多重pcr的制作方法

专利名称：多重pcr的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求提交于2001年11月19日的美国临时申请号60/331,693的优先权，所述申请全文引用于此作为参考。
背景技术：
核酸扩增和所得扩增产物的分析革新了基础和临床科学。这些技术的应用包括分子克隆、核酸测序、基因分型、单核苷酸多态性(SNP)和其它多态性及突变的检测和鉴定以及基因表达的定量。
已经发展了多种用于核酸扩增的方法，如链置换扩增、基于转录的扩增和聚合酶链式反应(PCR)。
PCR在大规模研究项目和临床中的应用会产生伴随大量PCR扩增子的生成的多种不同靶序列的扩增。随着所述项目规模的增加，单独实施所需反应变得成本高昂且效率低下。因此，发展使用通用模板和试剂混合物在同一容器内平行实施多重扩增反应的方法具有重要意义。
所述多重PCR方法(其中使用多个靶标特异性引物对来扩增多个靶标)仅取得有限的成功。在同一试管中组合全部所需引物极大增加了引物-二聚体和其它副扩增产物生成的频率。由于多重PCR中引物对的增加，潜在引物-二聚体相互作用(或由两种不同引物所生成的假扩增子)的数目将根据使用引物的数目而指数性增加。
即使在设计多重引物对时小心注意避免明显的引物-二聚体不相容，在非所需扩增产物占优势前，传统多重PCR仍通常限于约10-20个同时的扩增反应。
已经发展了改善多重PCR相关问题的不同方法，但无一种完全成功。
PCT专利公开WO96/41012披露了一种用于多重PCR的方法，其包括两轮扩增且使用含有位于各自3′末端的模板-特异性序列以及位于各自5′末端的通用引物序列的引物对。第一次扩增使用特异性引物序列而第二次扩增使用通用引物。第二次使特异性引物与不同模板的不同结合归一化(normalize)。
另一个多重方法使用针对每个靶标的单个特异性引物和单个通用引物。N.E.Broude，等人，Multiplex allele-specific targetamplification based on PCR suppression，Proc，Natl.Acad.Sci.USA98206-211(2001)。然而该方法也受到副反应扩增的不利影响，并因此限制了应用。
因此，现有技术中仍需要用于大量特异性核酸序列同时多重扩增的方法，所述方法能将副反应产物的共同扩增最小化。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供一种在大量特异性核酸序列的多重扩增反应中显著减少副反应产物生成的新的和改进的方法。
本发明的另一个目的是提供用于在大量特异性核酸序列的多重扩增反应中显著减少副反应产物生成的新的组合物。
本发明部分基于探针中的同源性区域和核酸模板中的互补序列之间的两次特异性杂交的新应用，每一次杂交后均有通过DNA合成的探针的延长。
因此，在第一个方面，本发明提供了核酸扩增方法，所述方法通过线性扩增分子与核酸模板在允许其特异性杂交的条件下接触。在某些实施方案中，线性扩增分子是DNA寡核苷酸。根据某些实施方案，模板为DNA，而在其它实施方案中，模板为RNA。
在接下来的一个步骤中，将与模板中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸顺序地加至线性扩增分子与模板杂交的末端，结果导致生成延伸的线性扩增分子。在某些实施方案中，通过使用DNA聚合酶来加入互补核苷酸。
在接下来的步骤中，将延伸的线性扩增分子在允许其特异性分子内杂交的条件下孵育，结果导致生成双链分子内杂交区，其中一条链包括前述步骤中新加入的核苷酸。
在接下来的步骤中，在预先确定的位点切割延伸的线性扩增分子，结果导致生成了沿分子内杂交区彼此非共价结合的第一和第二片段。在某些实施方案中，使用能够切割线性扩增分子中生成的无嘌呤位点的酶实施切割。在其它实施方案中，使用化学因子实现切割。
在接下来的步骤中，在由切割新生成的末端，将与第二片段中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸顺序地加入至第一片段，结果导致生成延伸的第一片段。在某些实施方案中，通过使用DNA聚合酶来实现互补核苷酸的加入，其中使用第一片段作为引物，而第二片段作为模板。
在可选的最后一步中，延伸的第一片段在例如PCR的指数扩增反应中用作模板。当在同一反应中需要平行实施多重扩增时，可在PCR中使用通用引物。
PCR后，分析来自起始模板的指数扩增序列。
在另一个方面，本发明提供了核酸扩增的另一种方法，其中不发生切割。在所述第一步中，线性扩增分子与核酸模板在允许其特异性杂交的条件下接触。在接下来的步骤中，将与模板中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸顺序地加至线性扩增分子与模板杂交的末端，结果导致生成被延伸的线性扩增分子。在接下来的步骤中，将延伸的线性扩增分子在允许其特异性分子内杂交的条件下孵育，结果导致生成双链分子内杂交区，其中一条链包括前述步骤中新加入的核苷酸。在接下来的步骤中，将在第一次延伸步骤中加入但不包括在双链分子内杂交区中的核苷酸(即，其是单链的)从延伸的线性扩增分子的末端除去。在接下来的步骤中，在双链化分子内杂交区中的杂交末端处，向延伸的线性扩增分子中顺序加入一个或多个与线性扩增分子中存在的核苷酸互补的核苷酸，由此完全延伸线性扩增分子。在可选的最后一步中，完全延伸的线性扩增分子在指数扩增反应(如PCR)中用作模板。
根据可选的实施方案，本发明提供了用于进一步降低副反应产物生成的其它的方法。因此，一个实施方案提供了消除不能与模板杂交的线性扩增分子的方法。在其它实施方案中，一个或多个尿嘧啶碱基包含于线性扩增分子中，并采用在模板中遇到尿嘧啶即停止的DNA聚合酶通过DNA合成实施第一探针的延伸。而在其它实施方案中，生物素化核苷酸或者掺入线性扩增分子或者在通过DNA合成的第二探针延伸期间使用。然后，将链霉抗生物素包被的底物用于从有助于形成副反应产物的分子中纯化出生物素化复合物。
根据另一方面，本发明还提供了用于核酸扩增的线性分子。线性分子包括与第一引物序列基本上相似的第一引物区，与核酸第一区基本上相似的第一同源性区域，可切割位点，与第二引物序列基本上相似的第二引物区，以及与核酸第二区序列的互补序列基本上相似的第二同源性区域，其中核酸第一和第二同源性区域存在于同一条核酸链上，且其中第一核酸同源性区域比第二核酸同源性区域更接近链的5′末端。根据某些实施方案，线性扩增分子有用地为DNA寡核苷酸。
根据可选的实施方案，本发明提供的线性扩增分子还包含标签(barcode)序列，即，特异地鉴别与其相关的线性扩增分子的核苷酸的特异形式；还包含荧光染料标记；还包含亲和性俘获标记，如生物素；以及还包含尿嘧啶碱基。而根据其它实施方案，线性扩增分子的切割位点可被酶或化学因子切割，或能够生成无嘌呤位点。
在另一个方面，本发明还提供了用于核酸扩增的含有一个引物序列且不含有切割位点的线性分子。根据该实施方案，线性分子包括与第一引物序列基本上相似的第一引物区，与核酸的第一区序列基本上相似的第一同源性区域，和与核酸第二区序列的互补序列基本上相似的第二同源性区域，其中核酸第一和第二同源性区域存在于同一条核酸链上，且其中第一核酸同源性区域比第二核酸同源性区域更接近链的5′末端。
附图概述参照下述详细描述并结合附图将明确本发明的上述和其它目的，其中自始至终相似特征是指相似部分，其中图.1显示了本发明的活套(loopback)探针的第一个实施方案的结构和本发明用于核酸扩增的方法的第一个实施方案的前面的三个步骤，包括探针-模板杂交、探针延伸和延伸的探针分子内杂交。
图.1B显示了根据本发明的核酸扩增的方法的三个附加步骤，包括自杂交探针的切割，延伸和通过PCR的指数扩增。
图.2A显示了本发明的活套探针的一个可选择的实施方案，所述探针中尿嘧啶碱基存在于通用引物序列中。图.2A还显示了除去未杂交活套探针以及减少副扩增产物的生成率的可选择的方法步骤。步骤的顺序不受限制。
