双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)乙烷(im-DTNE)的吸附剂(官能化底物)的制备所用方法基本上与实施例1所描述的相同，不同的是所用的0.1Mdtne配体溶液的终体积为25ml。
实施例3含有固定化双(1，4，7-三氮杂环壬烷基)丙烷(im-DTNP)的吸附剂(官能化底物)的制备所用方法基本上与实施例1所描述的相同，不同的是所用的0.1Mdtnp配体溶液的终体积为25ml。
实施例4固定化金属离子-TACN吸附剂的制备典型地，将约5g im-tacn吸附剂(湿重)与50ml 50mM的金属离子硝酸盐溶液中，25℃下孵育30分钟。所述金属离子具有临界金硬度-分别为即Cu(NO3)2、Ni(NO3)2、Zn(NO3)2、Co(NO3)2、Mn(NO3)2或Cr(NO3)3，均用Milli-QTM水配制。然后，用Milli-QTM水(5×200ml)将上述不同的固定化金属离子吸附剂(凝胶)彻底洗涤。
为了清除与吸附剂松散结合的金属离子，将含有0.1M KNO3的50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)与固定化金属吸附剂凝胶以50ml缓冲液加入5g(湿重)吸附剂的比率混合，孵育10分钟。然后用Milli-QTM水充分洗涤凝胶。随后，不同的固定化金属离子吸附剂(凝胶)部分用20ml 20％(体积/体积)乙醇/水溶液悬浮，并储存在4℃备用。
实施例5固定化金属离子-DTNE吸附剂的制备所用方法完全相似于实施例4所描述的内容，不同的是应用约5gim-dtne吸附剂(湿重)。
实施例6固定化金属离子-DTNP吸附剂的制备所用方法完全相似于实施例4所描述的，不同的是应用约5gim-dtnp吸附剂(湿重)。
实施例7应用固定化Cu2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化人类血清的制备新鲜的人类血液标本(20ml)在4℃静置24小时以移除血细胞和纤维蛋白原。应用SorvaiTMRT6000低温离心机(DuPont Co，Newtown，CT，美国)将血清上清液以5000×g，4℃离心20分钟。移出上清液，再次于5000×g和4℃下离心20分钟。上清液等份(0.2ml)分装到1.5ml管中置-20℃储存。
应用分批层析步骤分离人类血清蛋白用im-Cu2+-dtne吸附剂(1ml)填塞Bio-RadTMEcono-柱[如4.0cm(长)×0.8cm(i.d.，即内径)柱](Hercules，CA，美国)，并用含有20mM碳酸钠和0.1M NaCl，pH9.5的平衡缓冲液(参看表1)加以平衡。一等份人类血清(200μl)用平衡缓冲液稀释5倍，加入到经平衡的柱中。在加入人类血清标本超过5分钟后，加入300μl平衡缓冲液以将柱壁上标本冲洗入凝胶中。再过5分钟后，将5ml平衡缓冲液加入到柱中，以洗脱未结合蛋白。收集的部分(大约5.5ml)代表未结合部分。
应用表1所列的一系列洗脱缓冲液(5ml)将结合的人类血清蛋白从吸附剂中洗脱下来。收集的部分代表洗脱部分。
应用Bio-RadTM染料和二金鸡纳酸(BCA)检测来分析未结合部分和洗脱部分的蛋白组成。上述部分中的蛋白通过SDS-PAGE(图2)鉴定。所有的吸附和解吸附过程均在室温下进行。
实施例8应用固定化Cu2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所用方法与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的平衡缓冲液为含有0.1M NaCl的20mM磷酸钾缓冲液，pH值为7.0(参见表2)，并应用表2所列的一系列洗脱缓冲液(5ml)将结合的人类血清蛋白从吸附剂中洗脱下来。结果如图3和图4所示。
实施例9应用固定化Cu2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的平衡缓冲液为含有0.1M NaCl的20mM乙酸钠缓冲液，pH值为4.0(参见表3)，并应用表3所列的一系列洗脱缓冲液(5ml)将结合的人类血清蛋白从吸附剂中洗脱下来。结果如图5和图2所示。
实施例10应用固定化Cu2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-dtnp。结果如图1和图2所示。
实施例11应用固定化Cu2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-dtnp。结果如图3和图4所示。
实施例12应用固定化Cu2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-dtnp。结果如图5和图2所示。
实施例13应用固定化Ni2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtne。结果如图1和图6所示。
实施例14应用固定化Ni2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtne。结果如图3和图4所示。
实施例15应用固定化Ni2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtne。结果如图5和图6所示。
实施例16应用固定化Ni2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtnp。结果如图1和图6所示。
实施例17应用固定化Ni2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtnp。结果如图3和图4所示。
实施例18应用固定化Ni2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtnp。结果如图5和图6所示。
实施例19应用固定化Co2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtne。结果如图1所示。
实施例20应用固定化Co2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtne。结果如图3所示。
实施例21应用固定化Co2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtnp。结果如图5所示。
实施例22应用固定化Co2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtnp。结果如图1所示。
实施例23应用固定化Co2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtnp。结果如图3所示。
实施例24应用固定化Co2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-dtnp。结果如图5所示。
实施例25应用固定化Zn2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtnp。结果如图1和图7所示。
实施例26应用固定化Zn2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtne。结果如图3和图7所示。
实施例27应用固定化Zn2+-DTNE吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtne。结果如图5和图7所示。
实施例28应用固定化Zn2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH9.5)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例7所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+dtnp。结果如图1和图7所示。
实施例29应用固定化Zn2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH7.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例8所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtnp。结果如图3和图7所示。
实施例30应用固定化Zn2+-DTNP吸附剂和结合缓冲液(pH4.0)对人类血清蛋白的分离和纯化。
所采取的步骤与实施例9所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtnp。结果如图5和图7所示。
实施例31应用固定化Cu2+-DTNE吸附剂和FPLCTM系统对人类血清蛋白的分离在所述的分离过程中，始终应用一种程序化的FPLC系统(Pharmacia Fine Chemicals，乌普萨拉，瑞典)。im-Cu2+-DTNE/SepharoseTMCL-6B吸附剂(1ml)填入到AmershampHarmaciaTMHR5/10柱中(充填体积为5cm×0.5cm内径)。在整个层析过程中应用的流速为0.5ml/分钟。应用平衡缓冲液(如下所示)平衡柱。用平衡缓冲液将人类血清溶液(200μl)稀释5倍，通过一种200μl注射套加入到充填好的柱中。所有的洗涤和梯度洗脱步骤如下所述。应用PharmaciaTMUV-1单通道监视器(280nm)、REC-482双通道记录仪和一种计算机化的数据记录器对人类血清蛋白的层析图进行监测和记录。所有的部分通过FRAC-100部分收集仪以每部分1ml进行收集，并应用Bio-RadTM染料和二金鸡纳酸检测(BCA)方法进行分析。峰部分通过SDS-PAGE进行分析。结果如图8和图9所示。
im-Cu2+-dtne的洗脱流程平衡缓冲液20mM乙酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH9.5洗涤缓冲液15ml平衡缓冲液。
洗脱流程1)10ml，pH值在20分钟内呈线性梯度，从20mM乙酸钠缓冲液/100mM NaCl，pH9.5到20mM乙酸钠缓冲液/100mM NaCl，pH4.0；2)10ml 20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)，盐浓度在20分钟内呈线性梯度，从0.1M NaCl到1.0M NaCl；3)10ml 20mM乙酸钠缓冲液/1.0M NaCl(pH4.0)，咪唑浓度在20分钟内呈线性梯度，从0到250mM咪唑。
实施例32应用固定化Cu2+-DTNP吸附剂和FPLCTM系统对人类血清蛋白的分离所采取的步骤与实施例31所描述的基本相同，不同的是所用吸附剂为im-Cu2+-DTNP/SepharoseTMCL-6B，并应用以下所述的洗脱流程。结果如图10和图11所示。
im-Cu2+-dtnp的洗脱流程平衡缓冲液20mM碳酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH9.5洗涤缓冲液5ml平衡缓冲液。
洗脱流程1)5ml，pH值在10分钟内呈线性梯度，从20mM碳酸钠缓冲液/100mM NaCl，pH9.5到20mM乙酸钠缓冲液/100mM NaCl，pH4.0；2)2ml 20mM乙酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH4.03)7ml 20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)，盐浓度在14分钟内呈线性梯度，从0.1M NaCl到1M NaCl；4)1ml 20mM乙酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH4.05)5ml 20mM乙酸钠缓冲液/1.0M NaCl(pH4.0)，咪唑浓度在10分钟内呈线性梯度，从0到250mM咪唑6)1ml 20mM乙酸钠缓冲液/0.1MNaCl和250mM咪唑，pH4.0实施例33应用固定化Cu2+-DTNP吸附剂和FPLCTM系统对人类血清蛋白的分离所采取的步骤与实施例31所描述的基本相同，不同的是所用吸附剂为im-Cu2+-DTNP/SepharoseTMCL-6B，并应用以下所述的洗脱流程。结果如图12和图13所示。
im-Cu2+-dtnp柱的洗脱流程平衡缓冲液20mM碳酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH9.5洗涤缓冲液10ml平衡缓冲液。
洗脱缓冲液缓冲液A20mM碳酸钠缓冲液/1.0M NaCl，pH9.5缓冲液B20mM乙酸钠缓冲液/0.1M NaCl，pH4.0洗脱流程1)10ml碳酸钠缓冲液，盐浓度在20分钟内呈线性梯度，从0.1M NaCl到1M NaCl；2)1ml缓冲液A；3)5ml缓冲液在10分钟内呈线性梯度，从缓冲液A到缓冲液B；最后的缓冲液组成为50％缓冲液A和50％缓冲液B；4)8ml体积比为50∶50的缓冲液A和缓冲液B；5)5ml缓冲液在10分钟内呈线性梯度，从缓冲液A加缓冲液B体积比为50/50到100％缓冲液B；6)10ml 20mM乙酸钠缓冲液/1.0M NaCl，pH4.0。
实施例34筛选im-Cu2+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-His6蛋白的结合应用Bio-RadTMEcono-柱[典型的柱体积为从4.0cm(长度)×0.8cm(内径)到12cm(长度)×1.5cm(内径)](Hercules，CA，美国)，其中含0.5ml到20ml的im-Cu2+-tacn/SepharoseTMCL-6B凝胶应用含有50mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠和10％甘油，pH8.0的平衡缓冲液平衡。一等份部分纯化的融合蛋白，GST-δATPase-His6(由大肠杆菌菌株K12 DH5alpHaF′产生，K12 DH5alpHaF′菌株的来源和基因型如下所述80dlacZΔM15，endA1，recA1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，thl-1，gyrA96，relA1，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，λ-.[见http//wheat.pw.usda.gov/ggpaqes/probes/strains.html])。将含有目标重组蛋白GST-δATPase-HIS6的大肠杆菌细胞裂解粗提液加入到柱中(4.0cm×0.8cm柱中加入0.3ml，成比例的，更大体积的柱加入更多量的粗提液)，该目标重组蛋白通过将从细胞表达系统中收集的大肠杆菌细胞团裂解产生。用平衡缓冲液洗脱未结合或弱结合蛋白(4.0cm×0.8cm柱中加入5ml，成比例的，更大体积的柱加入更多量的平衡缓冲液)。当洗脱不出更多的蛋白时，依次分别加入含有20mM咪唑，40mM咪唑和250mM咪唑的平衡缓冲液(4.0cm×0.8cm柱中加入2ml，成比例的，更大体积的柱加入更多量)以洗脱结合蛋白，以1ml的部分收集。未结合部分和洗脱部分中蛋白浓度通过二金鸡纳酸检测(BCA)试剂(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，美国)和Bio-RadTM染料(BioRad，Richmond，CA，美国)方法检测，酶促活性通过GST底物1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)检测。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例35筛选im-Ni2+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-tacn。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例36筛选im-Zn2+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-tacn。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例37筛选im-Co2+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-tacn。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例38筛选im-Mn2+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Mn2+-tacn。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例39筛选im-Cr3+-TACN吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cr3+-tacn。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例40筛选im-Cu2+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例41筛选im-Ni2+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例42筛选im-Zn2+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例43筛选im-Co2+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-CO2+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例44筛选im-Mn2+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Mn2+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例45筛选im-Cr3+-DTNE吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cr3+-dtne。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例46筛选im-Cu2+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例47筛选im-Ni2+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例48筛选im-Zn2+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例49筛选im-Co2+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Co2+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例50筛选im-Mn2+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Mn2+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例51筛选im-Cr3+-DTNP吸附剂用于重组GST-δATPase-HIS6蛋白的结合所采取的步骤与实施例34所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cr3+-DTNP。表4显示了与所述吸附剂结合的融合蛋白GST-δATPase-HIS6的百分比。
实施例52应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
按照实施例34所述的方法得到的大肠杆菌粗提液与1mlim-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B凝胶混合，所述凝胶已用含有300mM氯化钠和10％甘油的pH8.0的50mM磷酸钠缓冲液(平衡缓冲液)平衡。在4℃孵育30分钟后，混合物在4℃下以3,000×g离心5分钟，除去上清。用5ml平衡缓冲液将凝胶颗粒洗涤2次以除去未结合或弱结合蛋白。然后将洗涤后的凝胶填充到Bio-Rad Econo柱(10ml)(Hercules，CA，美国)中。进一步用20ml平衡缓冲液洗脱所有未结合或弱结合的蛋白。用含有125mM咪唑的pH7.0的平衡缓冲液(洗脱缓冲液A)和用5ml含有250mM咪唑的平衡缓冲液(洗脱缓冲液B)pH7.0，来洗脱保留的蛋白。收集所有的部分(1ml)并分析蛋白含量和酶活性。应用二金鸡纳酸检测(BCA)试剂剂(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL，美国)和Bio-RadTM染料(BioRad，Richmond，CA，美国)方法检测未结合和洗脱部分中的蛋白浓度，通过GST底物1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)检测酶促活性。结果如图14-16所示。
