多重荧光pcr检测mrsa用的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒及检测方法,该试剂盒，其特征在于包括：mecA正向引物；mecA反向引物；femA正向引物；femA反向引物；femB正向引物；femB反向引物；mecA探针；femA探针；femB探针。检测方法包括以下步骤：提取样品DNA；对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于多重荧光PCR检测MRSA的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测MRSA的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【专利说明】多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，本发明还涉及一种采用上述 试剂盒检测MRSA的方法。本发明基于Taqman技术，建立了一种多重突光PCR技术，可同时 检测金黄色葡萄球菌耐甲氧西林methicillin resistant staphylococcus aureus,简称 MRSA的三种相关基因，即mecA、FemA、FemB。
【背景技术】
[0002] 由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物 的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金 黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着内酞胺类抗 生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)在临床分离的葡萄球菌中比 例不断增加，MRSA几乎对所有内酞胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古 霉素敏感性下降的MRSA。
[0003] 传统细菌耐药性方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺 点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域 的应用近年来发展了一系列快速细菌鉴定或）耐药检测技术，例如基于PCR技术和DNA探 针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以 得到检测结果，大大缩短了检测时间。
[0004]MRSA产生了mecA基因，该基因负责编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，它降低 3 -内酰胺抗生素亲和力，而PBP2a与固有的PBP2共同作用，使得细菌尽管在0 -内酰胺抗 生素的环境中也能合成细胞壁，使细菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药。mecA 基因位于葡萄球菌染色体mec盒staphylococcalcassettechromosomemec简称SCCmec 侧面DNA的特有片段上。SCCmec是一个携带mec基因复合体的可移动基因岛genomic islands，GI，甲氧西林耐药和其他抗生素耐药基因在此不断积累，形成耐药岛resistance island，RI，导致MRSA对抗生素多重耐药。
[0005] Berger克隆了 femA基因，在其中插人一个转座子，使甲氧西林抗性金黄色葡萄 球菌转变成敏感性金黄色葡萄球菌，证明femA与金黄色葡萄球菌的内酞胺类抗生素 抗性紧密相关。N. K0BAYASHJF的研究则表明，部分表皮葡萄球菌中也发现有mecA的存在， 而femA和femB基因并不存在于表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌S. haemolyticus和头葡萄球 菌S. capitis。因此仅仅检测mecA并不能很好的预测MRSA的存在，N. K0BAYASHJF认为同 时检测三种基因是预测MRSA最可靠方法。
[0006] 针对金黄色葡萄球菌这三种MRSA相关基因，研究人员已开展了多重常规PCR方法 研究，基于Taqman技术建立MRSA检测单一基因，如mecA基因方法也已经研究成功，但是这 种方法存在很多局限，而且存在部分金黄色葡萄球菌，mecA荧光PCR检测阳性，却没有表现 出耐甲氧西林的耐药性，所以存在很多MRSA被漏检的情况。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使 用方便，检测快捷，准确，适用于多重荧光PCR检测MRSA的试剂盒；
[0008] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测MRSA的方法，该方法操作简 便、快速，成本低，检测结果准确。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0010] 一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于包括：
【权利要求】
1. 一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于包括： mecA正向引物：5' -GGTCCCATTAACTCTGAA-3' ； mecA反向引物：5' -TGTGCGATTGTATTGCTA-3' ； femA正向引物：5' -AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3' ； femA反向引物：5' -CCACCAGCATAATAAACAA-3' ； femB正向引物：5' -CCACCAGCATAATAAACAA-3' ； femB反向引物：5' -CCGAATTTGACAACTTTG-3' ； mecA探针：5, -(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3,； femA探针：5' _(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3' ； femB探针：5' _(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3'。
2. 根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于还包括 有PCR反应液、dNTPs混合液、Taq聚合酶、DNA模版和水。
3. 根据权利要求2所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于制备 20μL反应体系由以下组分组成： 含Mg2+PCR反应液 2.OuL 各 2. 5raMdNTPs混合液 2. 0μL Taq聚合酶 0· 5 μL mecA正向引物 0. 5 μL mecA反向引物 0μL femA正向引物 0. 5L femA反向引物 0. 5μL femB正向引物 0. 5μL femB反向引物 0. 5μΙ, mecA探针 0· 5μL femA探针 0. 5μL femB探针 0. 5μL DNA模版 1.0PL 水 10. 0μL。
4. 根据权利要求3所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于所述各 2. 5mM的dNTPs混合液由 2. 5mMdATP、2. 5mMdCTP、2. 5mMdTTP、2. 5mMdGTP组成。
5. -种采用如权利要求3所述的多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒检测MRSA的方 法，其特征在于包括以下步骤： A、 提取样品DNA; B、 对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成： 含Mg24 PCR反应液 2. O PL 各 2. 5mMdNTPs混合液 2OμL Taq聚合酶 0· 5 μL mecA正向引物 0· 5 μL mecA反向引物 OημL feraA正向引物 OouL feraA反向引物 0.5UL femB正向引物 0 5UL femB反向引物 0. 5μL mecA探针 0 5μI feraA探针 0. 5μL femB探针 0.5 UL DNA模版 1.0UL 水 10.0 μL; c、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤B中所述的荧光PCR扩增按以下 步骤进行： (1) 92°C?96°C预变性 30s; (2) 92°C?96°C变性5s?10s，55°C?63°C退火20s?40s，共进行35?45个循环。
7. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分 析，按以下步骤进行： (1) 92°C?96°C变性Imin; (2) 40°C复性Imin; (3) 然后初始熔解温度60°C?65°C，开始程序升温熔解至92°C?96°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15?25次/秒。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA按以下步 骤进行： 取I. 5mL培养物IOOOOrpm离心2min;沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使 之重新悬浮，加入30μL10%SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37°C温育Ih;加入IOOyL 5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育IOmin;加入等 体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0. 8倍体积的异 丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用ImL的70%乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
【文档编号】C12Q1/68GK104450908SQ201410740651
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月6日 优先权日:2014年12月6日
【发明者】蔡先全, 刘恭源, 李云松, 张鹏杰, 萧绮倩, 赵美转, 张磊 申请人:蔡先全