图.2B显示了进一步减少副扩增产物生成率的可选择的附加步骤。步骤的顺序不受限制。
图.3A显示了活套探针的一个可选择的实施方案和根据本发明的核酸扩增的可选实施方案的前面三个步骤，包括探针-模板杂交，探针延伸和延伸的探针分子内杂交。
图.3B显示了图.3A中显示的可选实施方案的更进一步的三个步骤，包括除去未配对的延伸产物，使用原始探针序列作为模板的延伸和通过PCR的指数扩增。
图.4A显示了用于实施例1的试验中的活套探针和方法步骤。
图.4B显示了实施例1的试验的结果。
图.5A显示了用于实施例2的试验中的活套探针(结构2A和2B)和方法步骤。
图.5B显示了实施2的试验的结果。
图.6A显示了用于实施例3的试验中的活套探针(结构2A)和方法步骤。
图.6B显示了实施3的试验的结果。
图.7显示了根据本发明的含有标签序列的活套探针的两个实施方案。
图.8A显示了能允许自发引发和维持扩增的探针的结构，以及根据本发明该探针用于核酸扩增的方法的前面四个步骤。
图.8B显示使用图.8A的探针进行核酸扩增的方法三个额外步骤。
图.8C显示使用图.8A的探针进行核酸扩增的方法的四个更进一步的步骤。
发明详述本说明书所公开的组合物和方法有利于提高核酸扩增的性能，特别是在使用多种不同引物对在同一反应中平行扩增多个模板的多重扩增方法的性能。如同本领域技术人员所认识到的，传统多重扩增方法容易产生副扩增产物，所述副扩增产物能阻碍所需的特异性扩增子的扩增或分析。
如下面进一步详述，本发明的组合物和方法用于从第一模板获得含有通用引物序列的互补第二模板，其随后可被指数性扩增从而实施随后的分析。通过与经DNA合成实现的线性扩增分子延伸相联合的两轮特异性杂交实现从第一模板获得第二模板，其具有基本上减少副反应产物的生成和扩增的效果。使用所述经DNA合成实现的扩增还允许在反应中使用更低量的本发明的序列-特异性试剂，其可导致显著的成本节约且也能更有助于减少副反应的生成和扩增。
第一模板中的多个序列，例如，基因组DNA，可被平行转至不同的含有互补序列的第二模板分子。因为通用引物序列位于第二模板分子中存在的每一序列侧翼，因此即可通过使用单一通用引物对通过PCR同时扩增第二模板中存在的全部序列。与传统多重PCR不同的是，本发明能更有力地减少副反应产物生成和扩增的可能性。
本发明的组合物的第一个实施方案有效提供了用于本说明书进一步描述的扩增方法中的线性扩增分子(也可称为“探针”、“活套探针，“线性扩增分子”或“线性分子”)。如本说明书所使用的，“线性”是指由非分支聚合物例如，DNA或RNA构成的分子。存在二级或三级结构不会使探针具有非线性。
设计能够与随后将扩增的模板核酸特异性杂交的探针。模板可以是DNA或RNA。如果是RNA，也可采用本领域众所周知的方法将RNA模板转变为DNA，模板可获自多种来源，包括但不限于病毒、细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。模板核酸还可以是基因组DNA或RNA，或附加型DNA或RNA。
如果模板是双链的，按下述设计特定探针，以便使所述探针仅与包含双链模板的两条可能链中的一条产生特异性杂交。
典型地，探针为单链寡核苷酸，且可单独用DNA，单独用RNA或用DNA和RNA的组合、RNA和蛋白的组合、DNA和蛋白的组合或RNA和DNA和蛋白的组合形成。还可用多种修饰碱基或化学取代物修饰探针。例如，可用荧光染料分子标记探针以易于分析探针参与的反应。还可根据本领域技术人员的需求，用生物素或其它亲和性俘获部分修饰探针。合成寡核苷酸探针及修饰寡核苷酸的方法是本领域技术人员众所周知的。
用于本发明的寡核苷酸探针可以具有多种长度，包括长至约40个核苷酸(nt)、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt或更长。寡核苷酸探针的长度也可以短至约为950nt、850nt、750nt、650nt、550nt、450nt、350nt、275nt、225nt、175nt、125nt、95nt、85nt、75nt、65nt、55nt、45nt、35nt或更短。
本发明的活套探针的一般结构包含多个区域，每一区域具有特定功能。图.1A上部图中描述了该一般结构。
在探针的5′末端存在称为“C1”的第一通用引物序列。“C1”可直接始于探针的5′端核苷酸，或被一个或多个核苷酸插入而偏向于探针的3′末端。C1序列完全或基本上与本说明书进一步公开的第一PCR引物序列相同。
C1之后(朝向探针的3′末端)是称为“H1”的第一同源性序列。“H1”与将采用本说明书所述方法进行扩增的模板核酸中发现的序列相同或基本上相似。零，或一个或多个核苷酸可分隔H1和C1。C1和H1甚至可有一个或多个核苷酸的重叠。
H1后是称为“C2”的第二通用引物序列。C2的序列与本说明书进一步公开的、通常与来自C1的序列不同的第二PCR引物的序列相同或基本上相似。零，或一个或多个核苷酸可分隔H1和C2。C2和H1甚至可有一个或多个核苷酸的重叠。
H1和C2之间是可切割位点，

图1及其它地方中将所述位点表示为“X”。X是存在于探针中的核苷酸序列或天然或非天然化学结构，其被切割因子特异性识别和切割。切割与负责将探针聚拢在一起作为独立分子体的一个或多个共价键的打断相关联。所述键可以存在于探针的糖-磷酸主链中，或在非天然可切割化学联接中。切割后，H1和C2不再是物理上相连的。
切割仅作用于一条链。因此，如果探针部分与另一序列构成双链，则切割只切断探针链而不是与探针配对的链。然而，切割因子识别的切割位点可单独存在于探针中，或存在于探针和另一序列构成的双链结构中。如本说明书进一步所述，所述另一序列可存在于探针的酶促延伸产物中。
多种类型的切割位点和相应的切割因子是本领域技术人员已知的。下面的实例不应理解为具有限制性。
切割位点包括能识别双链DNA但仅能切割单链DNA(即，探针链)的核酸内切酶所识别的核苷酸特定模式。所述核酸内切酶的实例包括N.Alwl，N.BstNBI，N.BbvCIA和N.BbvCIB(全部所述酶均可购自NewEngland Biolabs公司(Beverly，MA，美国))。
核糖可掺入探针的脱氧核糖-磷酸主链的所需位置。此后，核糖核酸酶可用于切割核糖-磷酸键而留下3′羟基基团。
可将尿嘧啶碱基掺入探针的所需位置上。此后，通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)处理探针而除去尿嘧啶从而产生无嘌呤(AP)位点。然后可采用化学切割或用酶如AP-内切核酸酶或AP-裂解酶切割该AP-位点。
可将“受损”碱基掺入探针的所需位置上。此后，通过用糖基化酶处理探针除去受损碱基从而产生无嘌呤(AP)位点，然后可采用化学切割或用酶如AP-内切核酸酶或AP-裂解酶切割该位点。
受损碱基包括脲、5，6-二羟基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶乙二醇、5-羟基-5-甲基乙内酰脲、尿嘧啶乙二醇、6-羟基-5，6-二氢胸腺嘧啶、甲基丙醇二酰脲、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黄曲霉毒素B1-fapy-鸟嘌呤、5-羟基-胞嘧啶和5-羟基-尿嘧啶。
同时具有糖基化酶和AP-裂解酶活性的酶的实例包括核酸内切酶III(Nth)、Fpg和hOGG1(全部购自New England Biolabs公司)。
切割位点还可用能够识别和切割存在于探针中的特定化学连接的化学因子进行切割。
可切割位点X可存在于H1中或H1的3′端，但通常不与C2重叠。因而依赖于X的位置，切割可发生在H1中紧挨着H1之后(即，使得被切割的探针H1的3′末端齐平)或距离H1的3′端一段距离。
C2后是称为“H2”的第二同源性序列，其与来自H1的序列不同。H2与存在于模板核酸中的相应序列(称为“cH2”，意指“与H2互补”)完全或基本上互补。因此，在适宜条件下，H2和cH2可通过经典Watson-Crick型氢键而彼此杂交。这与H1相反，其均存在于探针和模板上。因此，探针的H1不能典型地与模板的H1杂交。在探针中，H1在H2的5′端，而在模板中，H1在cH2的5′端。