实施例53应用im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-TACN。结果如图14-16所示。
实施例54应用im-Zn2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-TACN。结果如图14-16所示。
实施例55应用im-Cu2+-DTNESepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-DTNE。结果如图14-16所示。
实施例56 应用im-Ni2+-DTNESepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-DTNE。结果如图14-16所示。
实施例57应用im-Zn2+-DTNESepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-DTNE。结果如图14-16所示。
实施例58应用im-Cu2+-DTNP SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Cu2+-DTNP。结果如图14-16所示。
实施例59应用im-Ni2+-DTNP SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Ni2+-DTNP。结果如图14-16所示。
实施例60应用im-Zn2+-DTNP SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
所采取的步骤与实施例52所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为SepharoseTMCL-6B上的im-Zn2+-DTNP。结果如图14-16所示。
实施例61应用im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过层析过程从大肠杆菌细胞裂解液中分离重组GST-δATPase-HIS6蛋白。
将im-Ni2+-TACN吸附剂(1ml)填充到Pharmacia HR5/10柱中至5cm高度(填充体积为5cm×0.5cm内径)。整个层析过程的流速为0.5ml/分钟。在Bio-RadTMEcono柱(10ml)中用平衡缓冲液(含有300mM氯化钠和10％甘油的pH8.0的50mM磷酸钠缓冲液)将凝胶平衡后，将2ml用实施例52所述的方法得到的大肠杆菌提取液通过2ml注射套加入到填充柱中。然后用15ml平衡缓冲液对凝胶进行洗脱。在本次洗脱过程中，平衡缓冲液(10ml)中的咪唑20分钟内呈线性梯度递增，从0mM到250mM，然后用5ml含有250mM咪唑的平衡缓冲液无梯度洗脱。应用PharmaciaTMUV-1单通道监视器(280nm)、REC-482双通道记录仪和一种计算机化的数据记录器对洗脱蛋白的层析图进行监测和记录。所有的流分(1ml)通过一种FRACTM-100部分收集仪收集。应用二金鸡纳酸检测(BCA)试剂(PierceChemical Co.，Rockford，IL，美国)和Bio-RadTM染料(BioRad，Richmond，CA，美国)方法检测未结合和洗脱部分中的蛋白浓度，通过GST底物1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)检测酶促活性。通过SDS-PAGE表征峰部分。结果如图17-18所示。
实施例62应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从酵母肉汤中分离rF.h组织蛋白酶L5。
将填充到Bio-Rad Econo柱(10ml)中的im-Cu2+-TACNSepharoseTMCL-6B吸附剂(1ml)用平衡缓冲液(含有150mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)平衡。在含有特异性重组六组氨酸C-末端标记的肝片吸虫组织蛋白酶L5(rF.h组织蛋白酶L5)表达系统的培养基中培养转染的酿酒酵母细胞，得到未做加工的酵母肉汤上清(30ml)，并将该上清加入到im-Cu2+-TACN SepharoseTMTM柱中。收集穿透部分(未结合部分)以备随后的蛋白含量和酶活性检测。然后用10ml平衡缓冲液对柱进行洗涤以去除未结合或弱结合的蛋白。然后用10ml含有150mM NaCl的50mM磷酸钠(pH6.0)洗涤一次，以清除所有的污染蛋白。然后，取三等份5ml上述洗涤液，分别含有125mM咪唑(洗脱缓冲液A)，250mM咪唑(洗脱缓冲液B)和500mM咪唑(洗脱缓冲液C)，用于洗脱结合蛋白。收集在穿透、洗涤和洗脱过程中的所有部分，应用BCA和Bio-RadTM染料检测和SDS-PAGE来分析蛋白含量。应用Barrett，A.J[Biochemical Journal，187(1980)909-912]和Anastati，A.，Brown，M.A.，Kembhavi，A.A.，Nicklin，M.J.H.，Sayers，C.A.，Sunter，D.C.和Barrett，A.J.[Biochemi-cal Journal，211(1983)129-138]描述的荧光方法检测酶活性。结果如图19所示。
实施例63应用im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过分批吸附过程从酵母肉汤中分离rF.h组织蛋白酶L5。
所采取的步骤与实施例62所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B。结果如图19所示。
实施例64应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，通过层析过程从酵母肉汤中分离lrF.h组织蛋白酶L5。
将im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B吸附剂(0.5ml)填充到pHarmacia HR5/10柱中至2.5cm高度(填充体积为2.5cm×0.5cm内径)。将246ml酵母上清(含有重组的六组氨酸C-末端标记的肝片吸虫组织蛋白酶L5(rF.h组织蛋白酶L5)加入到填充好的柱中，流速为0.2ml/分钟。用30ml平衡缓冲液(含有150mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)和21ml洗脱缓冲液A(含有150mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH6.0)进行洗涤。然后用从缓冲液A到缓冲液B的线性梯度(15ml，超过30分钟)对柱进行洗脱，然后用5ml缓冲液B进行无梯度洗脱。所述洗脱缓冲液B为含有150mM氯化钠和500mM咪唑的pH6.0的50mM磷酸钠缓冲液，用FRAC-100部分收集器收集所有的部分(1ml)。通过Bio-Rad检测分析蛋白含量。通过实施例62描述的荧光方法检测酶活性。用SDS-PAGE表征峰部分。结果如图20和图21所示。
实施例65应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，从酵母肉汤中分离六组氨酸标记的重组疟疾抗原顶膜抗原-1(AMA-1)。
将含有AMA-1的转染的酿酒酵母细胞的粗上清液与透析缓冲液(含有150mM氯化钠和10％甘油的50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)置4℃渗析过夜，然后加入新的透析缓冲液4℃透析4小时并重复2次。将im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B吸附剂(1ml)填充到Bio-Rad Econo柱(10ml)中，用平衡缓冲液(含有150mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0)平衡。将45ml透析过的酵母上清加样到该柱中。收集穿透(未结合)部分进行蛋白检测。然后用25ml平衡缓冲液对柱进行洗涤以去除未结合和弱结合蛋白。然后将全部20ml洗涤缓冲液(含有150mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液，pH6.0)两次过柱以洗脱所有污染蛋白。然后依次分别应用三等份5ml的含有150mM NaCl和125mM咪唑的50mM磷酸钠(洗脱缓冲液A，pH6.0)，含有150mM NaCl和250mM咪唑的50mM磷酸钠(洗脱缓冲液B，pH6.0)和含有150mM NaCl和500mM咪唑的50mM磷酸钠(洗脱缓冲液C，pH6.0)，以洗脱结合蛋白。收集穿透部分和来自洗涤和洗脱过程的部分进行western-blot分析。结果如图22所示。
实施例66应用im-Cu2+-DTNP SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，从酵母肉汤中分离六组氨酸标记的重组疟疾抗原顶膜抗原-1(AMA-1)。
所采取的步骤与实施例65所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Cu2+-dtnpSepharoseTMCL-6B。结果如图22所示。
实施例67应用im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，从酵母肉汤中分离六组氨酸标记的重组疟疾抗原顶膜抗原-1(AMA-1)。
所采取的步骤与实施例65所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B。结果如图22所示。
实施例68应用im-Ni2+-DTNP SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，从酵母肉汤中分离六组氨酸标记的重组疟疾抗原顶膜抗原-1(AMA-1)。
所采取的步骤与实施例65所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Ni2+-dtnpSepharoseTMCL-6B。结果如图22所示。
实施例69应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，对分离自重组酿酒酵母BJ3505菌株的六组氨酸标记的谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)的纯化。
所述研究使用的缓冲液包括平衡缓冲液含有300mM氯化钾，20mM咪唑和0.12％TritonTMX-100的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；洗涤缓冲液含有1M氯化钾，40mM咪唑和0.12％TritonTMX-100的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；洗脱缓冲液A.含有500mM氯化钾，125mM咪唑和0.12％TritonTMX-100的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；B.含有500mM氯化钾，250mM咪唑和0.12％TritonTMX-100的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；C.含有500mM氯化钾，500mM咪唑和0.12％TritonTMX-100的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；用平衡缓冲液对im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B吸附剂进行平衡，然后取0.2ml分装到1.8ml Eppendorf管中。取500μl预先应用im-Ni2+-NTA柱(Chelating Sepharose Fast Flow，AmershamPharmacia，Uppsala，瑞典)分离的半纯化蛋白溶液与酿酒酵母BJ3505菌株表达的粗蛋白混合物一起加入到上述Eppendorf管中，4℃孵育90分钟。将混合物以1000×g离心1分钟，去除上清。先后用1ml平衡缓冲液和5×1ml洗涤缓冲液对吸附剂进行洗涤，以去除污染蛋白。依次用4×0.5ml洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B、洗脱缓冲液C洗脱结合蛋白。收集未结合部分、洗涤部分和洗脱部分进行SDS-PAGE分析。结果如图23所示。
实施例70应用im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，对分离自重组酿酒酵母BJ3505菌株的六组氨酸标记的谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)进行的纯化。
所采取的步骤与实施例69所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Ni2+-TACN SepharoseTMCL-6B。结果如图23所示。
实施例71应用im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B作为吸附剂，对分离自重组Pichia pastoris的六组氨酸标记的重组蛋白谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)的纯化。
将1ml im-Cu2+-TACN SepharoseTMCL-6B填充到Bio-Rad Econo柱中，用平衡缓冲液(含有300mM氯化钾，0.1mM 2-氨基乙基异硫脲溴鎓，1mM谷氨酰胺，0.2mM苯基甲基磺酰氟，20μM吡哆醛-L-磷酸和2mMβ-巯基乙醇的50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0，称为“Ni-缓冲液，，)平衡。用已有的方法[Law，R.H.P.，Rowley，M.J.，MacKay，I.R.和Corner，B.，Journal of Biotechnology 61(1998)57-68；Papakonstantinou，T.，Law，R.H.P.，Gardiner，P.，Rowley，M.J.和MacKay，l，Enzyme and Microbial Technology26(2000)645-652]在酿酒酵母BJ3505菌株和Pichia pastoris菌株中构建产生含六组氨酸标记的重组谷氨酸脱羧酶(GAD67/65)的表达载体。应用im-Ni2+-NTA鳌合SepharoseTM快流柱(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)对来自Pichia pastoris裂解液的粗制融合蛋白GAD67/65进行半纯化。尽管对最优化条件进行了大量的尝试，应用im-Ni2+-NTA鳌合SepharoseTM快流吸附剂无法得到均质形式的GAD67/65融合蛋白。在应用im-Ni2+-NTA柱分离的过程中，结合的GAD67/65蛋白的洗脱需进一步在Ni-缓冲液中加入250mM咪唑。然后用Ni-缓冲液将半纯化融合蛋白GAD67/65溶液中的咪唑浓度稀释至20mM。然后将该溶液加样到im-Cu2+-TACN柱中，流速为0.2ml/分钟。收集穿透(未结合)部分检测蛋白含量。用20ml洗涤缓冲液(含有40mM咪唑的Ni-缓冲液，pH8.0)清洗以去除未结合或弱结合的污染蛋白。用含有250mM咪唑的Ni-缓冲液(pH8.0)洗脱结合蛋白，收集部分(0.5ml)。应用Bio-RadTM方法，SDS-PAGE分析检测所收集的穿透部分、清洗部分和洗脱部分中的蛋白含量，根据“Papakonstantinou，T.，Law，R.H.P.，Gardiner，P.，Rowley，M.J.和MacKay，I，Enzyme and Microbial Technology 26(2000)645-652.”中所描述的方法检测酶促活性。SDS-PAGE结果如图24所示。
实施例72在不同的pH条件下肌红蛋白与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合通过应用MettleTMAE50五位数天平精确称量蛋白和用以下平衡缓冲液稀释的方法制备1.0mg/ml马骨骼肌肌红蛋白(HMYO)缓冲液A含有0.5M氯化钠的20mM乙酸钠缓冲液，pH4.0；缓冲液B含有0.5M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH6.0；缓冲液C含有0.5M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH7.0；缓冲液D含有0.5M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；和缓冲液E含有0.5M氯化钠的20mM碳酸钾缓冲液，pH9.5.
抽气干燥的im-M2+-DTNE SepharoseTMCL-6B凝胶(约0.05g)(M2+代表Cu2+，Ni2+，Zn2+或Co2+)在含有0.5ml蛋白溶液的DuraporeTM膜管(UltrafreeTM-CL，0.1μm，Nihon Millipore，KogyoK.K，日本)中孵育，在25℃下用顺时针旋转器(RATEKTMInstruments，Mitcham，VIC，澳大利亚)轻轻旋转90分钟。回收上清液，方法是将混合物用SorvallTMRT6000冷冻离心机(DuPontCo.，Newtown，CT，美国)以3000xg离心，并立即用分析反相(RP)HPLC方法分析游离蛋白浓度。结果如图25和图26所示。
实施例73在不同的pH条件下肌红蛋白与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图25和图26所示。
实施例74在不同的pH条件下溶菌酶与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的蛋白为鸡卵清溶菌酶(HEWL)。结果如图27和图28所示。
实施例75在不同的pH条件下溶菌酶与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例74所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图27和图28所示。
实施例76在不同的pH条件下细胞色素C与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的蛋白为马心细胞色素C(HHCC)。结果如图29和图30所示。
实施例77在不同的pH条件下细胞色素与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例76所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图29和图30所示。
实施例78在不同的pH条件下α-乳白蛋白与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的蛋白为牛奶α-乳白蛋白(αLAC)。结果如图31和图32所示。
实施例79在不同的pH条件下α乳白蛋白与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图31和图32所示。
实施例80在不同的盐浓度条件下肌红蛋白与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例72所描述的基本相同，不同的是所用的平衡缓冲液如下所述缓冲液F含有0.1M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；缓冲液G含有0.5M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；缓冲液H含有1.0M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，，pH8.0；缓冲液1含有2.0M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH8.0；和缓冲液J含有3.0M氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液，pH8.0.