典型地，H2终止于探针的3′末端，因此探针的最3′-端核苷酸与cH2的最5′-核苷酸特异性配对。零或一个或多个核苷酸可分隔H2和C2。C2和H2甚至可有一个或多个核苷酸的重叠。
因为C1和C2用于PCR引物中，故要选择能够使PCR的特异性和效率最大化以及能使不正确PCR产物的合成最小化的C1和C2的长度和序列。设计所述序列的方法是本领域技术人员众所周知的，其可根据经验实施或使用计算机算法理论性实施。
C1或C2的长度可长至约15nt、25nt、35nt、45nt、55nt、65nt、75nt、85nt、95nt、105nt或更长。C1或C2的长度可短至约100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或更短。典型地，C1或C2的长度为约15至约40个核苷酸。
H1和H2序列的选择基本上受控于需要扩增的模板区域和扩增子的所需大小。例如，若本领域技术人员欲检测基因区域中的SNP变异，H1和H2的序列即可位于基因中SNP的位置的侧翼。若欲检测含有SNP的相同基因中的多个位点，则可选择位于更长的模板序列侧翼的H1和H2。
H1和H2的长度可根据本领域技术人员的需要而变化，但H2的最小长度受控于含有模板的样品中存在的核酸种类的复杂性。若其它变量保持恒定，核酸种类的复杂性越大，则特异性识别和与存在于模板中的互补cH2序列杂交的H2就越长。
H1或H2的长度可长至约15nt、25nt、35nt、45nt、55nt、65nt、75nt、85nt、95nt、105nt或更长。H1或H2的长度还可短至约100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、20nt、10nt或更短。典型地，H1或H2的长度为约15至约40个核苷酸。
模板中分隔H1和cH2的核苷酸数目变化可以非常大。H1和cH2可紧挨着或者分隔它们的距离可接近几千碱基或更多。如下面将明确的，模板中H1和cH2间的距离的唯一限制是用于延伸切割探针和扩增延伸产物的DNA聚合酶的持续合成能力。模板中分隔H1和cH2的距离不必与探针中分隔H1和H2的距离相当。
探针H2的序列不必与存在于模板中的cH2的序列完全互补，且探针H1的序列不需要与模板的H1序列相同。只要能够保持杂交的充分特异性，可允许相当的序列差异。
探针和模板同源性区域间的序列差异可表示为同源性或序列亲缘性(sequence relatedness)的程度。因此，可以将探针H2序列与模板cH2序列的互补链比较来确定其同源性的程度，且可同样比较探针H1序列和存在于模板中的H1序列。
所述序列间的同源性可使用计算机算法进行计算。为了本发明的目的，采用Tatiana等，FEMS Mirobiol.Lett.174247-250(1999)的方法计算相似性百分数或互补性(同源性)，可采用在线获自国立生物技术信息中心(NCBI)网站的计算机程序BLAST 2 SEQUENCES实施所述方法。
本领域技术人员能辨别探针和模板同源性区域间的同源性程度是否足够。例如，如果模板存在于核酸的复杂混合物(例如，基因组DNA)中，则通常使用高度同源性，从而探针可与模板所需区域进行充分特异性地杂交。如果同源性不够高和/或同源性区域不够长，则探针将与一个或多个非特异性模板发生不正确的杂交，而产生无用扩增产物，即，副产物或背景产物。而当模板存在于核酸的较不复杂的混合物中时，则较低的同源性和/或较短的同源性区域是可以接受的。本领域技术人员可实践性或理论性地确定可接受的同源性程度。
如本领域技术人员所认识的，除杂交区域全长和同源性百分数外，其它因素也能影响杂交特异性，包括温度和盐浓度的因子也是相关的。化学添加剂，如溴化十六烷三甲基铵(CTAB)也能影响RNA:DNA双链体的杂交特异性，如WO 02/29112中所述，其全文引入此处作为参考。
探针区H2和模板区cH2间的同源性百分比和探针区H1和模板区1的同源性程度可高至约60％、70％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或100％。同源性百分比也可低至约99％、97％、95％、93％、91％、89％、87％、85％、83％、81％、75％、65％或55％。
为了本发明的目的，如果第一序列与第二序列具有所需的如本领域技术人员所确定的同源性水平，则认为它们“基本上相似”。因此，若在特定条件下，同源性程度足以支持第一序列和第二序列的互补链间或第二序列和第一序列互补链间的特异性杂交，则认为序列基本上彼此相似。
本发明还提供了使用活套探针扩增模板核酸的方法。
所述方法的第一实施方案参照图.1进行描述。根据该实施方案，探针首先在适宜条件下与模板接触来实现探针H2区和模板cH2区间特异性杂交从而生成双链结构(图.1A)。
典型地，制备含有探针和模板以及其它组分如盐和缓冲液的水溶液，并加热从而将模板变性。然后冷却混合液，可以采用自然冷却或控速冷却的方式，实现H2和cH2间的所述杂交。
能够维持H2和cH2间特异性杂交的条件的确定方法是本领域技术人员众所周知的。能够进行改变而影响杂交特异性和速度的变量包括但不限于探针的浓度，模板的浓度，单价阳离子和其它离子的浓度(例如，钠或钾)、温度、聚胺的浓度(例如，精胺或亚精胺)、pH和缓冲液组分的浓度。
在第二个步骤中，如图.1A中部图所示，采用DNA聚合酶自探针的3′末端进行延伸，所述DNA聚合酶在合成延伸的探针的过程中阅读模板，如果仅需要延伸那些与模板在其3′末端完全匹配的探针，则优选使用缺少了3′-至-5′单链核酸外切酶校正活性的DNA聚合酶。在这一方式中，可选择性地仅延伸那些能以特异性阈水平与模板杂交的探针。
如果模板是RNA，则DNA聚合酶优选为逆转录酶(RT)，包括缺少了3′-至-5′核酸外切酶活性的逆转录酶(例如，AMV-RT)。
到达存在于模板中的H1序列后，聚合酶将合成作为延伸探针的部分的与H1互补的称为cH1的序列。在DNA模板的情况下，探针延伸持续至聚合酶从模板脱落或至反应终止。在mRNA模板的情况下，探针延伸通常持续至RT到达转录本的末端。
探针延伸完成后，加热延伸的探针和模板的混合物以便解链分离探针和模板。然后冷却混合物从而使延伸的探针发生分子内杂交(也称为单分子杂交)。在足够低的温度下，H1区(存在于原始探针中)和cH1(存在于延伸的探针部分中)彼此相遇并发生特异性杂交从而生成稳定的双链体(也称为分子内杂交区)，由此生成茎-环结构(“活套结构”)，如图.1A下部图所示。
杂交应在足够低且能支持H1和cH1间杂交的温度(即，不超过杂交体的解链温度)下实施，但还应足够高而能抑制偶发的非特异性杂交。实施杂交的温度可高至30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃或更高。实施杂交的温度还可低至95℃、85℃、75℃、65℃、55℃、45℃、35℃、25℃或更低。有效地，实施杂交的温度至少为50℃。
不受理论的限制，已确信当H1和cH1存在于同一分子中时(例如，延伸的探针)，与延伸的探针分子和模板的实际浓度相比，H1和cH1的有效浓度非常高，且所述浓度是分隔它们的距离的函数。例如，如果H1和cH1彼此间约为100nt，则它们的有效局部浓度在毫摩尔的范围内；随着距离的增加，有效浓度降低。优选地，H1的3’末端和cH1的5’末端间的距离为几百个核苷酸。
如果预期分子间杂交不足以占优势，例如由于模板浓度高时，则可改变条件以便使单分子相互作用超过双分子的相互作用。例如，可降低盐浓度或稀释混合物。
在第四个步骤中，如图.1B上部图所示，在H1和C2间的可切割位点X切割活套结构。应选择能够保持由H1-cH1杂合体所生成的双链体结构的切割条件，例如，应在低于双链体解链温度的温度下实施切割。无论如何实施切割，均应生成3′羟基基团，从而通过聚合酶的作用可将核苷酸加入。或者，如果切割不能产生3′羟基基团，则可根据本领域技术人员已知的方法处理切割产物从而使其产生能够由聚合酶特异性加入核苷酸的末端。
切割优选发生于H1的平末端，从而不生成3′突出端，但也可发生在H1内部(即，在双链体区)或在H1和C2间的单链区(如果该单链区存在)(由此生成3′突出端)。无论切割发生于何处，均应生成完整的C2。如果切割发生在双链体中，则应仅切割含有H1的双链体单链且应不切割含有cH1的单链，即，含有cH1的延伸的探针区应保持完整。
切割将原先为单一分子的延伸的活套探针转变为两个片段。在适宜条件下，所述片段在由H1和cH1间的特异性杂交形成的双链区中彼此保持非共价结合。
在切割后，H1和cH1间的环打开。如图.1B中的第二个图所示，“顶链”(第一个片段)现在包含(5′至3′)C1和H1，而“底链”(第二片段)现在包含(5′至3′)C2、H2和cH1。由于缺少非特异性相互作用，只有在顶链上的H1和底链上的cH1间生成的双链体现在将物理上不同的链保持在一起。
第五个步骤(如图.1B中的第三个图所示)是使用DNA聚合酶的第二次延伸，其可在与第一次(上述)中相似的条件下实施。
如果切割未在H1后生成3′未配对核苷酸，如有需要，可使用缺少校正活性的DNA聚合酶实施延伸。在该第二个延伸步骤中，DNA聚合酶单独使用H1作为引物，阅读底链并将核苷酸加至H1的3’末端。当聚合酶到达底链末端(在C2之后)时延伸终止。延伸产物含有H2的互补链以及C2的互补链(cC2)。完全延伸的顶链包含(5′至3′)C1、H1、cH2和cC2且包含其在随后的聚合酶链式反应中作为不同于上述第一模板的第二模板所需的全部信息。
如果切割在H1后生成3′未配对核苷酸，则需要在聚合发生前将其除去。可采用首先用3’-至-5’单链核酸外切酶处理切割的延伸探针的方法实施。或者，可以使用具有3’-至-5’核酸外切酶校正活性的DNA聚合酶。在任一情况下，将除去全部3′未配对核苷酸，包括那些存在于底链上的，即在cH1之后的。如果发生这个，则使用H1的5′序列作为模板，由DNA聚合酶产生的延伸也将发生在底链上。这将生成含有(5’至3’)C2、H2、cH1和cC1的完全延伸的底链。
在随后的第六个步骤中，延伸的顶和/或底链(如图.1B底部图所示)在指数扩增反应，如PCR中用作模板。
对于PCR，在含有作为模板的延伸的顶和/或底链的反应混合液中加入通用引物C1和C2。在PCR的第一个循环期间，通用引物C2在延伸的顶链的3’末端与互补序列cC2杂交。C2然后作为DNA聚合酶延伸的引物从而生成延伸的底链，其包含(5’至3’)C2、H2、cH1和cC1。由于存在cC1序列，故可将延伸的底链作为模板用于在第二次PCR中的通用引物C1的延伸。
如果在第五个步骤期间生成延伸的底链，则在第一次PCR中，通用引物C1可引导底链作为模板从而生成新顶链。
然后，随后的循环生成指数扩增产物。PCR所需的全部条件和组分均是本领域技术人员已知的。
重要的是要注意到由于原始探针，延伸的探针和切割的延伸的探针均包含C1和C2，而不含C1或C2的互补序列(即，cC1和cC2)，这些分子均不能在使用C1或C2作为引物的PCR中作为模板。因此有效地将PCR副产物的产生最小化。结果，在本发明的某些实施方案中，可在上述方法的所有步骤中存在通用引物C1和C2。其作为特异性引物的功效完全依赖于在本方法第五步中生成的延伸的顶或底链的存在。
然后可根据本领域技术人员已知的方法进一步分析扩增序列(扩增子)。例如，可对H1和H2之间的序列测序从而鉴定SNP变异。
使用上述方法以及其可选择的实施方案扩增目的核酸序列提供了比其它扩增方法(特别是在多重扩增领域)更显著的优越性。
在常规PCR中，用与H1和H2类似的PCR引物对扩增模板。因为PCR的指数特性，由于引物-二聚体和引物与模板的非-特异性杂交的生成，其会生成PCR副产物。事实上，在某些反应中，特别是在模板非常复杂的情况下(例如，基因组DNA)，副产物比特异性扩增产物更占优势。
本发明的组合物和方法通过多种方式有效地避免了这些问题。首先，本发明的两个特异性杂交过程是连续的而非如传统PCR中平行的。即，在传统PCR中两个引物(也与H1和H2相似)能够与模板杂交并被延伸。结果，指数扩增从PCR的第一个循环开始，通常会产生副产物。
然而，在本发明的方法中，在所述第一步中仅发生单个杂交过程，即，H2与模板杂交，其后是通过DNA合成的探针的单轮延伸，即，采用H2序列作为引物的探针的延伸。如果H2与错误的序列杂交，则即使发生延伸，H1也不太可能与延伸的探针序列发生分子内的非-特异性杂交。如果探针序列的任何其它部分与模板(例如包括H1)发生错误的杂交，则由于探针的3’末端游离故不会发生延伸(不同于当H2正确地与其互补序列杂交时)。相反地，如果H1与H2不位于同一分子中，将有非常大的可能性发生成功的错误引发(misprime)。
在第一次杂交和探针延伸步骤后，只有在延伸的探针包含正确的H1的互补序列(即，cH1)的情况下，随后的杂交和探针延伸步骤才可能成功。此外，只有成功地进行了第二杂交和延伸步骤，采用通用引物C1和C2的指数扩增才可能成功。
因此，本发明的方法中的每一个步骤的实施均抑制了副延伸产物的生成，其在多重PCR中特别有益。在传统多重PCR中，多种不同的引物对在相同的反应中同时使用。由于存在引物彼此作用以及与模板发生非-特异性杂交并由此错误引发的非常大的可能性，故所述同时使用可显著加剧副PCR产物的生成。然而，在使用本发明组合物和方法的多重PCR中，只使用了一半探针，并且上述限制显著地抑制了在指数扩增期PCR副产物的生成。
多重扩增中的其它优势是单组通用引物即C1和C2，可用于指数性扩增多个扩增子。结果，在一组反应条件下，所有扩增子将以相同的效率而得以扩增(不考虑扩增子长度和二级结构)。因此，可以预期扩增子将化学计量学地呈现于反应终产物中，而在传统多重PCR中，某些低效扩增的扩增子可被更有效扩增的扩增子“挤出”，从而导致其有效地从最终反应产物中消失。因此，本领域技术人员即无须经验性地确定能用于有效扩增多重扩增子的反应条件组，其中采用不同引物对指数性扩增每一扩增子。这样节省了大量的时间和材料成本，且增加了所有目的扩增子都存在于最终反应产物中的可能性。
虽然上述讨论集中于多个目的核酸序列的多重扩增，本发明还有利于用在单个目的核酸序列的扩增中。
如上所述，本发明的组合物和方法的一个显著优势是用于扩增的通用引物不能杂交和引发活套探针或活套探针的其它产物。这导致副扩增产物较低的发生率。然而根据本发明的其它实施方案，可进一步降低该背景。所述另外的实施方案可单独实施或联合实施从而最大程度地抑制背景。
因此，根据本说明书图.2A所述方法的一个可选的实施方案，可以在活套探针与模板杂交步骤之后，用3′-5′单链核酸外切酶例如，Exonuclease I(Exol)处理混合液。所述处理可有效地降低错误杂交的和未杂交的探针分子数目，由此降低了副产物合成的发生率。例如，当活套探针与模板非特异性结合，生成探针-引物二聚体或进行分子内杂交从而生成一个或多个未配对的3′核苷酸时，用核酸外切酶的处理能降解错误引发的探针。
根据另一可选择的方法，可仅俘获那些与模板杂交的探针并从未杂交探针中纯化出探针-模板组合。作为该方法的一种实施方案，可采用本领域技术人员众所周知的方法将亲和性俘获部分(例如，生物素)掺入DNA或RNA模板。例如，可通过物理切割DNA或用限制性核酸内切酶消化的方法而生成DNA的游离3′末端，然后采用末端转移酶加入生物素化核苷酸。
在掺入了亲和性俘获部分后，将活套探针与模板杂交，此后用珠子或其它用能够特异性结合亲和性俘获部分的其它亲和性俘获系统的组分包被的基质孵育混合液。例如，如果亲和性俘获部分是生物素，其它亲和性俘获系统的组分是链霉抗生物素，或其它生物素-结合部分。然后冲洗已经吸附了模板的珠子从而除去未杂交的探针，然后洗脱探针-模板组合以便随后用于所描述方法的步骤中。