结果如图33所示。
实施例81在不同的盐浓度条件下肌红蛋白与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例80所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图33所示。
实施例82在不同的盐浓度条件下溶菌酶与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例80所描述的基本相同，不同的是所用的蛋白为鸡卵清溶菌酶(HEWL)。结果如图34所示。
实施例83在不同的盐浓度条件下溶菌酶与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例80所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图34所示。
实施例84在不同的盐浓度条件下细胞色素C与im-M2+-DTNESepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例80所描述的基本相同，不同的是所用的蛋白为马心细胞色素C(HHCC)。结果如图35所示。
实施例85在不同的盐浓度条件下细胞色素C与im-M2+-DTNPSepharoseTMCL-6B吸附剂的结合所采取的步骤与实施例84所描述的基本相同，不同的是所用的吸附剂为im-Mn2+-DTNPSepharoseTMCL-6B。结果如图35所示。
表1.实施例7，10，13，16，19，22，25和28中所用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液。

表2实施例8，11，14，17，20，23，26和29中所用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液。

表3实施例9，12，15，18，21，24，27和30中所用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液。

表4结合条件为含有300mM氯化钠和10％甘油，DH8.0时，与不同的im-M2+-tacn SepharoseTMCL-6B，im-Mn+-dtneSepharoseTMCL-6B和im-M2+-dtnp SepharoseTMCL-6B结合的融合蛋白GST-δATPASE-HIS6蛋白的比例。

实施例86用于表达被称为NT1的N-末端融合寡肽“标记，，谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达质粒的构建PCR模板的消化GST的来源为pGEX3XGST。它被限制性内切酶EcoRV和BamHl消化。反应条件如下约3.45μg质粒，20单位的BamHI，20单位的EcoRV，10mM Tris-HCl，pH8.0，5mM MgCl2，100mM NaCl和1mMβ巯基乙醇，总体积为50μl。上述混合物在37℃下孵育2小时。在1％琼脂糖凝胶上分开两个DNA片段，分离出需要的片段。
PCR流程50和25ng的GST编码DNA片段加入到含有以下成分的反应混合物中60pmol正向引物，60pmol反向引物，2.5单位DNA聚合酶，0.5mM dNTP′s，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2和50mM KCl。反应混合物的总体积为50μl。PCR扩增GST cDNA。简要地说，对反应混合物应用以下所述的温度循环条件95℃预变性5分钟，然后94℃，50℃和72℃分别1，2，3分钟，2个循环，随后为94℃，55℃和72℃各1、2和3分钟，40个循环，最后72℃延伸5分钟。反应混合物用1％琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物。
正向引物序列5′-TTAATCATGAAACACCACCACAACTCCTGGGACCACGACATCAACCGTGTCGACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3′反向引物序列
5′-TAAAAGCTTTTACAGATCCGATTAAGG-3′PCR产物的末端修饰约300ng用上面所述方法分离的PCR产物样本加入到100μl的含有以下所述成分的反应混合物中3单位的T4 DNA聚合酶，10单位T4多聚核苷酸激酶，1mM rATP，0.5mM dNTP′s，50mMTris，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇(DTT)和5μgBSA。反应首先在37℃孵育1小时开始，然后加入0.5μl 0.5M乙二胺四乙酸，然后在75℃下孵育10分钟。然后置冰上冷却。用酚/氯仿抽提法回收DNA，然后用乙醇沉淀DNA。
与穿梭载体的连接10μl含有不同量修饰后的PCR产物(约36ng，12ng和4ng)反应液与以下成分混合50ng穿梭载体pBluescriptIISK+(可被SmaI切断，并脱磷酸)，2.5单位T4 DNA连接酶，40mM Tris-HCl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT和0.5mM ATP。连接反应体系在室温下孵育过夜。
DH5α的转化通过标准技术用5μl上面所述的连接反应混合物转化氯化铷处理过的大肠杆菌DH5α细胞。将不同稀释倍数的上述转化混合物种板到已铺有800μg IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB Amp培养板(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l，再加入15g/l的琼脂，灭菌处理后加入100mg/l氨苄青霉素)中，37C孵育过夜。
阳性克隆的鉴定通过标准技术从上面所述的DH5α转化子中分离修饰过的质粒DNA。用多种限制性内切酶消化来自不同克隆的质粒DNA，以鉴定出携带含有所需要的插入序列的质粒的克隆。来自一些克隆的质粒DNA用限制性内切酶PvuII消化。反应条件如下约300μg DNA，10单位PvuII，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTE，总体积为20μl。反应温度为37℃，反应时间为3小时。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定含有正确大小片段的质粒。用PvuII酶筛选出的质粒再用限制性内切酶BspHI进行第二次筛选。反应条件如下约300μg DNA，10个单位BspHI，50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM乙酸镁和1mM DTT，pH7.9，体积为20μl。反应温度为37℃，反应时间为2小时。消化后的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定含有正确大小片段的质粒。
随后对用上述两种酶筛选出的克隆的质粒进行DNA测序。从入选克隆的PvuII消化产物中分离出来的所需要的质粒片段约100ng用于DNA测序反应的模板。测序反应如下所述100ng质粒DNA，5pmol引物和8μl终止预混物，体积为20μl。
准备上面反应的复制混合液，一组含有pBluescript T3引物，其序列为5′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′，另一组含有pBluescriptT7引物，其序列为3′-CGGGATATCACTCAGCATAATG-5′。反应混合物应用下面所述的温度循环96℃预变性5分钟，然后96℃，50℃和60℃分别30秒，15秒和4分钟，25个循环。延伸产物通过标准技术用乙醇/乙酸钠沉淀的方法回收，沉淀干燥后用于DNA测序。
鉴定出一种含有所需要的编码GST-NT1的质粒插入子。DNA测序验证了其序列是正确的。
插入子制备来自阳性克隆(携带所需要的插入子的pBluescript)的质粒与限制性内切酶BspHI和HindIII共孵育。反应条件如下所述约500ng质粒DNA，20单位的BspHI，40单位的HindIII，50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM乙酸镁和1mM DTT，pH7.9，总体积为70μl。反应温度为37℃，反应时间为2.5小时。消化后的DNA片段用2％琼脂糖凝胶电泳分开并分离出所需要的片段。
表达载体的准备表达质粒pTrc 99A(Pharmacia Biotech)与限制性内切酶NcoI和HindIII共孵育。反应条件如下所述约4.25μg质粒，20单位的NcoI，20单位HindIII，10mM Tris-HCl，pH8.0，5mM MgCl2，100mMNaCl和1mMβ-巯基乙醇，总体积为200μl。反应温度为37℃，反应时间为2小时。消化后的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分开并分离出所需要的片段。
为了检测质粒是否已被两种酶彻底消化，连接分离的片段，然后用于转化大肠杆菌DH5α细胞。简言之，如下进行制备10μl反应液，其中含有约50ng分离的片段。2.5单位T4 DNA连接酶，40mMTris-HCl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT和0.5mM ATP。在16℃过夜温育进行连接反应。利用标准技术用5μl连接反应液转化氯化铷处理的大肠杆菌DHSα细胞。将转化子的不同稀释液种板于LB AmP平板。37℃过夜。缺乏转化的菌落证实表达质粒已经被两种酶完全消化。
NcoI/HindIII酶切载体PTRC99A的连接准备10μl含有不同量的预插入DNA(约25ng，8.3ng和2.75ng)的反应液，并与下述成分混合约50ng pTrc 99A(NcoI/HindIII酶切)表达质粒，2.5单位of T4 DNA连接酶，40mM Tris-HCl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT和0.5mM ATP。反应温度为16℃，反应时间至少为1天。用5μl上述反应混合物转化大肠杆菌DH5α细胞。通过应用限制性内切酶EcoRV/HindIII筛选方法分离和鉴定修饰过的表达质粒。
表达细胞的转化通过标准技术，将氯化铷处理后的大肠杆菌细胞，菌株JM105，用约100ng修饰过的表达质粒转化。将不同稀度的转化细胞种板到LB Amp培养板种培养，以选择携带质粒的细胞。
实施例87可用于表达N-末端融合了一种被称为CT1的对照寡肽“标记”(氨基酸序列为MKHHHHHH)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达质粒的构建步骤与实施例86所述基本相同，不同的是正向引物为5′-TAAATCATGAAACATCACCATCACCATCACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3′.
阳性克隆的鉴定.
来自多个克隆的质粒DNA与限制性内切酶PvuII共孵育。反应条件如下所述约150μg质粒DNA，10单位PvuII，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTE，总体积为20μl。反应温度为37℃，反应时间为1小时。用1％琼脂糖凝胶电泳分离两种DNA片段，鉴定含有正确大小片段的质粒。再用限制性内切酶HindIII和SalI进行第二次筛选。双酶切反应条件如下约150μg质粒，20单位HindIII，20单位SalI，50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTE，体积为40μl。反应温度为37℃，反应时间为4小时。消化后的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离，鉴定含有正确大小片段的质粒。约300ng来自所选择的质粒的未酶切DNA用做DNA测序的模板。其他测序条件与实施例86所述的相同。
鉴定出一种含有所需要的编码GST-CT1的质粒插入子的克隆。验证了其序列是正确的，但除下面所述的之外GST第28位碱基由A变为G的点突变，导致了GST的第10位氨基酸由异亮氨酸替代为缬氨酸(AAT至GTT)。GST第342位碱基由C变为T的点突变，导致了天冬氨酸的沉默突变(GAC至GAU)。GST第645位碱基发生由T变为C的点突变，导致了组氨酸的沉默突变(CAT至CAC)。
插入子准备来自阳性克隆的质粒与限制性内切酶BspHI和HindIII共孵育。反应条件如下所述约150ng质粒DNA，30单位的BspHI，60单位的HindIII，50mM乙酸钾，20nM Tris-乙酸，10mM乙酸镁和1mM DTT，pH7.9，总体积为100μl。反应温度为37℃，反应时间为22小时。
实施例88用于表达N-末端融合了一种被称为CT2的对照寡肽“标记”(氨基酸序列为MKHQHQHQHQHQHQ)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达质粒的构建步骤与实施例86所述基本相同，不同的是编码CT2的正向引物为5′-TAAATCATGAAACACCAACACCAACATCAACATCAACATCAACATCAAGTCGACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3′.
阳性克隆的鉴定来自不同克隆的修饰后的质粒DNA仅用限制性内切酶PvuII来消化。反应条件如下所述约300μg质粒，20单位PvuII，10mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTE，总体积为30μl。反应温度为37℃，反应时间为3小时。用1％琼脂糖凝胶电泳分离两种DNA片段，从而鉴定含有正确大小片段的质粒。分离出所需要的片段，取约100ng用作DNA测序的模板。
鉴定出了一个含有所需的编码GST-CT2的质粒插入子的克隆，DNA测序证实了其序列是正确的。
插入子准备来自阳性克隆的质粒与限制性内切酶BspHI和HindIII共孵育。反应条件如下所述约150ng质粒，30单位的BspHI，60单位的HindIII，50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM乙酸镁和1mM DTT，pH7.9，总体积为100μl。反应温度为37℃，反应时间约为22小时。
实施例89用于表达N-末端融合了一种被称为NT2的寡肽“标记”的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达质粒的构建步骤与实施例86所述基本相同，不同的是编码NT2的正向引物为5′-TAAATCATGAAACACACCAACATCCACCAGGACCAGCACAACCACTTCCACCGTGTCGACCAGATGTCCCCTATACTAGGT-3′.
阳性克隆的鉴定鉴定出了一个含有所需的编码GST-NT2的质粒插入子的克隆，DNA测序证实了其序列是正确的。
实施例90 N-末端标记的GST融合蛋白的小量表达如实施例86-89所述方法，用未修饰的表达载体pTrc 99A和亲本GST载体pGEX3XGST将大肠杆菌菌株JM105细胞进行转化。转化后的细胞置含有LB Amp培养基的有盖培养板中，37℃增殖过夜。选自有盖培养板中的单个克隆，在LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l并进行高压处理)37℃摇动培养过夜。5ml加入了100μg/ml氨苄青霉素的2X YT培养基(胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，NaCl 5g/l pH7.0，并进行高压处理)以1/10稀释度接种过夜培养物共孵育，然后在37℃摇动孵育，直到pTrc转化子或pGEX3XGST转化子在600nm(A600)处的吸光值分别达到0.6-1.0或0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为1mM(pTrc转化子)或0.1mM(pGEX3XGST转化子)，以诱导基因表达。在诱导后5小时(pTrc转化子)或1小时(pGEX3XGST转化子)，收获1.5ml培养物中的细胞。细胞用300μl冰预冷的1 X PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，并用超声法裂解。沉淀后，收集细胞裂解液并冷冻保存。
实施例91 N-末端标记的GST融合蛋白的大量表达选择每个标记的GST融合蛋白的单一克隆用于大量的蛋白表达。所用步骤与实施例90所述基本相同，不同处如下所述100ml培养基(2 X YTA)用1/100稀释的过夜培养物接种后孵育。诱导后，收获细胞前培养物再孵育6小时。收获的细胞用5ml 1 X PBS重悬(除外含有GST-CT2的细胞，其用10ml重悬)，并用超声法裂解。加入TritonX-100至终浓度为1％，然后孵育30分钟以增加融合蛋白的溶解度。沉淀后，收集细胞裂解液并冷冻保存。
实施例92活性评价功能性GST活性的一种可靠的检测方法是CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)检测，其中GST催化CDNB的谷胱甘肽衍生化；该复合物可通过测量340nm波长处的光密度值来检测。采用GST基因融合系统，第三版(修正版1，Pharmacia Biotech)的信息手册所述的方法进行检测。简要的说，96孔板中加入10μl按照实施例90和91所述制备的来自各GST融合蛋白重组子的细胞裂解样本，并加入190μl含有100mM KH2PO4，pH6.5，1mM 1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)和1mM还原型谷胱甘肽的反应混合液，用微板读数器检测340nm处的吸光值，共观测5分钟，每隔1分钟1次。检测结果证实，所有4种重组融合蛋白均显示了功能性GST活性。
实施例93 Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的分批纯化细胞粗提液(参见实施例91)用Ni2+-tacn和Ni2+-NTA柱纯化。每个柱的床体积为0.5ml，使用缓冲液B(缓冲液B＝缓冲液A补加10mM咪唑，pH8.4；缓冲液A＝445mM NaCl，7.5mM Na2HPO4和2.5mM NaH2PO4.2H2O，pH7.2)。125μl细胞粗提液(用缓冲液B按1比4稀释至总体积为0.5ml)上样于柱中。在洗脱前将柱用缓冲液B清洗2次。应用两个洗脱步骤用缓冲液1进行洗脱(缓冲液1＝缓冲液A补加500mM咪唑pH9.71)(1ml)，第二次洗脱是应用200mM丙二酸钠溶液(1ml)，其用10M氢氧化钠将pH值调整至8.0。