根据另一个实施方案，还可通过用固体支持物在探针的5′末端将其俘获的方法抑制探针-引物二聚体的生成。实施所述俘获的不同技术方法是本领域技术人员已知的。一个所述方法是用生物素标记活套探针的5’末端并在链霉抗生物素包被的珠子上俘获探针。因为探针被固定在固体支持物上，因此探针-引物二聚物的形成具有空间上的劣势。在探针固定后，未结合的探针被冲洗掉。然后使用与珠子结合的探针实施全部随后的酶促步骤。然而，如有需要，可在任何时间从珠子上洗脱下探针。
根据另一个实施方案(图.2A中所示)，还可通过在活套探针的通用引物序列(C1和C2)中掺入一个或多个尿苷酸而进一步抑制副产物的生成。如本领域已知的，某些DNA聚合酶，例如Pfu DNA聚合酶，在遇到模板链中的尿嘧啶时即停止。因此，如果使用所述DNA聚合酶实施第一次延伸反应，则当聚合酶到达尿嘧啶碱基时，探针-引物二聚体和分子内杂交的探针的延伸将失败，因此与C1和C2互补的序列将始终无法生成。结果，当加入通用引物C1和C2来实施指数扩增时，不存在作为用于合成副产物的模板的探针-引物二聚体或分子内杂交的探针。
如果使用尿嘧啶碱基-掺入策略，可切割位点的切割显然将不能依赖尿嘧啶碱基的存在，因为影响切割位点中尿嘧啶碱基的任何处理也会影响探针通用引物序列中的尿嘧啶碱基。
同样很明显的是，第二次延伸反应必须使用遇到尿嘧啶碱基时不会停止的DNA聚合酶，例如，T4、Klenow或Taq DNA聚合酶，因此延伸可越过尿嘧啶碱基从而得以完成。如果延伸没有完成，与C2互补的序列将不能生成，因此不可能指数性扩增延伸反应的产物。
在使用C2引物的第一次延伸(例如，使用延伸产物作为模板的PCR)期间也必须使用尿嘧啶碱基非敏感性DNA聚合酶，因为延伸的顶链仍然包含C1引物序列中的尿嘧啶碱基。这些尿嘧啶碱基的存在将阻止采用顶链作为模板以生成含有与引物C1互补的序列(其可作为引物C1的模板)的延伸产物的完全延伸。换句话说，如果使用引物C2的第一次延伸反应没有使用尿嘧啶碱基非敏感性DNA聚合酶，则也将不能实现指数扩增。
因此，使用对尿嘧啶碱基的存在不敏感的Taq DNA聚合酶可直接完成使用引物C1和C2的PCR。然而，如果PCR需要使用Pfu DNA聚合酶，即需要首先合成不含尿嘧啶碱基的延伸产物。如图.2B中所示，可通过使用C2作为引物和尿嘧啶碱基非敏感性DNA聚合酶，如T4或Klenow的顶链的DNA合成的单次延伸将其完成。在延伸步骤后，可将Pfu用于使用C1和C2引物的PCR中。
根据另一个实施方案，在第二次延伸反应期间加入用亲和性俘获部分例如生物素标记的dNTP。因此第二次延伸反应的产物得以标记，故可从探针-引物二聚体和其它不成功的延伸产物中纯化出完全延伸产物从而进一步抑制副产物的生成。其可通过采用亲和性俘获系统的其它组分俘获亲和性俘获部分的方法实施。如果生物素用作亲和性俘获部分，则可用链霉抗生物素包被的珠子俘获生物素化延伸产物，然后冲洗所述珠子从而纯化俘获的产物。纯化的产物可从珠子上洗脱下来用于随后的步骤中，或可将珠子直接加入到反应混合液中。
如图.2B中所示，通过生物素化和链霉抗生物素俘获的纯化步骤可选地在探针切割之后，并在使用引物C1和C2的PCR之前，或通过使用C2引物以从模板中除去全部残留的尿嘧啶碱基的DNA合成的可选延伸(如上述)步骤之前实施。
图.3A中描述了活套探针的一个可选的实施方案。根据该第二个实施方案，活套探针包含位于探针5’末端或接近探针5’末端的第一通用引物序列(C1)，其后是第一同源性区域(H1)，然后是接近探针3’末端的第二同源性区域(H2)。如活套探针的第一个实施方案中所述(上述)，将H2设计为与模板存在的互补序列(cH2)特异性杂交。上述关于活套探针的第一个实施方案中探针和模板同源性区域间结合的特异性也适用于其可选实施方案相关。
还提供了采用图.3A的活套探针的核酸扩增的一个可选实施方案。根据该方法，首先的三个步骤，即与模板杂交，延伸和分子内探针杂交，与图.1A和图.1B中所述以及上述的第一种方法相似。
然而，因为图.3A的可选的活套探针不包含可切割位点，切割步骤即被略去。而如图.3B中所示，在H1和cH1间的分子内杂交(其在延伸期间生成)之后，可通过用能从3′-5′方向除去未配对核苷酸的核酸外切酶(例如，核酸外切酶I(Exol)或核酸外切酶T(ExoT))处理探针从而除去延伸过(3′方向)H1和cH1间生成的双链体的任何单链尾巴或突出端。
如图.3B中所示，已经除去了任何未配对的3′核苷酸后，将DNA聚合酶用于从cH1的3’末端延伸探针。该延伸反应生成了在位于或接近延伸的探针的3’末端与通用引物序列C1互补的序列(cC1)，其中使用在位于或接近原始探针的5’末端的C1序列作为模板。在一个可选的实施方案中，具有3′-5′校正活性的DNA聚合酶可用于同时除去3′尾和延伸探针。
然后将得到的分子作为模板通过使用含有C1序列的引物和含有C1互补序列(cC1)的引物的PCR实施扩增，如图.3B底部所示。
上述第一种扩增方法的那些可附加用于降低副产物合成的可选步骤也可有效用于本方法的可选的实施方案中，如使用非可切割活套探针的实施方案。
还提供了活套探针的第三个实施方案，所述方案除了缺少可切割位点外与图.1A所示的第一个实施方案的相同或高度相似。因此，探针的结构是5′-C1-H1-C2-H2-3′。
该探针用在与上述第一种和第二种扩增方法相似的方法中。探针首先与模板杂交。其次，使用DNA聚合酶将探针作为引物从H2延伸。第三，延伸的探针发生分子内杂交。第四，然后用核酸外切酶除去任何存在的延伸自H1-cH1双链体的3′尾。第五，自杂交的延伸探针进一步延伸从而生成与C1通用引物序列互补的序列(即，cC1)。在这一阶段，将得到的分子作为PCR模板。然而，与使用分别含有C1和cC1序列的PCR引物的第二种方法相反，使用含有C1和C2序列的引物实施PCR，如第一种方法。
而根据活套探针和使用所述探针实施核酸扩增的方法的另一个实施方案，已知为“标签”(Bc)序列的独特鉴别序列可有效地包含在活套探针中。这样做的一个优势是使用所述探针生成的PCR产物可以用比传统分析方法如直接测序或Southern分析更高的速度和有效性而进行定性和定量分析。如本领域技术人员将认识到的，在所述探针将用于多重PCR时，在活套探针中使用标签特别有益。在该方式中，可将有效的多重PCR与特异性反应产物的多重鉴定联合。如本领域技术人员已知，为了唯一地鉴别同等数量的核酸，可以设计一组不同的标签序列，其中每一欲鉴别的核酸均含有一个选自所述组的标签序列，由此在特定标签和特定核酸之间建立了一对一的对应。
可将每个标签序列的互补序列按照本领域技术人员所熟悉的技术以预先确定的空间模式固定在固相基质上，例如，玻璃基片。然后，荧光标记的含有标签序列的核酸与基片上的序列杂交，然后用激光扫描仪检测。
因为特定标签和特定核酸之间的一对一的对应关系，特定核酸存在或不存在的定性检测，和/或所述核酸数量的定量检测可基于可检测到的荧光信号的位置结合对特异性标签的互补序列的基片位置的认识而得以推断。
标签序列和使用所述序列的应用的其它描述可参见(除了其它来源)Shoemaker等，Nature Genet.14(4)450-456(1996)；EP 0799897；Fan等，Genome Res.10853-680(2000)；美国专利6,150,516；PCT公开WO 02/059354和PCT公开WO 02/059355，上述公开的内容全文引入此处作为参考。
对于本说明书所述的活套探针第一种实施方案，可将标签序列置于C1和H1序列之间。如图.7上部所示，通过使用探针扩增模板(序列)中的目的序列后，在双链产物的顶链上生成含有如下结构的PCR产物5′-C1-Bc-H1-模板序列-cH2-cC2-3′。
根据一个可选的实施方案，可将标签序列置于探针C2和H2之间。如图.7底部所示，通过使用该探针扩增目的序列后，在底链上生成含有如下结构的PCR产物5′-C2-Bc-H2-序列-cH1-cC1-3′。
本发明的组合物和方法能有效地提高传统多重PCR及相关方法迄今已经应用的全部用途的性能。
因此，可使用本发明的组合物和方法在同一反应中扩增来自单个患者基因组DNA的多个基因的序列。通过该方式，可研究多基因疾病如癌症的状况。
在另一个实施方案中，可以对样品中的特定核酸进行定量。这包括，例如，检测RNA样品中的特定mRNA的量，以及检测在基因组DNA样品中扩增的致癌基因的拷贝数。使用本发明的组合物和方法还可以同时扩增存在于同一样品中的RNA和DNA模板。
为实现模板定量的目的，通常选择彼此相对靠近且具有相似大小的探针的两个同源性区域，H2和H1。可通过使用含有标签的活套探针实现检测和定量扩增产物对本领域技术人员而言将是显而易见的。
而在另一个实施方案中，存在于mRNA或hnRNA群体中的剪接变体可通过设计在外显子-外显子连接区或在分离外显子中包含H2和H1同源性区域的活套探针而进行分析。
本发明的组合物和方法还可用于SNP基因分型的用途中。
在一组所述实施方案中，应设计探针以便其3′末端恰与将检测的模板核苷酸的下游杂交。对每一SNP类型，实施两个反应。所有变异可分为4种不同的类型例如A/G、A/C、A/T和G/C SNP。因此可在八个反应中检测全部SNP。在A和G SNP的实施方案中，用脱氧G和双脱氧A进行一个反应，用双脱氧G和脱氧A进行另一个反应。在延伸一个碱基之后，用腺苷三磷酸双磷酸酶破坏该核苷酸，然后加入全部4种核苷酸，然后实施前述扩增方法。
用于所述SNP基因分型检测中的同源性区域优选彼此靠近且产生小且相似的大小。可将标签或标记物掺入探针从而可以在所述特定反应中检测存在或不存在所述特定序列。如果SNP基因分型检测还使用标签芯片，可将8个反应统一进行。例如，可联合含有脱氧A和双脱氧G的反应和含有脱氧A和双脱氧C的反应。该统一进行确实能潜在性降低在要杂交的芯片上发生两个反应的样品的数量。
为了定量两个不同等位基因的每个基因的表达，还可以采用本说明书所述的方法在RNA上实施SNP基因分型。而且，所述基因分型检测可用多重方式实施，且为了检测目的，还可掺入合标签。
在另一个方面，本发明还提供了使用能够持续扩增的自引发探针的核酸扩增方法。
在该方法中，提供同时引发和持续扩增的单个分子探针，而不需要通用引物。因为将在这些实施方案的探针用于扩增，使用量通常比在上述方法中使用的探针量高许多，最通常是fmole或更大的范围。
如图.8A-8C中所示，所述方法使用具有双极性的探针，其中探针的两端均为3′末端且在探针的末端间存在极性改变。探针的一个臂含有第一同源性区域(H1)，而另一个臂含有特定序列(BC)，其后是第二同源性区域(H2)。所述特定序列可以是，例如标签序列，但也可以是，例如另一同源性区域。可切割位点(X)将特定序列(BC)和第二同源性区域(H2)隔开。
所述可切割位点可通过DNA聚合作用产生。例如，可切割位点可以是切割型限制性内切酶如BstNBI、BstSEI或Bst9I(全部在提高的温度下具有活性)的位点。
或者，可使用限制性内切酶，但限于仅酶切一条链。其实现的一个方式是在DNA合成中使用一个或多个含有硫代磷酸酯的核苷酸，致使所述链的酶切受抑制。多种酶已知在高温下以该方式起作用，如Bso BI。已知，至少一种酶(Bsm I)切割含有硫代磷酸酯的链，使得可以采用常规核苷酸实施DNA合成而将硫代磷酸酯置于探针中。可固定探针以便最小化任何潜在的引物二聚体形成。可采用例如用链霉抗生物素珠子俘获位于探针上的生物素分子实施所示固定。生物素掺入探针的适当的位置可以位于或接近极性改变位点。
如图.8A中所示，第一个步骤是模板DNA与探针的第一同源性区域(H1)的杂交，然后是从探针第一同源性区域(H1)的延伸，从而生成“第一链”。
变性后，在促进自杂交的条件下进行杂交，该条件例如相对短的杂交时间、低盐和/或稀释。
然后合成“第二链”，从第二同源性区域(H2)延伸，其后是可切割位点(X)的切割，和变性，从而产生含有第一同源性区域(H1)、靶序列互补序列和第二同源性区域(H2)互补序列的“第一链”，以及含有特定序列(BC)、极性转换区、第二同源性区域、靶序列、第一同源性区域(H1)互补序列和特定序列(BC)互补序列的“第二链”。
切割步骤通常使用能够在提高的温度下起作用的酶，从而可以在DNA聚合酶延伸的同一步骤中实施切割。
由上述步骤产生的两条链，即，第一和第二链能够进行指数扩增。第二条合成链能够在特定序列(BC)处发生自-杂交，并随后延伸从而生成第一链的另一拷贝，其可以通过切割可切割位点而再次释放出来。原始的第一链能够与新探针杂交，所述新探针可被延伸从而产生能在下一个循环中自杂交且作为延伸反应的模板的链。从探针中释放的所述链可用于下游应用中，但其不应含有特定序列(BC)或标签。与探针联接的扩增链含有特定序列(BC)或标签，其可用于下游检测方法中。在某些用途中，探针中的非生物学极性改变的存在可能是不需要的。在这些情况中，探针可被设计为携带如尿嘧啶碱基或核糖碱基的可切割位点以便从探针中释放扩增链。
在该方法中，可能发生通过切割而释放的链与新探针的非所需的杂交。副产物的指数增长将仅发生在与可被切割的探针臂杂交的情况下。该扩增需要每个循环中的双分子杂交。为了克服这一潜在的背景，制备短的可被切割的臂上的同源性区域(H1)，其具有低解链温度。在所述情况下，双分子杂交可能不会发生，从而抑制副产物的发生率。假定同一探针分子上两种序列的高效浓度，H1与其互补序列的分子内杂交仍将发生。在随后的循环中，由于将标签加入H1从而生成更长的互补区，分子内杂交甚至会更易进行。
使用该方法的一种方式为以通过仅发生自杂交(例如通过稀释)的线性扩增开始并在第二链生成后进行延伸。在对适当产物(但不是引物-二聚体或其它副产物)进行线性扩增富集之后，可开始指数期。探针的固定化极大地将引物-二聚体的生成最小化且可用于附加于，或代替初始线性扩增方法。该方法中的主要可能背景是自引发产生的。小心操作确保两个3′末端间无自引发。探针臂的3’末端和第二个探针的中部间的自引发事件不能允许指数增长，但探针两个臂的3′末端间的自引发事件将允许指数性扩增。
上述方法的变化只依赖于线性扩增。其可适用于例如核酸定量检测中。使系统以线性方式扩增的一个方法是制备能够在臂末端被切割的位点。在所述情况中，通过自杂交和切割来进行扩增。该释放的分子能够引发新探针但得到的延伸产物不能自杂交。适用的可切割位点是核糖残基。耐热RNAse A或RNAse T1(依赖于特定核糖残基)，能切割能延伸的核糖，该核糖在随后的下一循环中得以延伸。
在上述方法中，通过切割和变性步骤从探针中释放出扩增链。然而，还可预期释放扩增链的可选的其它方法。进一步预期合成和释放的链可以是RNA链。
例如，可将适合于T7聚合酶(或T3或SP6)的序列置于不包含可切割位点的探针上的标签序列的上游。第一和第二链合成方法还可用上述方法实施。双链T7启动子序列可用于RNA转录以生成两条链中一条链的多个拷贝。在所述方法中，扩增为线性的。
在需要进一步扩增的情况中，可使用逆转录酶来生成RNA转录本的互补物，然后其能够与新探针分子杂交。可完成变性步骤，其能从探针中释放RNA链，其后发生自杂交和DNA聚合步骤从而产生含有双链T7启动子序列的双链分子。由于模板分子数目增多，故新一轮的RNA转录产生了比初始转录更多的RNA转录本。由于T7聚合酶不具有热稳定性，需要在该步骤中加入额外的聚合酶，然而适用的耐热RNA聚合酶也是可以使用的。或者，RNAse H可代替加热变性RNA/DNA双链体而用来在杂交体中除去RNA链。对于每一降解的RNA链而言，都会产生新的双链T7聚合酶序列，其能够生成RNA链的多个拷贝。
下述实施例解释本发明方法的步骤。下述实施例以说明性方式，而非限制性方式给出。
实施例1与DNA模板和RNA模板杂交的活套探针的延伸使用下述序列合成一种称为A1的130个核苷酸的活套探针TTGTCGAACAGTCCACGAGGTCTCTAGTCCGAATTGTTTCATCATCGTTAUUACGTAGCTGTAAAACGTCGGCCAGTGCTATTCGCTGGAGTTCGCACGCTATATTTAAAAGCATCACCAGAAGAAACAG[SEQ ID NO1]。在A1的5′末端用荧光染料Cy3标记(在图.4A中表示为探针5′端的“FI”)。C1的序列为GTCCACGAGGTCTCTAGTC[SEQ ID NO2]。C2的序列为TGTAAAACGTCGGCCAGTGCTATTC[SEQ ID NO3]。H1的序列为CGAATTGTTTCATCATCGTTA[SEQ ID NO4]。H2的序列为AGCATCACCAGAAGAAACAG[SEQ ID NO5]。两个尿嘧啶碱基直接连接于H1末端之后并作为切割位点。合成后，凝胶纯化A1。