实施例94 Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2的分批纯化步骤与实施例93所述相同。
实施例95 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的分批纯化步骤与实施例93所述相同。
实施例96 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的分批纯化步骤与实施例93所述相同。
实施例97 Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的分段(无梯度)洗脱细胞粗提液(参见实施例91)上样到Ni2+-tacn柱中。柱的床体积为0.5ml，用缓冲液C平衡(缓冲液C＝缓冲液B+50mM咪唑，pH9.0)。0.5ml含有125μl用缓冲液C按1比4稀释的细胞粗提液加样于柱中。样品过柱以后，用缓冲液C(5ml)清洗柱。进行一系列分段(无梯度)洗脱，每一次洗脱均包括3次应用加入了不同浓度咪唑的1ml等份的缓冲液A。起始的洗脱是应用加入了100mM咪唑的缓冲液A，pH9.3。逐次洗脱过程中，咪唑按50mM增量逐步递增。然后，取一等份不同洗脱条件的第一个洗脱过程中洗脱液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析。
实施例98 Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2的分段(无梯度)洗脱步骤与实施例97所述相同。
实施例99 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的分段(无梯度)洗脱步骤与实施例97所述相同。
实施例100 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的分段(无梯度)洗脱步骤与实施例97所述相同。
实施例101 Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的第二次分段(无梯度)洗脱进行第二次系列的分段(无梯度)洗脱。应用床体积为0.5ml的Ni2+-tacn柱，用缓冲液B平衡。用缓冲液D(缓冲液D＝缓冲液A+12.5mM咪唑，pH8.5)将如实施例90和91所述500μl细胞粗提液按1比5稀释，所得2.5ml样品上样于柱中。将流过的部分再次上样于柱中。然后在柱中加入5ml缓冲液B。然后进行系列分段(无梯度)洗脱，每一次洗脱均包括3次应用加入了不同浓度咪唑的1ml一等份的缓冲液A。起始的洗脱是应用加入了25mM咪唑的缓冲液A。逐次洗脱过程中，咪唑按25mM增量逐步递增直至达到100mM。然后，按50mM递增。取一等份不同洗脱条件的第一个洗脱过程中的洗脱液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析。
实施例102 Met-Lys-(His-Gln)6-标记的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2的第二次分段(无梯度)洗脱步骤与实施例101所述基本相同，不同的是将5ml含有1ml用缓冲液D按1比5稀释的细胞粗提液的样品加样于柱中。
实施例103 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT1的第二次分段(无梯度)洗脱步骤与实施例101所述基本相同，不同的是用缓冲液D将细胞粗提液按1比5稀释，并将1.5ml含有300μl上述稀释的细胞粗提液的样品加样于柱中。
实施例104 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶(r-GST)融合蛋白GST-NT2的第二次分段(无梯度)洗脱步骤与实施例101所述基本相同，不同的是将0.5ml含有100μl用缓冲液D按1比5稀释的细胞粗提液的样品加样于柱中。
实施例105有N-末端Met-Lys-(His)6标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1小量表达的不同克隆的SDS-PAGE分析等分的细胞裂解液(见实施例90)与SDS上样缓冲液(还原性)混合，并于100℃加热1分钟。然后将样品上样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳适当的时间。60μl细胞裂解液和30μl分子量标准[BenchMark蛋白梯度标准物(Gibco BRL)和10KDa蛋白梯度标准物(Gibco BRL)]上样于凝胶中。pGEX3XGST转化子作为阳性对照。N-末端标记的GST融合蛋白的GST组分在C-末端截短了一个氨基酸。而亲本GST表达为具有另外的14个C-末端氨基酸的全长蛋白。因此，亲本GST在C-末端含有额外的15个氨基酸，故电泳时分子量较N-末端标记的GST融合蛋白的GST组分高约1.65Kda。pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105作为阴性对照。为了显示出条带，用考马斯蓝对凝胶进行染色。
凝胶1的各泳道内容，图36所示泳道1，GST-CT11号克隆；泳道2，GST-CT12号克隆；泳道5，GST-CT13号克隆；泳道6，GST-CT14号克隆；泳道7，GST-CT15号克隆；泳道11，GST-CT16号克隆；泳道12，GST-CT17号克隆；泳道13，GST-CT18号克隆；泳道14，GST-CT19号克隆；泳道15，GST-CT110号克隆；泳道8，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道9，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照.泳道3，4和10显示了分子量标准。
实施例106 N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2小量表达的不同克隆的SDS-PAGE分析步骤与实施例105所述基本相同。
凝胶2的各泳道内容，图37所示泳道1，GST-CT2克隆1；泳道2，GST-CT2克隆2；泳道3，GST-CT2克隆3；泳道6，GST-CT2克隆4；泳道7，GST-CT2克隆5；泳道11，GST-CT2克隆6；泳道12，GST-CT2克隆7；泳道13，GST-CT2克隆8；泳道14，GST-CT2克隆9；泳道15，GST-CT2克隆10；泳道8，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道9，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照.泳道4，5和10显示了分子量标准。
实施例107 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT1小量表达的不同克隆的SDS-PAGE分析步骤与实施例105所述基本相同。
凝胶3的各泳道内容，图38所示泳道1，GST-NT1克隆1；泳道2，GST-NT1克隆2；泳道3，GST-NT1克隆3；泳道4，GST-NT1克隆4；泳道7，GST-NT1克隆5；泳道11，GST-NT1克隆6；泳道12，GST-NT1克隆7；泳道13，GST-NT1克隆8；泳道14，GST-NT1克隆9；泳道15，GST-NT1克隆10；泳道8，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道9，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道5，6和10显示了分子量标准。
实施例108 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT2小量表达的不同克隆的SDS-PAGE分析步骤与实施例105所述基本相同。
凝胶4的各泳道内容，图39所示
泳道1，GST-NT2克隆1；泳道2，GST-NT2克隆2；泳道3，GST-NT2克隆3；泳道4，GST-NT2克隆4；泳道5，GST-NT2克隆5；泳道11，GST-NT2克隆6；泳道12，GST-NT2克隆7；泳道13，GST-NT2克隆8；泳道14，GST-NT2克隆9；泳道8，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道9，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道6，7和10显示了分子量标准。
实施例109按其高表达水平选择的GST融合蛋白克隆的小量表达的细胞粗提液的SDS-PAGE分析步骤与实施例105所述基本相同，不同的是5μl细胞裂解液和1μl分子量标准[BenchMark蛋白梯度标准物(Gibco BRL)]上样于凝胶中。凝胶银染显示条带。
凝胶5的各泳道内容，图40所示泳道1，GST-CT1克隆7；泳道2，GST-CT2克隆6；泳道6，GST-NT1克隆1；泳道7，GST-NT2克隆7；泳道4，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道5，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道3显示了分子量标准。
实施例110 N末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的分批纯化过程中收集的多种部分的SDS-PAGE分析等份的细胞裂解液和分批纯化过程中收集的部分(见实施例93)与SDS上样缓冲液(还原性)混合，并100℃加热90秒。将10μl纯化部分样品，5μl阳性和阴性对照细胞裂解液和1.25μl含有重组融合蛋白的细胞裂解液和1μl分子量标准[BenchMark蛋白梯度标准物上样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳适当时间。为了观察条带，凝胶银染。
凝胶6的各泳道内容，图41所示泳道3-5包括Ni2+-tacn柱中收集的样品，泳道6-8包括Ni2+-NTA柱中收集的样品。泳道3和6，清洗液2；泳道4和7，洗脱液1；泳道5和8，洗脱液2；泳道1，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道2，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道10，粗细胞裂解液。泳道9显示了分子量标准。
实施例111 N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2的分批纯化过程中收集的多种部分的SDS-PAGE分析步骤与实施例110基本相同，不同的是应用实施例94所述的等份细胞裂解液和分批纯化过程中收集的部分上样于胶中。
凝胶7的各泳道内容，图42所示泳道3-5包括Ni2+-tacn柱中收集的样品，泳道6-8包括Ni2+-NTA柱中收集的样品。泳道3和6，清洗液2；泳道4和7，洗脱液1；泳道5和8，洗脱液2；泳道1，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道2，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道9，粗细胞裂解液。泳道10显示了分子量标准。
实施例112 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT1的分批纯化过程中收集的多种部分的SDS-PAGE分析步骤与实施例110基本相同，不同的是应用实施例95所述的等份细胞裂解液和分批纯化过程中收集的部分上样于胶中。
凝胶8的各泳道内容，图43所示泳道5-7包括Ni2+-tacn柱中收集的样品，泳道8-10包括Ni2+-NTA柱中收集的样品。泳道5和8，清洗液2；泳道6和9，洗脱液1；泳道7和10洗脱液2；泳道1，含有pTrc转化的大肠杆菌菌株JM105的阴性对照；泳道2，含有pGEX3XGST转化的大肠杆菌菌株JM105的阳性对照；泳道3，粗细胞裂解液。泳道4显示了分子量标准。
实施例113从N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT2的分批纯化中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例96中所描述的分批纯化的细胞裂解液和部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例110中所描述的相同。
凝胶9的各泳道内容.如图44中所示泳道5-7含有收集自Ni2+-tacn柱的样品，而泳道8-10含有收集自Ni2+-NTA柱的样品。泳道5和8，洗涤2；泳道6和9，洗脱1；泳道7和10，洗脱2。泳道1，含有用pTrc转化的大肠杆菌JM105阴性对照；泳道2，含有用pGEX3XGST转化的大肠杆菌JM105的阳性对照；泳道4，粗制细胞裂解液。泳道3所示为分子量标准。
实施例114 N-末端Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析将来自第一组含有GST-CT1的细胞裂解液的无梯度分步洗脱的样品，如实施例97中所示，与SDS上样缓冲液(非还原性)混合，于100℃加热90秒。将来自第一批洗脱部分的1ml部分的10μl等份和2.5μl细胞裂解液上样于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。凝胶电泳一段适合的时间，然后银染以便识别条带。
凝胶10的各泳道内容，如图45中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，100mM；泳道3，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。泳道2显示细胞裂解液。
实施例115 N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT2的分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例98中所描述的分步(无梯度)洗脱的细胞裂解液和部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例114中所描述的相同。
凝胶11的各泳道内容，如图46中所示.
采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道3，200mM；泳道4，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。泳道5显示细胞裂解液。
实施例116 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT1的分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例99中所描述的逐步(无梯度)洗脱的细胞裂解液和部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例114中所描述的相同。
凝胶12的各泳道内容，如图47中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道2，100mM；泳道3，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。泳道1显示细胞裂解液。
实施例117 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT2的分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例100中所描述的逐步(无梯度)洗脱的细胞裂解液和部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例114中所描述的相同。
凝胶13的各泳道内容，如图48中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。泳道3显示细胞裂解液。
实施例118 N-末端Met-Lys-(His)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-CT1的第二分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析将来自第二组含有GST-CT1的细胞裂解液的无梯度分步洗脱的样品，如实施101中所示，与上样缓冲液(非还原性)混合，于100℃加热90秒。将来自第一批洗脱部分的1ml部分的16μl等份和0.5μl的分子量标准[BenchMark蛋白Ladder(Gibco BRL)]上样于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。凝胶电泳一段适合的时间，然后银染以便识别条带。
凝胶14的各泳道内容，如图49中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道2，25mM；泳道3，50mM；泳道4，75mM；泳道5，100mM；泳道6，150mM；泳道7，200mM；泳道8，250mM；泳道9，300mM和泳道10，350mM。泳道1显示分子量标准。
实施例119 N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，GST-CT2的第二次分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例102中所描述的逐步(无梯度)洗脱的部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例118中所描述的相同。
凝胶15的各泳道内容.如图50中所示.
采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，25mM；泳道3，50mM；泳道4，75mM；泳道5，100mM；泳道6，150mM；泳道7，200mM；泳道8，250mM；泳道9，300mM和泳道10，350mM。泳道2显示分子量标准。