使用DNA模板进行探针A1的延伸在反应缓冲液中将探针A1与DNA模板混合至终浓度分别为10nM和50nM。模板DNA为称为cpm39-60的41个核苷酸的cDNA片段。cpm39-60的序列为CGAATTGTTTCATCATCGTTACTGTTTCTTCTGGTGATGCT[SEQ ID NO6]。反应缓冲液(1×)包含20mM Tris HCl(pH8.3)，25mM KCl，10mM MgCl，1mM DTT和各为0.2μM的dNTP。然后将混合液在80℃孵育2分钟，然后置于46℃30分钟以便使A1与模板特异性杂交。探针A1中的H2与cmp39-60的3’末端的20个核苷酸杂交，由此留下模板的20个核苷酸供DNA聚合酶阅读。图.4A中显示了与模板杂交的探针A1。
然后在混合液中加入5个单位的AmpliTaq DNA聚合酶(PerkinElmer公司)的Stoffel片段，然后混匀。然后进行延伸反应，并在10、20和40分钟时取等份试样。然后通过使用变性7M脲聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析反应产物。通过用荧光扫描仪扫描凝胶来检测反应产物的条带。图.4A中显示了模板上延伸的探针A1。
图.4B的左半部显示了使用DNA模板的延伸反应的结果。泳道1中为未反应的探针A1。在泳道2-4中为使用DNA作为模板的延伸了额外20个核苷酸的探针，致使与未反应的探针相比，延伸的探针具有较低的移动度。泳道2-4中具有最高移动度的条带对应于未反应的探针A1。根据该实验的结果，探针A1的延伸在10分钟的时间里基本完成。
使用RNA模板进行探针A1的延伸如上所述，探针A1与350个核苷酸的Tch2RNA转录本杂交。探针的3′末端位于距RNA模板5′末端60个核苷酸处。图.4A中显示了与模板杂交的探针A1。然后在反应混合液中加入Superscript II逆转录酶(Invitrogen公司)以进行探针的延伸。图.4A中显示了模板上延伸的探针A1。然后按照上述方法分析反应产物。
图.4B的右半部显示了使用RNA模板的延伸反应的结果。泳道1中为具有高移动度的未反应的探针A1。泳道2-4中分析的反应产物显示通过逆转录延长了60个核苷酸的探针，这产生较低移动度的条带。与使用DNA模板相似，延伸反应在10分钟的时间里基本完成。
实施例2含有尿嘧啶碱基回送结构在切割位点的切割为证实切割步骤，合成并凝胶纯化分别称为2B和2A的两种活套探针。两种探针均在其各自的5′末端用荧光染料Cy3标记(在图.5A和图.6A中表示为探针5′端的“FI”)。2B的序列为CATGCTGTCAGTACCACCATCACAGGTTGGTCTGGTCTCUUACCACCTTCTCACGGCTCAACGTTCCTATTCGGTTTTTTTGCAAATGTTATCGAGGTCCGGCGAGACCAGACCAACCTGTGATTTTTT[SEQ ID NO7]。2A的序列为CATGCTGTCAGTACCACCATCACAGGTTGGTCTGGTCTCTTACCACCUUCTCACGGCTCAACGTTCCTATTCGGTTTTTTTGCAAATGTTATCGAGGTCCGGCGAGACCAGACCAACCTGTGATTTTTT[SEQ ID NO8]。2B和2A在靠近每个探针的3′末端均含有5′同源性区域，称为H1，和其互补链，称为cH1。H1的序列为TCACAGGTTGGTCTGGTCTC[SEQ ID NO8]。cH1的序列为GAGACCAGACCAACCTGTGA[SEQ ID NO9]。探针2B和2A间的主要区别为探针2B含有紧接H1序列之后的两个尿嘧啶碱基，而探针2A含有距离H1序列末端8个碱基的两个尿嘧啶碱基。
将探针2B和2A分别与反应缓冲液混合至探针终浓度为20nM，缓冲液浓度为1×(20mM Tris HCl，pH8.3，25mM KCl，10mM MgCl，1mM DTT和各为0.2μM的四种dNTP)。然后将混合液在80℃孵育2分钟，然后置于46℃30分钟以便使H1和cH1彼此杂交，由此生成回送结构，其显示于图。5A中。
然后加入尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)(New England Biolabs公司)至终浓度为0.03单位/uL，此后将反应物在37℃孵育20分钟，以便UDG从活套结构中去除尿嘧啶碱基，由此产生无嘌呤(AP)位点。
然后检测五种不同的AP-切割酶，包括EndoIV(Trevigen公司)，APEI(Trevigen公司)，Exolll(United States Biological公司)，Endolll(New England Biolabs公司)和Fpg(New England Biolabs公司)，对活套探针2B和2A的切割活性。在分开的反应中，加入每一种酶，然后孵育于37℃以便产生切割作用。
如已经指出的，探针2B的尿嘧啶碱基紧接H1之后。因此，如果切割起作用，将在紧接由H1和cH1构成的双链体之后和在H1和cH1间的单链环的起始处发生切割，而不在双链体后留下3′突出端。反之，探针2A中的尿嘧啶碱基后接H1末端的8个核苷酸。因此，如果切割起作用，其将进一步发生在单链环中并在H1的3′末端留下一个8个核苷酸的单链尾巴。图.5A中显示了可选择的切割结构。
在切割反应期间，取等份并用7M脲聚丙烯酰胺凝胶实施变性凝胶电泳来分析反应产物，通过用荧光扫描仪实施扫描来检测反应产物条带。
图5B中显示了这些试验的结果。未反应的探针2A出现在图.5B左半部分的泳道“C”中。未反应的探针2B出现在图.5B右半部分的泳道“C”中。两种探针在凝胶中均以相对低的迁移率移动。泳道1～5分别显示了用酶EndolV、APEI、Exolll、EndoIII和Fpg尝试切割的结果。如预期的，Exolll完全降解了探针2B(泳道3，图.5B右侧)。探针2A也被降解(泳道3，图.5B左侧)，可能是由于在用于试验的商购ExoIII制品中存在单链的核酸内切酶的污染。
而探针2A的结果相反，EndolV(泳道1)和Fpg(泳道5)，而非APEI(泳道2)或Endolll(泳道4)，成功地增加了荧光条带的迁移率而没有完全降解探针，这提示了EndoIV和Fpg在AP位点切割探针2A。
然而对于探针2B，三种酶成功地增加了探针的迁移率，这提示了其切割AP-位点的活性，所述酶包括EndoIV，APEI和Fpg。此外，Endolll不能切割活套探针。
注意到被切割的探针2A的迁移率略低于被切割的探针2B，这是因为其与探针2B的切割相比较，探针2A的切割在H1的3′末端留下8个额外氨基酸。
实施例3被切割的回送结构的延伸将探针2A构建至活套结构中，用如实施例2中所述的UDG和EndoIV进行切割。
此后，被切割的探针2A在加入或不加Exol的情况下分别用三种不同的DNA聚合酶处理，以实现被切割的探针的3′端的延伸。所述被测试的DNA聚合酶为DNA聚合酶I的Klenow片段(New England Biolabs公司)(于37℃孵育)，AmpliTaq DNA聚合酶的Stoffel片段(PerkinElmer公司)(于50℃孵育)和Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)(于50℃孵育)。
图.6A中显示了被切割和被延伸的探针。
在反应之后，取出等份并用7M脲聚丙烯酰胺凝胶实施的变性凝胶电泳来分析反应产物，通过用荧光扫描仪实施扫描来检测反应产物条带。