实施例120 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT1的第二分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例103中所描述的逐步(无梯度)洗脱的部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例118中所描述的相同。
凝胶16的各泳道内容，如图51中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，100mM；泳道2，150mM；泳道4，200mM；泳道5，250mM；泳道6，300mM；泳道7，350mM；泳道8，400mM；泳道9，450mM和泳道10，500mM。泳道3显示分子量标准。
实施例121 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白GST-NT2的分步(无梯度)洗脱中收集的多种片段的SDS-PAGE分析除将获自如实施例104中所描述的逐步(无梯度)洗脱的部分的等份用于凝胶外，所使用的步骤基本上与实施例118中所描述的相同。凝胶17的各泳道内容，如图52中所示采用补加如下浓度咪唑的缓冲液A实施洗脱泳道1，50mM；泳道2，75mM；泳道3，100mM；泳道5，150mM；泳道6，200mM；泳道7，250mM；泳道8，300mM；泳道9，350mM和泳道10，400mM。泳道3显示分子量标准。
实施例122双(三氮杂环壬烷)配体在SEPHAROSETMCL-4B上的固定本实施例教导了将预构的配体固定在SepharoseTMCL-4B表面上的方法。示意图7中显示了已经固定化的配体tacn(＝1，4，7-三氮杂环壬烷)，以及多种双(tacn)配体(示为Leth，Lprop，Lbut，Lox，Lmx和Lpx)。这些大环和双(大环)与SepharoseTMCL-4B的结合采用了通常用于将含有一个或多个氨基分子连接于羟基化聚合物底物的表面，如多糖-型底物(此处例举为SepharoseTMCL-4B)的方法。所述方法的第一个阶段包括用表氯醇在碱性条件下处理底物(此处为SepharoseTMCL-4B凝胶)，以生成环氧活化的聚合物底物(此处为环氧活化的SepharoseTMCL-4B凝胶)。配体然后可借助存在于其结构中的亲核性仲胺基团与亲电子性环氧化物表面基团的反应，实现共价连接。示意图8(下述)显示了在每一情况下借助单间隔基团发生的配体与欲研究的聚合物底物的表面结合的图(例如SepharoseTMCL-4B)。若配体内部存在一个以上仲胺基团，则可一定程度上形成多重固定连键，即小百分数配体可通过与两个或多个环氧化物基团反应连接至聚合物底物表面。
示意图7.固定在SepharoseTMCL-4B上的配体。
示意图8.配体借助单间隔基团的共价联结。
由于配体是吸附剂中仅有的含氮组分，配体固定化程度即可借助氮分析确定(表5，下述)。当与双(tacn)配体比较时，可观察到固定化tacn吸附剂的较高表面覆盖度(配体表面密度)。虽然双(配体)内的大量仲胺基团都是可用的，期望统计学上有利于亲电子性表面环氧化物基团的反应。双(tacn)配体的较低表面覆盖率可能是由于双(tacn)配体的较广分布增加了能与多个环氧化物基团反应的配体的数量，增强凝胶结构内部的交联水平。此外，大量双(tacn)也许不能接近于与空间更为紧凑的tacn配体一样多的环氧化物基团。
表5.tacn-和双(tacn)-SepharoseTMCL-4B凝胶的氮含量和计算的配体表面密度固定化配体％N(w/w)配体表面密度(±0.01)(pmol/g干凝胶)tacn 1.88 447Lbut2.97 353Lox3.05 363Lmx3.20 381Lpx3.13 372实施例123双(TACN)配体在SEPHAROSETMCL-4B表面上的装配本实施例教导了一种方法，该方法据信在羟基化聚合物底物，如多糖-型底物(此处例举为SepharoseTMCL-4B)表面上装配双(tacn)配体中具有普遍的有效性。该策略据信具有普遍有效性，因为其它双(tacn)、三(tacn)、四(tacn)等，及其衍生物和结构类似物可通过与适用的聚合支持物表面上的多聚(亲电子剂)进行装配。对于双(tacn)配体而言，合成策略包括用三(亲电子剂)的一个亲电子基团处理胺化聚合物底物表面，随后两个剩下的亲电子基团与tacn大环反应(参见示意图9，下述)。所研究的聚合物底物(本例中为SepharoseTMT CL-4B凝胶)首先按上述进行环氧-活化(参见，例如，实施例122，上述)/并与过量甲胺反应以产生胺化表面。然后用大大过剩量(简称XS)的1，3，5-三(溴甲基)苯处理活化的聚合物底物，其目的在于在该分子的仅一个亲电子基团和胺化凝胶表面之间产生反应，留下两个可用于随后与tacn反应以生成固定化双(tacn)配体装配体。高反应性苄基衍生物的结合可在不加入碱基的情况下实施(其与根据在溴甲基基团和固定化仲胺基团间的浓缩而释放的质子将质子化得到的叔胺，提供了来自进一步反应产生四价氮中心的一定程度的保护作用这一预期一致)。
在先被胺化然后被用这一方式完全官能化的SepharoseTMCL-4B凝胶上实施的氮分析成功的显示了tacn与凝胶表面的偶联，如所示物质氮含量增加三倍(表6)。
示意图9.合成C-连接的Lmx-官能化羟基化聚合物底物(例如SEPHAROSETMCL-4B凝胶)。
表6.固定化MeNH2-和C-连接的LmxSepharoseTMCL-4B凝胶的氮含量和计算的配体表面密度固定化配体％N(w/w)配体表面密度(±0.01)(pmol/g干凝胶)MeNH21.39992C-连接Lmx4.27343§§§§由两种凝胶的氮含量之间的差异计算而得。由于交联(见上)，双(tacn)配体的实际表面密度可能较低。
根据示意图9(见上)中所示固定作用的图解，最终凝胶的氮含量预期值大约为简单胺化凝胶氮含量的7倍。对该较少的氮含量有两个可能的解释。第一个原因，可能在用甲胺胺化凝胶表面后的一个或两个合成步骤中发生了不完全反应。因此，最终凝胶的表面可能含有大量未反应的甲胺和/或溴甲基基团。第二个原因，交联可能发生在示意图9中所示的三个合成步骤的任一个步骤中，形成交联的模式(如示意图解10中所示的那些模式，如下)。有趣地是，固定化配体表面密度与全部由预装配的双(tacn)配体制备的凝胶所确定的那些配体相匹配。
示意图10.在合成C-连接LmxSepharoseTMCL-4B凝胶的过程中形成的可能的交联模式的两种实例。
实施例124金属离子结合的描述本实施例描述了Cu2+和Ni2+离子在新官能化凝胶上的固定，和所述产物的表征。通过将所述凝胶与适宜金属硝酸盐溶液混合，然后用醋酸盐缓冲液(pH5)洗涤以除去任何松弛结合的离子来完成固定。凝胶对Cu2+的快速摄取马上表现为凝胶颜色变为兰色，而对于Ni2+的结合，在提高温度下的孵育被发现是凝胶在合理时间长度内发生轻微紫-蓝染色所必需的。因此，Ni2+离子和所研究的固定配体之间的反应表现为相当低。在于60℃孵育1小时后，发现Cu2+和Ni2+被凝胶的摄取水平分别为根据相应的配体表面密度(表7，见后)预测的最大摄取的70％和40％。在用Ni2+处理凝胶中，通过凝胶样品在与Cu2+离子溶液混合时变为蓝色这一事实来证实非配位配体供电子原子的存在；已知镍(II)tacn复合物的动力学不活泼的特性排除了上述现象是由于Cu2+离子置换了Ni2+离子的可能性[参见，例如Yang，R.和Zompa，L.J.，无机化学，15(1976)1499；和MurpHy，L.J.和Zompa，L.J.无机化学，18(1979)3278]。假定固定化双核心镍(II)复合体模式仅较低水平将期望在所述较低负载的条件下形成，而研究双(tacn)配体至IMAC应用的一个重要出发点是(在根据本发明的方法中)为了发现结合至双核心复合物的蛋白，Ni2+-负载支持物的优势低于相应的Cu2+-负载吸附剂；而且，从实用的角度考虑，需要较快速地实现IMAC吸附剂对金属离子的最大摄取，以便在制备使用的吸附剂时不用花费多余的时间。基于所述观察和认识，因此将更多的试验焦点置于高能Cu2+-负载吸附剂上。
表7。原子吸收光谱测定的tacn-和双(tacn)-官能化SepharoseTMCL-4B凝胶对Cu2+和Ni2+的摄取固定化配体Ni含量 Cu含量 Cu含量(μmol/g干凝胶)·(μmol/g干凝胶)·(μmol/g干凝胶)·(±5％) (±5％)(±5％)tacn 185(41％) 305(68％) 11.1Lbut293(42％) 506(72％) 18.3Lox246(34％) 510(70％) 20.9Lmx267(35％) 552(72％) 20.4Lpx246(33％) 553(74％) 21.2C-连接的Lmx284(41％) 496(72％) 21.6*括弧中的值是表示为从配体表面密度计算出的最大理论摄取摄取百分数的金属离子含量。
为了证实官能化凝胶对Cu2+离子明显快速的摄取，实施了一组小规模实验来建立获得平衡所需的孵育时间。该结果显示了平衡很快得以实现，在室温混合30分钟后发生的摄取中具有很少或没有可检测的增加。示意图11中显示了代表性的摄取曲线。基于该研究结果，选择30分钟的标准吸收时间用于随后的Cu2+-负载支持物的制备。
示意图11.tacn-(·)和LPX(■)-官能化SepharoseTMCL-4B凝胶摄取Cu2+的时间认识到所观察到的Cu2+结合亚最大程度，其与Ni2+摄取相反，并不表现为由于缓慢达到平衡的可能原因是有趣的。而Cu2+-结合IDA-SepharoseTM支持物的金属离子配体比已报道为约1∶1[参见，例如，Porath，J-和Belew，M.Journal of ChromatograpHy，516(1990)333；和Jiang，W.和Hearn，M.T.W.AnalyticalBi℃hemistry，242(1996)45]，所观察到的约70％的结合程度与将固定化配体与单独的N-供体或N-供体与醚-型O-供体联合进行掺入的多种支持物上那些观察到的一致[参见，例如，Gros，C.，Rabiet，F.，Denat，F.，Brandes，S.，Collet，H.和Guilard，R.Journal ofthe Chemical Society，Dolton Transactions，(1996)1209；vanBerkel，P.M.，Driessen，W.L.，Kodhaas，G.J.A.A.，Reedijk，J.和Sherrington，D.C.Journal of the Chemical Society.，ChemicalCommunications，.(1995)147；和Dud-ler，V.，Lindoy，L.F.，Sallin，D.和Schlaepfer，C.W.Australian Journal of Chemistry，40(1987)1557]。金属离子对这些固定系统中某些的结合依赖性已被用于反映与三维多聚网路相关的不同的空间效应(参见van Berkel，P.M.等和Dudler，V.等在上述引文中)。所述空间障碍可能在诱导不利构象改变时降低了某些位点结合特定金属离子的能力，或可能限制了金属离子与特定位点的接近。对于此处报道的吸附剂，降低的Cu2+配体比率还可能是部分由于CuL22+模式的形成，该模式中Cu2+离子夹在凝胶表面上邻近的配体(L)的tacn环对之间(示意图12)。然而，获得相对高程度的结合，显示了其主要模式可能为CuL2+和Cu2L2+(分别针对tacn-和双(tacn)-官能化吸附剂)。很重要地，注意到Cu2+离子的摄取(表示为由配体表面密度所预测的最大程度的百分比)在所有情况下均实质上相同。
示意图12。可能的夹心结构，包括毗邻的固定化配体，其可在Cu2+-负载tacn-和双(tacn)-官能化SEPHAROSETMCL-4B凝胶表面上形成。
为进一步评价根据本发明的新Cu2+-负载的吸附剂用于IMAC的适用性，将在随后用于蛋白/肽结合研究的多种不同的平衡条件下检测金属离子滤出的系统抵抗性。在用水和20mM醋酸缓冲液(pH5)洗涤金属离子负载的支持物以便除去松弛结合的金属离子之后，用如下液体的一种20mM醋酸盐缓冲液，20mM磷酸缓冲液(pH7)，20mM硼酸缓冲液(pH9)，200mM咪唑或200mM Na2EDTA溶液进一步洗涤吸附剂，示意图13中显示了结果。除Na2EDTA溶液外，在这些溶液均发现了可忽略的金属粒子的漏出，这证实了该固定化复合物的高稳定性。然而，用Na2EDTA的处理的延长导致了超过80％固定化Cu2+离子的洗脱。
示意图13.Cu2+-tacn-(·)和-Lpx-官能化(■)SepharoseTMCL-4B凝胶用多种溶液洗涤后的Cu2+含量。洗涤1＝20mM NaOAc/1MNaCl/pH5；洗涤2＝20mM NaOAc/1M NaCl/pH5；洗涤3＝20mMNa2HPO4/1M NaCl/pH7；洗涤4＝20mM Na2B4O7/1M NaCl/pH9；洗涤5＝200mM咪唑；洗涤6＝200mM Na2EDTA。
下述表8和表9中总结了此处所述的本发明相关方面的相关性和显著性的平衡数据。
表8.用于IMAC的tacn，双(tacn)和相关配体的稳定常数数据的总结

aM.T.W.Hearn等，本研究；bR.Yang和L.J.Zompa，无机化学，15，1499，1976；cM.Zachariou，I.Traverso，L.Spiccia，M.T.W.Hearn，J.pHys.Chem.，100，12680，1996。dA.Hulanicki，和T.Krawczyk，Anal.Chim.Acta，158，343，1984。eG.Arena和V.Cucinotta，Inorg.Chim.Acta，52，275，1981。fL.Anderegg，Helv.Chim.Acta，47，1801，1964。gD.Sanna，I.Bodi，S Bouhsina和G.Micera，Dalton Trans，3275，1999。hG.Anderegg，Pure&Appl.Chem.，54，2693，1982。IH Irving和M.Miles，J.Chem.S℃.(A)，727，1966。
N.D.＝未测定。
表8(续)。
a数据取自B.DasGupta，C.Katz，T.Israel，M.Watson和L.J.Zompa，Inorg.Chim.Acta.292，172，1999；M.T.W.Hearn等，本研究。
N.D.＝未测定。
表9.蛋白与固定化Cu(II)tacn配体系统在pH＝7.0下模式的结合方式的典型性比较关联常数。
实施例125 Cu2+-负载的凝胶的光谱性质研究为获得关于固定在吸附剂表面上的Cu2+离子的配位环境的信息，记录Cu2+-负载支持物的漫反射系数和ESR谱。每一漫反射光谱均显示了可见光区域内以约640nm为中心的非常宽的条带，这与在非-固定双(tacn)配体溶液中的铜(II)复合物和位于正方-锥或四边形变形的八面体配位环境中的铜(II)指征所观察的相似。在约1100nm观察到的“游离”复合物低密度条带在凝胶的漫反射光谱中未观察到。
Cu2+-负载凝胶的X-条带ESR谱(测于77K)，在各例中显示了约3200G的强信号，是核自旋3/2的单核铜(II)复合物所发现的典型谱；四个预期的高精信号中的三个是可视的，而第四个藏于g⊥线下[参见Hathaway，B.J.In Comprehensive CoordinationChemistry；Wilkinson，G.，Gillard，R.D.和McCleverty，J.A.(编)，Pergamon Press，Oxford，1987，Vol.5，p533]。Tacn凝胶的信号可被良好分辨。双(tacn)凝胶的信号稍宽，这反映了如下事实，配体的两个半部由于固定于凝胶表面而变得不平衡。因此每个配体结合的两个铜(II)中心的配位环境预期略有不同。吸附剂的ESR光谱与那些具有在SP或四边形-扭曲的八面体配位环境中残留的Cu2+离子的特征参数(g||＝2.24，g⊥＝2.05-2.07，A||＝170×10-4cm-1)的“游离”铜(II)复合物非常相似(参见Hathaway，B.J.，如上引用的。)。存在于凝胶表面的复合物种类因此与天然的由溶液中配体形成的铜(II)复合物相似。
实施例126除了在实验部分(见上)介绍中提供的信息外，下面提供了关于，特别是，在本发明相关方面中应用的多种材料、试剂和步骤进一步描述。
TACN和双(TACN)配体在SEPHAROSETMCL-4B上的大规模固定抽吸干燥的SepharoseTMCL-4B(300g)，用水(5×300ml)充分洗涤，置于圆底烧瓶内，并采用顶部机械搅拌器的方法与1M NaOH(300ml)和NaBH4(1.2g)于室温下混合1小时。然后加入表氯醇(100ml)，进一步搅拌悬液6小时。通过真空过滤收集得到的环氧-活化的凝胶，用水(5×300ml)，20％EtOH/水(5×300ml)，再次用水(5×300ml)充分洗涤。所述配体[tacn和双(tacn)配体Leth，Lprop，LbutLox，Lmx和LPX]的75mM溶液通过将3.75mmol量的每个配体的氢溴酸盐溶解于水(40ml)中，用6M NaOH调整其pH为11，然后加水补至50ml制成。在该溶液中加入60g的抽吸干燥的环氧-活化的凝胶，采用振荡水浴在60℃混悬15小时。采用真空过滤收集得到的官能化凝胶，用水(5×200ml)，50mM醋酸/0.1M KNO3(pH4)(2×200ml)洗涤，再用水(5×200ml)洗涤一次。将凝胶储存于4℃的20％EtOH/水中备用。
SEPHAROSETMCL-4B上双(TACN)配体的装配抽吸干燥的环氧-活化的SepharoseTMCL-4B凝胶gel(80g)(按上述制备的)悬浮于24％甲胺水溶液中，并在60℃搅拌混合物15小时。然后采用真空过滤的方法滤过得到的胺化凝胶，并用水(10×200ml)，50mM醋酸/0.1M KNO3/pH4缓冲液(4×100ml)洗涤，再用水(12×200ml)洗涤。部分胺化凝胶(15g)留出用于氮分析。残余物用三次100ml部分5％三乙胺/水，20％乙腈/5％三乙胺/水，40％乙腈/5％三乙胺/水，60％乙腈/5％三乙胺/水，80％乙腈/5％三乙胺/水，95％乙腈/5％三乙胺，最后在(6×100ml)乙腈顺序洗涤向凝胶中加入乙腈使悬液总体积为170ml。加入1，3，5-三(溴甲基)苯(10g，28mmol)的乙腈溶液(30ml)，然后于室温快速摇动混合液18小时。然后滤出凝胶并用乙腈(5×100ml)洗涤。将乙腈加入凝胶使得悬液总体积为130ml。然后加入无碱形式的tacn(6.5g，50mmol)的乙腈(40ml)溶液，于室温强烈摇动混合液22小时。滤出凝胶并用两个50ml部分乙腈75％乙腈/水，50％乙腈/水，25％乙腈/水，水，50mM醋酸/0.1M KNO3/pH4缓冲液次序洗涤，并再用水洗涤一次。该凝胶于4℃下保存在20％EtOH/水中。
配体-官能化SEPHAROSETMCL-4B吸附剂的氮分析检测官能化凝胶的氮含量以确定配体固定化程度。对每一凝胶来说，将约20g抽吸干燥的物质在20％丙酮/水(50ml)悬浮2分钟。然后通过轻柔真空过滤除去大量溶剂，注意不要使凝胶变干(在这一阶段的凝胶干燥已被认为可以导致吸附剂聚集)。进一步以相同的方式用20％丙酮/水洗涤凝胶。使用增加的丙酮含量(20％增量)的溶液重复该双洗涤步骤直至凝胶进入纯丙酮。
然后在彻底抽吸干燥前用丙酮(50ml)再次洗涤凝胶，然后在高真空下干燥24小时。采用Kieldahl方法分析干燥吸附剂的总氮含量。
将Cu2+和Ni2+离子上样于官能化SEPHAROSETMCL-4B吸附剂上在含有50mM适宜金属的硝酸盐水溶液(5ml)的10ml闪烁瓶中加入部分(0.5g)抽吸干燥的吸附剂，于60℃下颠倒混合1小时。为实现Cu2+上样，在0.5小时至20小时的时间内实施该步骤若干次以便建立Cu2+摄取与时间的变量。然后通过真空过滤收集凝胶，并用水(3×50m)，20mM NaOAc/1M NaCl/pH5缓冲液(2×25ml)和水(3×50ml)持续洗涤，使得在这些溶液的加入和用真空过滤将其除去之间有3分钟的平衡时间。
Cu2+和Ni2+离子在官能化SEPHAROSETMCL-4B吸附剂上上样的标准条件通过将4g的部分抽吸干燥的凝胶与50mM Cu(NO3)2·3H2O(50ml)在50ml闪烁瓶中于室温下孵育30分钟实施Cu2+离子在官能化吸附剂上的大规模上样(结合)，因为初步摄取实验(实施例124；见上)已经显示出这已是足够长的时间。然后通过真空过滤收集金属离子-负载的吸附剂，水(5×100ml)洗涤，然后在20mM NaOAc/1MNaCl/pH5缓冲液(50ml)悬浮15分钟。滤出凝胶，再用pH5缓冲液的等份(50ml)洗涤，然后用水(3×100ml)，持续3分钟洗涤平衡时间。
缓冲液平衡实验选择相关的具体描述将部分(0.5g)抽吸干燥的Cu2+-负载吸附剂在20ml闪烁瓶于室温下用下述(10ml)溶液孵育特定时间；然后在再用20mMNa2HPO4/1M NaCl/pH7缓冲液的等份(10ml)洗涤，然后用水(3×50ml)，持续3分钟洗涤平衡时间前，通过真空过滤收集分离凝胶。
溶液1)20mM Na2HPO4/1M NaCl/pH7缓冲液，10分钟。
2)20mM Na2B4O7/1M NaCVL/pH9缓冲液，10分钟。
3)200mM咪唑，10分钟。
4)200mM Na2EDTA，30分钟。
Cu2+-和Ni2+-负载SEPHAROSETMCL-4B吸附剂的金属分析对每一金属离子-负载吸附剂样品，将约0.5g的抽吸干燥的材料经过纯丙酮，并在高真空下采用上述用于无金属离子的凝胶的方法将其干燥。然后在可密封的20ml闪烁瓶中准确称重约20mg的干吸附剂并在4M HCl(4ml)中于50℃消化4小时，期间频繁颠倒瓶子。得到的微黄-棕溶液用水稀释至8ml体积，然后通过原子吸收分光光度法分析铜含量。为了测定就膨胀的凝胶体积而言的吸附剂的金属含量，使用通过将凝胶置于水中并调整上述凝胶的液体体积与柱床体积相同的方法制备的50％(v/v)凝胶/水悬液等份(1ml)重复该测定。
Cu2+-负载的SEPHAROSETMT_CL-4B吸附剂的漫反射和ESR光谱采用根据上述方法在已经在高真空下干燥的样品记录漫反射光谱。采用经20mM NaOAc/1M NaCl/pH5缓冲液洗涤的凝胶之抽吸干燥的样品记录ESR光谱。
实施例127用于表达N-末端与称为NT1(SEQ.ID NO.1)的寡肽“标记”融合的全长重组谷胱甘肽S--转移酶[r-GST(FL)][融合蛋白称为GST(FL)-NT1]的表达质粒的构建实施为表达GST-NT1而构建的质粒(如实施例86中所述)的定点诱变(SDM)，以便修饰GST编码序列的C-末端来获得全长构建体。通过SDM引入单碱基改变GST，其中编码赖氨酸残基(密码子AAA)变为终止密码子(TAA)。在N-末端标记的重组GST融合蛋白(GST-NT1)表达质粒中去除终止密码子，导致质粒能够用于表达N-末端标记的重组GST融合蛋白，GST-NT1，其中GST分别通过四氨基酸Lys-Ser-Asp-Leu在C-末端延伸。该得到的表达质粒被命名为全长谷胱甘肽S-转移酶[GST(FL)]，由于C-末端赖氨酸残基编码全长GST序列再加额外的三个C-末端残基(所述残基可以来自，例如，来自用于制备初始构建体的pGEX3XGST载体)的复原。
SDM步骤的实施参照QuickChangeTM定点诱变试剂盒使用手册，Catalog#200518，Revision#1000007，Stratagene中所描述的内容。
定点诱变反应为表达如实施例86中所述的N-末端标记的GST融合蛋白GST-NT1而构建的表达质粒用作模板DNA。用于掺入合所需碱基改变(下划线标出)的寡核苷酸如下寡核苷酸编号15 ′GGCGACCATCCTCCTAAATCGGATCTGTAAAAGC3`寡核苷酸编号25′GCTTTTACAGATCCGATTTTAGGAGGATGGTCGCC3`将大约25ng dsDNA模板加入含有含有125ng的编号1的寡核苷酸，125ng的编号2的寡核苷酸，5μl 10×反应缓冲液和1μL的dNTP′的混合液中。双蒸水将反应混合物的体积调整为50μ。在该混合物中加入2.5U的Pfu Turbo DNA聚合酶，然后用液体石蜡覆盖反应混合物。
然后将反应混合物置于温度循环仪中使用下述条件(a)95℃，30秒的起始变性步骤，然后(b)95℃，30秒(c)55℃，1分钟12个循环，然后(d)68℃，10分钟。在温度循环终止时取出反应物，并置于冰上冷却2分钟。然后将10U的限制性酶DpnI用于扩增反应，然后将混合液轻柔而彻底地摇匀。然后在微量离心机中旋甩混合液1分钟，然后立即至于37℃孵育1小时。
转化至XL-1-蓝色感受态细胞将5μL的DpnI-处理的来自前述反应的DNA加至50μl等份的XL-1蓝色超感受态细胞，混合液置于冰上30分钟。然后将该混合液于42℃脉冲加热45秒，然后在冰上冷却2分钟。在加入0.5ml SOC培养液[加入了5mM MgCl2，5mMMgSO4和20mM葡萄糖并滤过灭菌的5ml SOB(胰胨20g/L，酵母提取物5g/L，2.5mM NaCl和625μM KCl，并高压灭菌)]以后，将转化反应物于37℃孵育1小时。将不同稀释度的转化混合物铺于LB氨苄青霉素板上(胰胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，加入琼脂15g/L并高压灭菌，然后加入氨苄青霉素100mg/L)。将板于37℃孵育过夜。
阳性克隆的鉴定采用标准技术从上述XL-1蓝色转化体中分离修饰的质粒DNA。按照如下方法实施分离质粒DNA的DNA测序在15μL体积中，大约200ng的修饰质粒DNA，5pmol引物和6μl的终止子预混物。制备上述反应的双份混合液，一份含有(a)pTrc正向引物5′TTGACAATTAATCATCCGGC3′，另一份含有(b)pTrc反向引物5′CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG3′。
然后将反应混合物置于温度循环仪中使用下述条件(a)96℃，1分钟的起始变性步骤，然后25个循环，每个循环含有(b)96℃，30秒，和(c)45℃，15秒，然后(d)60℃，4分钟。通过使用标准技术实施乙醇/醋酸钠沉淀来回收延伸产物，然后干燥沉淀物，然后进行DNA测序。鉴定含有编码GST(FL)-NT1的所需质粒的克隆并证实为正确的。
表达细胞的转化采用标准技术，用约100ng修饰的表达质粒转化氯化铷处理的大肠杆菌细胞株JM105、BL21和TOP10。将不同稀释度的转化细胞置于LB氨苄青霉素板上以选择含有质粒的细胞。
实施例128用于表达N-末端与称为CT2的寡肽“标记”Met-Lys-(His-Gln)6融合的全长重组谷胱甘肽S-转移酶[r-GST(FL)][融合蛋白称为GST(FL)-CT2]的表达质粒的构建方法基本上与实施例127中描述的相同，除了如实施例88中所述用于表达GST-CT2而构建的质粒的定点诱变(SDM)的实施是为了修饰GST编码序列的C-末端。
实施例129用于表达N-末端与称为NT2(SEQ.ID NO.2)的寡肽“标记”融合的全长重组谷胱甘肽S-转移酶[r-GST(FL)][融合蛋白称为GST(FL)-NT2]的表达质粒的构建方法基本上与实施例127中描述的相同，除了如实施例89中所述用于表达GST-NT2而构建的质粒的定点诱变(SDM)的实施是为了修饰GST编码序列的C-末端。
实施例130在大肠杆菌细胞株JM105中大规模表达N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2如实施例128中所述，用GST(FL)-CT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株JM105。转化细胞在含有LB氨苄青霉素的培养液的有盖培养皿上于37℃培养过夜。在补加100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(胰胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l并高压灭菌)上接种来自有盖培养皿的单个克隆，然后于37℃摇动培养过夜。在补加100μg/ml氨苄青霉素的500ml的2×YT培养液(胰胨16g/l，酵母提取物10g/l，NaCl 5g/l并高压灭菌，pH7.0并高压灭菌)(2×YTA)上接种过夜培养物的1/100稀释液，然后于37℃下摇动，直至600nm(A600)吸收值达到0.6-1.0。通过加入终浓度为1mM的IPTG诱导基因表达。在诱导后6-7小时收集培养物中的细胞。细胞在25ml冰冷的1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8Mm KH2PO4，pH7.3)中重悬，然后进行超声裂解。沉淀后，收集细胞裂解液。
实施例131在大肠杆菌细胞株JM105中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1除了用按照实施例127中所述的GST(FL)-NT1表达质粒转化大肠杆菌细胞株JM105外，方法基本上与实施例130中描述的相同。
实施例132在大肠杆菌细胞株JM105中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2除了用按照实施例129中所述的GST(FL)-NT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株JM105外，方法基本上与实施例130中描述的相同。
实施例133在大肠杆菌细胞株BL21中大规模表达N-末端Met-Lys-(His-Gin)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2除了用GST(FL)-CT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株BL21外，方法基本上与实施例130中描述的相同。
实施例134在大肠杆菌细胞株BL21中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1
除了用GST(FL)-NT1表达质粒转化大肠杆菌细胞株BL21外，方法基本上与实施例131中描述的相同。
实施例135在大肠杆菌细胞株BL21中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2除了用GST(FL)-NT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株BL21外，方法基本上与实施例132中描述的相同。
实施例136在大肠杆菌细胞TOP10中大规模表达N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2除了用GST(FL)-CT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株TOP10外，方法基本上与实施例130中描述的相同。
实施例137在大肠杆菌细胞TOP10中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1除了用GST(FL)-NT1表达质粒转化大肠杆菌细胞株TOP10外，方法基本上与实施例131中描述的相同。
实施例138在大肠杆菌细胞TOP10中大规模表达N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2除了用GST(FL)-NT2表达质粒转化大肠杆菌细胞株TOP10外，方法基本上与实施例132中描述的相同。
实施例139在大肠杆菌株JM105中表达的N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2的纯化按实施例128(上述)中描述表达的N-末端标记的GST(FL)融合蛋白GST(FL)-CT2可通过基本上如实施例93中所述的使用固定化Ni2+-tacn，Cu2+-tacn，Ni2+-dtne，Cu2+-dtne，Ni2+-dtnp，Cu2+-dtnp或其它的金属离子鳌合的大环三或四-tacn系统作为适宜层析吸附剂分批或柱层析法进行纯化。用缓冲液B(缓冲液B＝加入了10mM咪唑，pH8.4的缓冲液A；缓冲液A＝445mM NaCl，7.5mM Na2HPO4和2.5mM NaH2PO4·2H2O，pH7.2)孵育每个柱。用每毫升凝胶250μl的粗制裂解物(以1比4在缓冲液B中稀释)上样柱。
然后在洗脱前用缓冲液B洗涤柱子两次。使用两个洗脱步骤用缓冲液1(缓冲液1＝加入了50mM咪唑的缓冲液A，pH9.7)洗脱，然后用10M氢氧化钠将pH调整为8.0的200mM丙二酸钠进行第二次洗脱。另外，可采用谷胱甘肽SepharoseTM4B(GS4B)纯化这些GST融合蛋白。在该例中，按照来自pHarmacia Biotech的GSTGene融合系统，第3版，修订1的手册实施分批纯化。简言之，将24ml细胞裂解液(如实施例130中所述)加在已洗涤并用1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)平衡的0.75ml柱床体积的GS4B上。
得到的混合液采用端对端于室温下旋转孵育大约1小时。500×g离心混合液5分钟。收集上清，并用1×PBS彻底洗涤凝胶。用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCI pH8，10mM还原型谷胱甘肽)洗脱融合蛋白。
收集洗脱液，然后加样于10ml Econo-柱(Bio-Rad上样)以便除去任何残留的缓冲液盐或GS4B。用4.7mM乙二胺四乙酸(EDTA)于室温孵育洗脱液20分钟，然后于4℃用缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.9)充分透析。透析后，将蛋白质经过0.45μm无菌滤器(Millipore)。使用二金鸡纳酸(BCA)试剂(Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL，美国) 并使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定过滤前和后的蛋白质浓度。然后将纯化的融合蛋白保存于4℃。
实施例140在大肠杆菌株JM105中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1，的分批纯化除了纯化如实施例131中所述的粗制细胞裂解液外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例141在大肠杆菌株JM105中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2，的分批纯化除了纯化如实施例132中所述的粗制细胞裂解液外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例142在大肠杆菌株BL21中表达的N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2，的分批纯化除了纯化如实施例133中所述的粗制细胞裂解液外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例143在大肠杆菌株BL21中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1，的分批纯化除了如实施例134中所述的粗制细胞裂解液用纯化蛋白片段化而非在EDTA中孵育外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例144在大肠杆菌株BL21中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2，的分批纯化除了如实施例135中所述的粗制细胞裂解液用纯化蛋白片段化而非在EDTA中孵育外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例145在大肠杆菌株TOP10中表达的N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2，的分批纯化除了如实施例136中所述的粗制细胞裂解液用纯化蛋白片段化而非在EDTA中孵育外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例146在大肠杆菌株TOP10中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1，的分批纯化除了如实施例137中所述的粗制细胞裂解液用纯化蛋白片段化而非在EDTA中孵育外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例147在大肠杆菌株TOP10中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2，的分批纯化除了如实施例138中所述的粗制细胞裂解液用纯化蛋白片段化而非在EDTA中孵育外，方法基本上与实施例139中描述的相同。
实施例148采用MALDI-TOF MS测定在多种大肠杆菌细胞株中表达的N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2的分子量。
采用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)测定在多种大肠杆菌细胞株中表达并按照实施例139，142和145中所描述的方法纯化的、透析的N-末端标记的GST(FL)-CT2融合蛋白的分子量。获自谷胱甘肽SepharoseTM4B(GS4B)纯化步骤的非还原型蛋白样品导致实验[M+H]+值高于预期理论分子量，与在谷胱甘肽纯化期间由还原型谷胱甘肽(GSH)S-巯基化的GST蛋白(描述于实施例136，142和145中)一致。