图6B中显示了结果。在图6B的左部是对照反应的结果。与实施例2中一样，未切割的探针2A以低迁移率移动，而被切割的探针以较高的迁移率移动，这是因为荧光标记的片段在切割后变小。
如上面所指出的，探针2A的切割在H1-cH1双链体后留下8个核苷酸的3’突出端。除非除去单链的突出端，被切割的探针不能被延伸。使用Klenow酶的结果提示了Klenow酶具有的3′-5′单链核酸外切酶活性能够除去突出端，之后酶的DNA聚合酶活性从H1末端成功地延伸了被切割的探针。图.6B显示了在用Klenow切割和延伸之后，与未处理的切割的探针相比，荧光标记的片段如预期的以低迁移率移动。相对于单独使用Klenow(“-”泳道)，Exol(“+”泳道)的存在是多余的。
相反地，单独使用Stoffel片段对被切割的探针的处理(“-”泳道)不能有效地延伸，因为Stoffel片段缺少任何3′-5′单链核酸外切酶活性。加入Exol能够补救这一点(“+”泳道)，其通过首先除去3’突出端，从而使得Stoffel片段的DNA聚合酶活性随后能够从H1进行延伸。
最后，Pfu聚合酶(其与Klenow片段相似也具有3′-5′单链核酸外切酶活性)能够除去3′切割的突出端并能使用H1作为引物延伸探针(将“-”泳道与“+”泳道比较)。
本说明书所提及的全部专利、专利公开和其它公布的参考文献全文引入作为参考，正如每一篇文献被独立和特异地引入一样。虽然描述了本发明优选的示例性实施方案，本领域技术人员将会认识到本发明可用所述仅用于解释性目的而不是限制方式的实施方案以外的其它方法进行实施。本发明仅受下述权利要求的限制。
权利要求
1.一种核酸扩增的方法，包括(a)在支持特异性杂交的条件下，将线性扩增分子与核酸模板接触，(b)在与所述模板杂交的末端处向所述线性扩增分子顺序加入与所述模板中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸，由此形成延伸的线性扩增分子，(c)在支持其特异性分子内杂交的条件下，孵育所述延伸的线性扩增分子，由此形成双链分子内杂交区，其中一条链包含在步骤(b)中新加入的核苷酸，(d)在预先确定的位点切割所述延伸的线性扩增分子，由此形成所述延伸的线性扩增分子的第一片段和第二片段；和由此所述第一片段与所述第二片段沿所述分子内杂交区接触；和(e)在由所述切割步骤新生成的末端向所述第一片段顺序加入与所述第二片段中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸，由此形成延伸的第一片段。
2.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(e)后对存在于所述延伸的第一片段中的序列进行指数性扩增的步骤。
3.权利要求2的方法，其中使用聚合酶链式反应实施所述指数性扩增步骤。
4.权利要求1的方法，进一步包括消除未杂交的线性扩增分子的步骤。
5.权利要求4的方法，其中使用核酸外切酶实施所述消除未杂交的线性扩增分子的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述线性扩增分子包含尿嘧啶碱基。
7.权利要求6的方法，其中使用在尿嘧啶碱基处停止的DNA聚合酶实施步骤(b)。
8.权利要求1的方法，其中步骤(e)的所述延伸的第一片段包含亲和性俘获部分。
9.权利要求8的方法，其中所述亲和性俘获部分是生物素化核苷酸。
10.权利要求9的方法，还包含将所述延伸的第一片段与生物素-结合部分接触的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述生物素结合部分选自抗生物素蛋白，链霉抗生物素，生物素-特异性抗体。
12.权利要求1的方法，其中所述线性扩增分子包含寡核苷酸。
13.权利要求12的方法，其中所述寡核苷酸包含脱氧核糖核酸。
14.权利要求1的方法，其中所述线性扩增分子包含荧光部分。
15.权利要求1的方法，其中所述模板选自DNA、质粒DNA、基因组DNA、病毒DNA、细菌DNA、核DNA、线粒体DNA、细胞DNA、RNA、mRNA、hnRNA、rRNA、病毒基因组RNA。
16.权利要求1的方法，其中使用DNA聚合酶实施所述顺序加入核苷酸的步骤。
17.权利要求1的方法，其中使用一种或多种酶实施所述切割步骤。
18.权利要求1的方法，其中所述预先确定的切割位点是无嘌呤位点。
19.权利要求1的方法，其中使用化学因子实施所述切割步骤。
20.权利要求2的方法，进一步包括分析所述指数性扩增的序列的步骤。
21.一种用于核酸扩增的线性分子，包括a)与第一引物序列基本上相似的第一引物区，b)与核酸的第一同源性区域的序列基本上相似的第一同源性区域，c)可切割位点，d)与第二引物序列基本上相似的第二引物区；和e)与所述核酸的第二同源性区域的序列的互补序列基本上相似的第二同源性区域，其中所述核酸的第一和第二同源性区域位于核酸的同一单链上；和其中所述核酸的第一同源性区域位于所述链的5′末端的近侧以及所述第二同源性区域位于所述链的5′末端的远侧。
22.权利要求21的线性扩增分子，进一步包括标签序列。
23.权利要求22的线性扩增分子，其中所述标签序列位于第一引物区和第一同源性区域之间。
24.权利要求23的线性扩增分子，其中所述标签序列位于第二引物区和第二同源性区域之间。
25.权利要求21的线性扩增分子，进一步包括荧光部分。
26.权利要求21的线性扩增分子，进一步包括亲和性俘获部分。
27.权利要求26的线性扩增分子，其中所述亲和性俘获部分是生物素。
28.权利要求21的线性扩增分子，其中所述线性扩增分子是寡核苷酸。
29.权利要求28的线性扩增分子，其中所述寡核苷酸包含脱氧核糖核酸。
30.权利要求29的线性扩增分子，其中所述寡核苷酸包含尿嘧啶碱基。
31.权利要求21的线性扩增分子，其中所述可切割位点能够用酶特异性切割。
32.权利要求31的线性扩增分子，其中所述切割位点能够生成无嘌呤位点。
33.权利要求21的线性扩增分子，其中所述切割位点能够用化学因子特异性切割。
34.一种核酸扩增的方法，包括(a)在支持特异性杂交的条件下，将线性扩增分子与核酸模板接触，在与所述模板杂交的末端向所述线性扩增分子顺序加入与所述模板中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸，由此形成延伸的线性扩增分子，(c)在支持其特异性分子内杂交的条件下，孵育所述延伸的线性扩增分子，由此形成分子内杂交区，(d)从所述延伸的线性扩增分子的末端除去步骤(b)中新加入的并且在所述分子内杂交区中没有进行特异性杂交的一个或多个核苷酸；和在所述分子内杂交区中杂交的末端处向所述线性扩增分子顺序加入与所述线性扩增分子中存在的相应核苷酸互补的一个或多个核苷酸，
35.权利要求34的方法，进一步包括在步骤(e)后对所述延伸的线性扩增分子进行指数性扩增的步骤。
36.一种用于核酸扩增的线性分子，包括a)与引物序列基本上相似的引物区，b)与核酸的第一同源性区域的序列基本上相似的第一同源性区域；和c)与核酸的第二同源性区域的序列的互补序列基本上相似的第二同源性区域，其中所述核酸的第一和第二同源性区域位于核酸的同一单链上；和其中所述核酸的第一同源性区域位于所述链的5′末端的近侧以及所述核酸的第二同源性区域位于所述链的5′末端的远侧。
全文摘要
本发明提供了用于核酸扩增，特别是能使多重扩增反应中的副产物的生长和扩增最小化的组合物和方法。本发明提供了线性扩增分子。第一个实施方案包含第一通用引物序列、第一模板同源性区、可切割位点、第二通用引物序列和第二模板同源性区。本发明还提供了将线性扩增分子用于核酸扩增的方法。第一个实施方案包含模板特异性杂交、线性扩增、模板特异性分子内杂交、链切割、第二次线性扩增和使用通用引物的指数扩增。
文档编号C12P19/34GK1697882SQ02826595
公开日2005年11月16日 申请日期2002年11月19日 优先权日2001年11月19日
发明者M·法翰姆, E·A·纳姆萨拉伊夫, T·D·威利斯 申请人:帕拉里勒生物科学公司