然而，通过加入β-巯基乙醇的蛋白质样品还原，导致实验[M+H]+值与预期理论分子量一致。由此，按这一方式制备全部用MALDI-TOF MS分析的样品。
未用4.7mM EDTA预先孵育的蛋白样品按这一方式于室温下处理20分钟。然后用β-巯基乙醇(终浓度为50mM)孵育蛋白质，然后用C18ZipTipTM(MilliporeTM)除去盐分，保藏于-20℃直至分析。将样品采用碎晶体法加至芥子酸基质。采用Voyager-DE STRBioSpectrometry Workstation记录谱。用25kV加速电压以阳离子线性模式分析样品，脉冲延迟时间为250ns，5Kda的低量门和85％的栅极电压。每一质谱射100次，累积5个质谱。
GST(FL)-CT2具有28,007.3道尔顿的理论分子量。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-CT2的分子量大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-CT2(如实施例139所述)的光谱显示出平均[M+H]+值为28,006±5.57道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株RL21中表达的GST(FL)-CT2的分子量大肠杆菌细胞株BL21中表达的GST(FL)-CT2(如实施例142所述)的谱显示出平均[M+H]+值为28,008.10±5.29道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-CT2的分子量大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-CT2(如实施例145所述)的光谱显示出平均[M+H]+值为28,003.00±3.46道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
实施例149采用MALDI-TOF MS测定在多种大肠杆菌细胞株中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1的分子量。
除GST(FL)-NT1具有27,965.3道尔顿的理论分子量外，方法基本上与实施例148中描述的相同。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-NT1的分子量大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-NT1(如实施例140所述)的谱显示出平均[M+H]+值为27,953.00±2.65道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在犬肠杆菌细胞株BL21中表达的GST(FL)-NT1的分子量大肠杆菌细胞株BL21中表达的GST(FL)-NT1(如实施例143所述)的谱显示出平均[M+H]+值为27,951.00±4.36道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-NT1的分子量大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-NT1(如实施例146所述)的谱显示出平均[M+H]+值为27,954.67±6.66道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
实施例150采用MALDI-TOF MS测定在多种大肠杆菌细胞株中表达的N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2的分子量。
除了GST(FL)-NT2具有28,218.6道尔顿的理论分子量外，方法基本上与实施例148中描述的相同。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-NT2的分子量大肠杆菌细胞株JM105中表达的GST(FL)-NT2(如实施例141所述)的谱显示出平均[M+H]+值为28,208.00±8.44道尔顿的单峰。实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株BL21中表达的GST(FL)-NT2的分子量大肠杆菌细胞株BL21中表达的GST(FL)-NT2(如实施例144所述)的谱显示出平均[M+H]+值为28,214.33±5.86道尔顿的单峰。
实验数据与完整蛋白一致。
采用MALDI-TOF MS检测在大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-NT2的分子量大肠杆菌细胞株TOP10中表达的GST(FL)-NT2(如实施例147所述)的MALDI-MS谱显示出(a)平均[M+H]+值为28,213.83±6.05道尔顿的主峰(100％强度)；(b)平均[M+H]+值为27,815.83±8.04道尔顿的次峰(～25％强度)；(c)平均[M+H]+值为26,301.0±6.90道尔顿的次峰(～13％强度)。
实验数据与主要完整蛋白和少量N-末端分别截断了首先的3个和首先的15个残基的蛋白的纯化样品一致。这些模式对应于GST(FL)-NT2的截短形式 下述缺失的N末端氨基酸标为斜体次峰 MKH1TNIHQDQHNHFHR--[GST]。
该模式具有27,822.11道尔顿的理论分子量，次峰 MKHTNIHQDQHNHFH1R--[GST]该模式具有26,312.55道尔顿的理论分子量实施例151二肽基氨肽酶I(DAP-1)消化N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2N-末端剪切酶二肽基氨肽酶I[DAP-1(E.C.3.4.14.1)；可获自，例如，Aldrich-Sigma，St Louis，MO，美国或Unizyme Laboratories，Hrsholm，丹麦1(10U/ml)通过加入等体积的DTT(20mM)活化，然后将混合液于室温下孵育4-6分钟。消化反应混合物含有50μg在大肠杆菌细胞株JM105表达的(如实施例139中所述)在N-末端标记的GST(FL)-CT2蛋白和12.5mU活化的DAP-1。通过加入蛋白在其中混悬的缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.9)将反应混合物的体积调整为70μl。然后将反应混合物在37℃水浴中孵育5分钟至约23小时。
在孵育结束时，取出DAP-1消化反应混合物的一等份，通过加入SDS上样缓冲液(还原性)终止反应。将样品于100℃加热90秒，然后保存于-20℃以实施随后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析。
此外，在孵育期结束时，取出DAP-1消化反应混合物的第二个等份，用盐酸胍(加至终浓度为1M)在室温下孵育5分钟以终止消化反应。然后进一步制备该混合物，如实施例148中所述，用于随后的MALDI-TOF MS分析。简言之，这包括加入β-巯基乙醇(至终浓度50mM)来终止反应混合物的消化，然后于室温下孵育15分钟。用C18ZipTipTM除去盐分然后保藏于-20℃。
为了评价在用DAP-1消化时蛋白质样品，并作为阴性对照由此，也制备未消化的(即非-DAP-1-处理)的蛋白样品，GST(FL)-CT2，如实施例139中所述，用于随后的采用MALDI-TOF MS的分子量测定。这包括在用C18ZipTipTM除去盐分之前在蛋白样品中加入β-巯基乙醇(至终浓度50mM)。在随后的采用MALDI-TOF MS分析前将样品保藏于-20℃。
未消化的(即非-DAP-1-处理)的蛋白样品，GST(FL)-CT2，如实施例139中所述，也加入SDS上样缓冲液(还原性)，且在保存于-20℃以实施随后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析之前，于100℃加热90秒。
实施例152用DAP-1消化N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1
方法步骤基本上与实施例151中所述相同，除了下述区别外大肠杆菌细胞株JM105中表达的纯化的GST(FL)-NT1(如实施例140所述)进一步用缓冲液(20mM醋酸钠，150mM NaCl，pH5.5)透析。透析后，使用二金鸡纳酸(BCA)试剂(Pierce Chemical公司，Rockford，IL，美国)并采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定蛋白质浓度。DAP-1消化的反应混合物的孵育时间为5分钟至约24小时。
实施例153用DAP-1消化N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2用DAP-1消化N-末端标记的GST(FL)融合蛋白GST(FL)-NT2的方法步骤基本上与实施例151中所述相同，除了下述区别外大肠杆菌细胞株JM105中表达的纯化的末端标记的GST(FL)融合蛋白GST(FL)-NT2(如实施例141所述)进一步用缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.3)透析。透析后，使用二金鸡纳酸(BCA)试剂(Pierce Chemical公司，Rockford，IL，美国)并采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定蛋白质浓度。消化反应混合物的孵育时间为5分钟至约24小时。
实施例154 N-末端Met-Lys-(His-Gln)6-标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白，GST(FL)-CT2用DAP-1消化前和后的分子量测定用DAP-1处理GST(FL)-CT2的消化反应的条件如实施例151所述。在5分钟至约23小时的孵育期结束时，取出消化反应混合物的一等份，用盐酸胍(加至终浓度为1M)在室温下孵育5分钟，以终止消化反应。然后进一步制备该混合物，如实施例148中所述，用于随后的MALDI-TOF MS分析。简言之，这包括加入β-巯基乙醇(至终浓度50mM)来终止反应混合物的消化，然后于室温下孵育15分钟。用C18ZipTipTMTM除去盐分然后保藏于-20℃。
在DAP-1消化时也制备未消化的(即非-DAP-1-处理)的蛋白样品，GST(FL)-CT2，如实施例139中所述，用于随后的采用MALDI-TOF MS的分子量测定。这包括在用C18ZipTipTM除去盐分之前在蛋白样品中加入β-巯基乙醇(至终浓度50mM)。在随后的采用MALDI-TOF MS分析前将样品保藏于-20℃。
采用MALDI-TOF-MS分析上述样品。采用碎晶体法将每一样品加于芥子酸基质。采用Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstation记录质谱。用25kV加速电压以阳离子线性模式分析样品，脉冲延迟时间为250ns，5Kda的低量门和85％的栅极电压。每一质谱射100次，累积5个质谱。
图53中显示了质谱。无-DAP-1-处理的GST(FL)-CT2融合蛋白(即阴性对照)的质谱显示了具有[M+H]+值为28,013±3-21道尔顿的单峰(标记为1)；与GST(FL)-CT2理论同位素的分子量(28,007.3道尔顿)相比，观测到的分子量与完整的GST(FL)-CT2蛋白一致。DAP-1-消化的GST(FL)-CT2(标记为2)的质谱显示了在用DAP-1处理2小时后分子量降低。
质谱2显示了具有[M+H]+均值为26,1546±6道尔顿的主峰(2a)和具有[M+H]+均值为25,931±7.51道尔顿的次峰(2b)。这些模式对应于GST(FL)-CT2的截短形式下述缺失的N末端氨基酸标为斜体峰(2a)MKHQHQHQHQHQHQ1VDQMSP--[GST]。
(该模式具有26,156.3道尔顿的理论分子量)；峰(2b) MKHQHQHQHQHQHQVD1QMSP--[GST](该模式具有25,942.1道尔顿的理论分子量)其中1V和1Q对应于用DAP-1消化后GST(FL)-CT2的截短变体的N-末端氨基酸残基。基于DAP-1的明显的特异性，进一步剪切发生在DAP-的终止位点1SP--[GST]，其中1S是N-末端氨基酸残基。
实施例155 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，GST(FL)-NT1用DAP-1消化前和后的分子量测定分子量除在如实施例152所述的消化的条件下用DAP-1处理GST(FL)-NT1外，方法基本上与实施例154中描述的相同。消化反应混合物的孵育时间为5分钟～大约24小时。
DAP-1消化时，制备非消化的(即无-DAP-1-处理的)的蛋白GST(FL)-NT1，如实施例140中所述。
图54中显示了质谱。无-DAP-1-处理的GST(FL)-NT1融合蛋白(即阴性对照)的质谱显示了具有[M+H]+值为27,972±3.51道尔顿的单峰(标记为1)；与GST(FL)-NT1理论同位素的分子量(27,965.3道尔顿)相比，观测到的分子量与完整的GST(FL)-NT1蛋白一致。DAP-1-消化的GST(FL)-CT2(标记为2)的质谱显示了在用DAP-1处理2小时后分子量降低。
质谱2显示了具有[M+H]+均值为26,659±6.81道尔顿的主峰(2a)和具有[M+H]+均值为25,934±3.21道尔顿的次峰(2b)和另一具有[M+H]+均值为25,680±6.03道尔顿的次峰(2c)。这些模式对应于GST(FL)-NT1的截短形式下述缺失的N末端氨基酸标为斜体峰(2a)MKHHHNSWDH DINRVD1QMSP--[GST]。
(该模式具有26,654.9道尔顿的理论分子量)；峰 (2b) MKHHHNSWDHDINRVD1QMSP--[GST](该模式具有25,942.1道尔顿的理论分子量)，峰 (2c) MKHHHNSWDHDINRVDQM1SP--[GST](该模式具有25,682.80道尔顿的理论分子量)其中1D.....，1Q.....和1S.....对应于用DAP-1消化后GST(FL)-NT1的截短变体的N-末端氨基酸残基。基于DAP-1的明显的特异性，剪切发生在DAP-的终止位点1SP--[GST]，其中1S是N-末端氨基酸残基。质谱中的次要峰相应于芥子酸加合物(其附加分子量为224.2Da)和β-巯基乙醇(MW 78.13)也是很明显的。
实施例156 N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.2)融合蛋白，GST(FL)-NT2用DAP-1消化前和后的分子量测定分子量除在如实施例153所述的消化的条件下用DAP-1处理GST(FL)-NT2外，方法基本上与实施例154中描述的相同。消化反应混合物的孵育时间为5分钟～大约24小时。
DAP-1消化时，制备非消化的(即无-DAP-1-处理的)的蛋白GST(FL)-NT2，如实施例141中所述，的质谱。
图55中显示了质谱。无-DAP-1-处理的GST(FL)-NT2融合蛋白，即阴性对照，的质谱显示了具有[M+H]+值为28,223±2.89道尔顿的单峰(标记为1)；与理论同位素GST(FL)-NT2的分子量(28,218.6道尔顿)相比，观测到的分子量与完整的GST(FL)-NT1蛋白一致。DAP-1-消化的GST(FL)-CT2(标记为2)的质谱显示了在用DAP-1处理2小时后分子量降低。
质谱2显示了具有[M+H]+均值为25,910±9.16道尔顿的主峰(2a)和具有[M+H]+均值为25,648±12.86道尔顿的次峰(2b)。这些模式对应于GST(FL)-NT2的截短形式下述缺失的N末端氨基酸标为斜体峰(2a)MKHTNIHQDQHNHFHRVD1QMSP--[GST]。
(该模式具有25,942.1道尔顿的理论分子量)；峰(2b)MKHTNIHQDQHNHFHRVDQM1SP--[GST](该模式具有25,682.8道尔顿的理论分子量)。
1Q。。。。。和1S。。。。。对应于用DAP-1消化后GST(FL)-NT2的截取变体的N-末端氨基酸残基。基于DAP-1的明显的特异性，剪切发生在DAP-的终止位点1SP--[GST]，其中′S是N-末端氨基酸残基。
实施例157 N-末端标记多种寡肽构建体[例如GST(FL)-CT2，GST(FL)-NT1和GST(FL)-NT2]的多种重组全长谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白用DAP-1消化前和后的SDS-PAGE分析将多种N-末端标记的重组谷胱甘肽S-转移酶全长融合蛋白的等份，在DAP-1消化前和后，与SDS上样缓冲液(还原性)混合，100℃加热90秒，如实施例151，152和153中所述。然后将样品加样于18％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳适合的一段时间。0.4μl的未消化的(即非-DAP-1-处理的)蛋白，0.6μl DAP消化反应混合物和8μl分子量标准[BenchMark蛋白梯(Gibco BRL)]上样于凝胶上。为了显示条带，银染凝胶。图56中显示了染色的凝胶。
实施例158检测N-末端标记称为NT1的寡肽的重组全长谷胱甘肽S-转移酶[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，即GST(FL)-NT1用DAP-1消化前和后的活性制备DAP-1消化反应混合物，方法基本上与实施例92和152中所述相同。简言之，通过加入等体积的DTT(20mM)然后将混合液于室温下孵育4-6分钟活化DAP-1(E.C.3.4.14.1)(10U/ml)。消化反应混合物含有50μg在大肠杆菌细胞株JM105表达的，如实施例140和152中所述，在N-末端标记的GST(FL)-NT1蛋白和12.5mU活化的DAP-1。通过加入蛋白在其中混悬的缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH5.5)将反应混合物的体积调整为70μl。然后将反应混合物在37℃水浴中孵育约24小时。
制备无-DAP-1-处理的，阴性对照反应混合物。除略去DAP-1外，方法基本上与上述相同。
在孵育期终止时，评估两个反应的活性。用于官能性GST活性的一个可靠的检测方法是CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)检测法，其中GST用谷胱甘肽催化CDNB的衍生物；可通过340nm波长的光学检测法监测该复合物。该检测法按照来自pHarmacia Biotech的GSTGene融合系统，第3版，修订1的手册信息实施分批纯化。简言之，将10μl 1/100稀释的每一DAP-1-消化前和后反应混合物加入比色杯中100μl含有100mM KH2PO4，pH6.5，1mM 1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)和1mM还原型谷胱甘肽的反应混合物中，并以1分钟间隔检测5分钟的340nm的吸收值。在DAP-1-消化前和后含有GST(FL)-NT1的反应混合物表现出如通过该检测法确定的官能性GST活性。
实施例159检测N-末端标记称为NT2的寡肽的重组全长谷胱甘肽S-转移酶[r-GST(FL)](SEQ.ID NO.1)融合蛋白，即GST(FL)-NT2用DAP-1消化前和后的活性。
除了消化反应混合物含有50μg在大肠杆菌细胞株JM105表达的，如实施例141和153中所述，在N-末端标记的GST(FL)-NT2蛋白和12.5mU活化的DAP-1。通过加入蛋白在其中混悬的缓冲液(20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.3)将反应混合物的体积调整为70μl。然后将反应混合物在37℃水浴中孵育约12小时外，方法基本上与实施例158中描述的相同。
制备无-DAP-1-处理的，阴性对照反应混合物。除略去DAP外，方法基本上与上述相同。
在DAP-1-消化前和后的反应混合物均含有表现出如本实验所测定的功能性GST活性的GST(FL)-NT2。
实施例160多种N-末端标记的GST融合蛋白的单步无梯度洗脱从N-末端与下述多种亲和标记6-组氨酸(GST-CT1)，交替的His-Gln重复(GST-CT2)，新标记1(GST-NT1)和NT2(GST-NT2)融合的谷胱甘肽S-转移酶(GST)(如实施例91中所述)的大规模表达中获得的粗制细胞裂解液(CCL)用单步无梯度洗脱步骤进行纯化。粗制细胞裂解液加在Ni2+-tacn和Cu2+-tacn柱上。每一柱(10mLEcono-柱，Bio-RadTM)的柱床体积为0.5mL，并用缓冲液A1[缓冲液A1＝缓冲液A(20mM磷酸缓冲液，500mM NaCl，pH8)+10mM咪唑，pH8]平衡。用含有0.5ml(CCL)+4.5ml缓冲液A1的5ml样品上样柱子。在样品经过柱子后，用缓冲液A1(5ml)洗涤柱子。使用缓冲液A2(5ml)(缓冲液A2＝缓冲液A+20mM咪唑，pH8)再次实施洗涤。采用3×1ml体积的洗脱缓冲液(BA+500mM咪唑，pH8)对柱子实施洗脱。
实施例161单步无梯度洗脱对多种N-末端标记的GST融合蛋白纯化所得的首个洗脱部分的SDS-PAGE分析单步无梯度洗脱对多种已经按实施例160所述用于Ni2+-tacn和Cu2+-tacn柱N-末端标记的GST融合蛋白纯化所得的首个洗脱部分的等份蛋白与SDS上样缓冲液(还原性)混合，然后于100℃加热90秒。然后将样品上样于15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后电泳一段适合的时间。16μl洗脱部分和2μl分子量标准[Benchmark蛋白梯度标准物(Gibco，BRL)]上样于凝胶上。为了观察条带，银染凝胶。图57中显示了染色的凝胶。
实施例162纯化N-末端NT2-VD-标记的人生长激素(NT2-VD-hGH；MKHTNIHQDQHNHFHRVD-hGH)的纯化。用DAP-1剪切标记并分离成熟hGH使用基本按实施例127中所述制备的质粒构建体在1升振动瓶中表达N-末端标记的融合蛋白NT2-VD-hGH，即MKHTNIHQDQHNHFHRVD-hGH。收集沉淀物，用水洗涤。然后将来自250ml的沉淀物在裂解缓冲液(20ml 20mM Na2HPO4，500mMNaCl，pH8)中通过加入250μl溶菌酶(30mg/ml)和1.25μlBenzonase实施裂解。悬液于5℃静置1小时，然后离心。收集上清，用80ml裂解缓冲液稀释，然后以3ml/分钟的速率上样于15ml固定化Ni2+-tacn柱，然后加入150ml缓冲液。然后用含有2％洗脱缓冲液(20mM Na2HPO4，500mM NaCl，500ml咪唑，pH8)的50ml裂解缓冲液和含有4％洗脱缓冲液的50ml裂解缓冲液洗涤该柱。实施采用4％至100％的梯度洗脱洗脱缓冲液总体积为75ml，然后用75ml100％洗脱缓冲液洗脱。
通过电泳鉴定含有所需产物的洗脱部分，合并并对20mMNa2HPO4，150mM NaCl，pH6.3脱盐，然后加热至37℃。将活化的DAP-1(125μl DAP-1+25μl 100mM DTT，于室温孵育5分钟)加入脱盐部分，然后270分钟之间将培养液的pH在约6.3和5.1之间变换多次。然后将培养液置于5℃，以pH5过周末。然后离心裂解混合物，收集上清，调整pH至8并加在1ml固定化Ni2+-tacn柱上。然后基本上按上述以0.18ml/min的流速洗脱柱子，收集含有hGH的峰。
下述示意图14中描述了用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析所选样品。
示意图14.(A)胶体蓝染色的SDS-Page(还原)，和(B)所选样品的蛋白质印迹分析。泳道1-6还原的样品；泳道7-10未还原的样品(泳道1分子量标准；泳道2hGH标准；泳道3裂解产物；泳道4分离的标记的hGH；泳道5剪切产物；泳道6第二Ni2+-tacn柱洗脱步骤后剪切产物；泳道7hGH标准；泳道8裂解产物；泳道9剪切产物；泳道10第二Ni2+-tacn柱步骤后剪切产物。
此外，通过MALDI-TOF MS以估测精度50道尔顿分析大量样品，分离的标记产物的分子量被测定为24,444道尔顿(理论值24,402道尔顿)。在剪切后，第二Ni2+-tacn柱洗脱物的分子量被测定为22,156道尔顿(理论值24,125)。针对hGH标准样品得到22,147道尔顿的分子量。
实施例163通过Ni2+-tacn柱洗脱然后通过Cu2+-tacn柱洗脱来纯化CT2-VD-hGH(MKHQHQHQHQHQHQVD-hGH)使用基本按实施例127中所述制备的质粒构建体在1升振动瓶中表达N-末端标记的融合蛋白CT2-VD-hGH，即MKHQHQHQHQHQHQVD-hGH。收集沉淀物，用水洗涤。然后将来自250ml的沉淀物在如实施例162所述的裂解缓冲液中裂解。悬液于5℃静置1小时，然后离心。收集上清，将其一半量用40ml裂解缓冲液稀释，然后以1ml/分钟的速率加在5ml固定化Ni2+-tacn柱，然后加20ml缓冲液。然后用含有2％洗脱缓冲液20mM Na2HPO4，500mM NaCl，500ml咪唑，pH8)的50ml裂解缓冲液和含有4％洗脱缓冲液的50ml裂解缓冲液洗涤该柱。实施采用4％至100％的梯度洗脱，洗脱缓冲液总体积为25ml，然后用25ml 100％洗脱缓冲液洗脱。
通过电泳鉴定含有所需标记产物的洗脱部分，合并并用裂解缓冲液脱盐。脱盐的混合物用5×裂解缓冲液稀释，然后加在5ml Cu2+-tacn柱上。Ni2+-tacn柱的洗脱缓冲液和速率如上述。同样的，含有标记的hGH产物的各部分合并并脱盐。
下述示意图15中描述了用SDS-Page分析所选样品。
示意图15。非还原的SDS-Page。泳道1分子量标准；泳道2hGH标准；泳道3Ni2+-tacn柱纯化透析合并液；泳道4合并液引入后从Ni2+-tacn柱至Cu2+-tacn柱的流量；泳道5洗涤1；泳道6洗涤2；泳道7标记的hGH部分混合液；泳道8如泳道7，但是经过透析的；泳道9hGH标准；泳道10分子量标准。
该结果证实了顺序使用两种不同的M2+-tacn柱实现了非-hGH相关材料含量的大大减少。
权利要求
1.一种官能化聚合物底物，该聚合物底物用含有至少一个环状、金属离子配位配体基团的官能团官能化，所述环状配体基团含有至少3个独立地选自氮、氧和硫的金属离子配位供电子原子。
2.根据权利要求1的官能化聚合物底物，其中所述环状配体基团中的至少1个金属离子配位供电子原子是环原子。
3.根据权利要求1或2的官能化聚合物底物，其中所述聚合物基本上不溶于水。
4.根据权利要求1-3中任一项的官能化聚合物底物，其中所述聚合物选自多糖类及其衍生物；聚亚烷基二醇类及其衍生物；聚乙烯醇类及其衍生物；聚丙烯酰胺类；表面改性的二氧化硅类；和表面改性的金属氧化物。
5.根据前述权利要求中任一项的官能化聚合物底物，其中所述聚合物选自琼脂糖及其衍生物；葡聚糖及其衍生物；和纤维素及其衍生物。
6.根据前述权利要求中任一项的官能化聚合物底物，其中所述的环状、金属离子配位配体基团是在具有至少6个环原子的环中含有至少3个金属离子配位供电子原子的杂环基团。
7.根据前述权利要求中任一项的官能化聚合物底物，所述环状、金属离子配位配体基团是来自具有至少六个环原子的三氮杂环烷的基团。
8.根据前述权利要求中任一项的官能化聚合物底物，其中所述官能团具有通式(I) 式(I)其中n为0或1至3的整数；每个三氮杂环烷环中的每个a、b和c，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，为1至3的整数；每个三氮杂环烷环中每个-CH2-基团中的一个或所有氢原子，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以任选地和独立地用取代基取代；每个三氮杂环烷环中每个-NH-基团中的氢原子，各个之间互相独立并且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以任选地用取代基取代；当n为0时，R是H或取代基；当n为1时，R是双官能基团，所述双官能基团任选地含有一个或多个金属离子配位供电子原子；当n为2或3时，R是(n+1)-官能团，所述(n+1)-官能团任选地含有一个或多个金属离子配位供电子原子；而X是连接/间隔基团。
9.根据权利要求8的官能化聚合物底物，其中取代环-CH2-基团中氢原子的任选取代基选自任选的经取代的低级烷基基团和任选的经取代的芳基基团，所述低级烷基基团或芳基基团上的任选的取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子。
10.根据权利要求8或9的官能化聚合物底物，其中取代环-NH-基团中氢原子的任选取代基选自任选的经取代的低级烷基基团和任选的经取代的芳基基团，所述低级烷基基团或芳基基团上的任选的取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子。
11.根据权利要求8-10中任一项的官能化聚合物底物，其中所述的聚合物底物是琼脂糖；n为0，1，2或3；每个三氮杂环烷环中的a，b和c为2；当n为0时，R是H；当n为1时，R选自-[CH2]m-，其中m为2，3或4 和 及其取代的衍生物；当n为2时，R选自如下基团及其取代的衍生物； 当n为3时，R选自如下基团及其取代的衍生物； X是可衍生自表氯醇的基团，其是通过表氯醇和琼脂糖反应，随后将所得产物与待结合到X上的三氮杂环烷环的环-NH-基团反应。
12.根据前述权利要求中任一项的官能化聚合物底物，其还含有配位到所述官能团中至少一个所述环状配体基团上的金属离子。
13.根据权利要求12的官能化聚合物底物，其中所述配位的金属离子是二价或三价金属离子。
14.根据权利要求13的官能化聚合物底物，其中所述的金属离子选自Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Cr3+。
15.一种制备权利要求1所述的官能化聚合物底物的方法，包括如下步骤选择具有活性官能团的聚合物底物，该活性官能团能够与具有第一和第二官能团的双官能试剂之第一官能团发生第一次反应；所述的第一次反应导致该聚合物底物和该双官能试剂之间共价键的形成；所得共价结合试剂的第二官能团随后能与活性官能团发生第二次反应，所述的活性官能团存在于含有一个环状、金属离子配位配体基团的物质中，该配体基团含有至少3个独立地选自N、O和S的金属离子配位供电子原子；所述的第二次反应导致所述物质和共价结合试剂之间共价键的形成；使该聚合物底物与该双官能试剂反应；和使所得共价结合试剂与所述物质反应。
16.根据权利要求15的方法，其中所述环状配体基团中的金属离子配位供电子原子中的至少一个为环原子。
17.根据权利要求15或16的方法，其中所述聚合物基本上不溶于水。
18.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述的聚合物选自多糖类及其衍生物；聚亚烷基二醇类及其衍生物；聚乙烯醇类及其衍生物；聚丙烯酰胺类；表面改性的二氧化硅类；和表面改性的金属氧化物。
19.根据权利要求15-18中任一项的方法，其中所述聚合物选自琼脂糖及其衍生物；葡聚糖及其衍生物；和纤维素及其衍生物。
20.根据权利要求15-19中任一项的方法，其中所述的环状、金属离子配位配体基团是在具有至少6个环原子的环中含有至少3个金属离子配位供电子原子的杂环基团。
21.根据权利要求15-20中任一项的方法，其中所述的环状、金属离子配位配体是衍生自具有至少6个环原子的三氮杂环烷的基团。
22.根据权利要求15-21中任一项的方法，其中所述的含有该环状、金属离子配位配体基团的物质是通式(II)的物质 式(II)其中n，a，b，c和R如权利要求8中所定义；每个三氮杂环烷环中的每个-CH2-基团中的一个或两个氢原子，各个之间互相独立且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以任选和独立地被取代基取代；所述任选的取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子；每个三氮杂环烷环中的每个-NH-基团中的氢原子，除了H*以外，各个之间互相独立且独立于任何其它的三氮杂环烷环，可以任选和独立地用取代基取代；所述任选的取代基任选的含有一个或多个金属离子配位供电子原子。
23.根据权利要求22的方法，其中取代环-CH2-基团中氢原子的任选取代基选自任选的经取代的低级烷基基团和任选的经取代的芳基基团。
24.根据权利要求22或23的方法，其中取代环-NH-基团中氢原子的任选取代基选自任选的经取代的低级烷基基团和任选的经取代的芳基基团。
25.根据权利要求22-24中任一项的方法，其中所述的聚合物底物是琼脂糖；n，a，b，c和R如权利要求11中所定义；且所述双官能试剂是表氯醇。
26.根据权利要求25的方法，其中当所述聚合物底物与所述双官能试剂反应时，在反应混合物中掺入还原剂。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的还原剂是硼氢化钠。
28.根据权利要求15-27中任一项的方法可制得的官能化聚合物底物。
29.一种制备根据权利要求1-11或28中任一项的官能化聚合物底物，且进一步含有与至少一个所述环状基团配位的金属离子的官能化聚合物底物的方法，该方法包括根据权利要求1-11或28中任一项所述的官能化聚合物底物与所述金属离子的有机盐或无机盐的水溶液的接触。
30.根据权利要求29的方法可制得的含有金属离子的官能化聚合物底物。
31.一种含组氨酸的寡肽，含有选自如下的氨基酸序列HHHNSWDHDINR (SEQ.ID No.1)HTNIHQDQHNHFHR (SEQ.ID No.2)HAMLDRAHDHGTR(SEQ.ID No.3)SLHEHHSGDNLR (SEQ.ID No.4)THYNAVHSHNTLQ(SEQ.ID No.5)DIHHWTDHLQSSTH (SEQ.ID No.6)LYNHYSHTAHVNHL (SEQ.ID No.7)。
32.根据权利要求31的含组氨酸的寡肽，所述氨基酸序列具有含有氨基酸序列Met-Xaa的氨基端延伸，其中Xaa是不为脯氨酸残基的氨基酸残基。
33.根据权利要求31的含组氨酸的寡肽，所述氨基酸序列具有含有最多10个氨基酸残基的氨基酸序列之氨基端延伸。
34.一种多肽，其是一种融合蛋白，含有在其氨基端或羧基端与至少一种根据权利要求31-33中任一项的寡肽融合的目标蛋白分子。
35.根据权利要求34的多肽，其中所述寡肽的氨基酸序列之氨基端和羧基端分别融合于目标蛋白分子。
36.根据权利要求35的多肽，其中所述寡肽的氨基酸序列侧翼为选自酶切位点和化学剪切位点的剪切位点。
37.根据权利要求35或36的多肽，其中所述的两个目标蛋白分子是相同蛋白的分子。
38.根据权利要求35或36的多肽，其中所述的两个目标蛋白分子是不同的。
39.一种可如下获得的多肽，在适当的生长培养基中在允许所述多肽表达的条件下，通过培养含有编码根据权利要求34-38中任一项的多肽之多核苷酸构建体的宿主细胞，并从培养液中回收所述多肽。
40.根据权利要求39的多肽，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌的菌株。
41.一种编码根据权利要求34-38中任一项所述多肽的多核苷酸构建体。
42.根据权利要求41的多核苷酸构建体，其是载体。
43.一种含有根据权利要求41或42的多核苷酸构建体的宿主细胞。
44.根据权利要求43的宿主细胞，其是大肠杆菌的菌株。
45.一种制备根据权利要求34-40中任一项所述多肽的方法，该方法包括在适当的生长培养基中，在允许所述多肽表达的条件下，培养如权利要求43或44所定义的宿主细胞，并从培养液中回收所述多肽。
46.一种用于纯化目标蛋白的方法，该方法包括如下步骤在一定条件下使含有根据权利要求34-40中任一项所述多肽的蛋白样品，包括所述目标蛋白以及其他蛋白，与根据权利要求12-14或30中任一项的含有金属离子的官能化聚合物底物接触，籍此使所述多肽连接到所述含有金属离子的官能化聚合物底物以形成它们的复合物；用缓冲液洗涤复合物以去除所述的其他蛋白；且将结合多肽从经洗涤的复合物中洗脱出来。
47.根据权利要求46的方法，还包括其中将所述寡肽从所述多肽中切除的步骤。
48.根据权利要求47的方法，其中所述寡肽通过酶法从所述多肽中切除。
49.根据权利要求48的方法，其中利用氨肽酶，如二肽基氨肽酶从所述多肽中切除所述寡肽。
50.通过权利要求47-49中任一项的方法可制得的纯化蛋白。
全文摘要
一种聚合物底物，其用含有至少一个环状、金属离子配位配体基团的官能团官能化，所述环状配体基团含有至少3个独立地选自氮、氧或硫的金属离子配位供电子原子。将大环配体置于金属离子配位球的“折叠”面，形成对加入的经“标记”的蛋白(融合蛋白)之寡肽“标记”的一种单一方向的途径和排列。
文档编号C12N1/21GK1612896SQ02826971
公开日2005年5月4日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月12日
发明者T·克里斯坦森, M·T·W·赫恩, L·斯比希亚, 姜炜, J·T·穆尼, B·格拉汉姆 申请人:诺沃挪第克公司, 莫纳什大学