一种csfv、prrsv-u和prrsv-m的三色荧光pcr检测方法及其试剂盒的制作方法
【专利说明】—种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的检测方法，具体涉及一种同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪痕是由猪痕病毒(Classical Swine Feine Virus, CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该病传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主。感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业带来了重大的经济损失。病猪是本病最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染和隐形感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰爆发的猪瘟也表明，猪瘟的流行形式在发生改变，这给全世界的养猪业带来了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(Bivineviral disease virus, BVDV)和羊边界病毒(border disease virus, BDV)同属黄病毒科(Flaviviridae)痕病毒属(pestivirus),在进行抗原检测的时候,能发生交叉免疫反应,而针对基因设计特异的引物、探针，则可以有效地避免交叉检出。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3KB，含一个大的开放阅读框(0RF)，病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。
[0003]猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是:眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。
[0004]高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductive andRespiratory Syndrom, PRRS)病毒变异株引起的急性高致死性疫病，是目前流行广、危害非常严重的传染病，目前被我国定为二类传染病，由于其可造成母猪繁殖障碍、仔猪及育肥猪的高死亡率，尤其是可引起发病猪免疫抑制机能障碍，因此可给养猪业造成巨大的经济损失。目前。检测PRRSV感染的方法已有多种，包括病毒分离、抗原检测和抗体检测等，这些方法有的操作比较繁琐，有的带有一定的主观性，准确度不高。
[0005]PRRSV分为2个基因型，即基因I型和基因2型，前者是以Lelystad virus(LV株)为代表的欧洲型毒株，后者是以ATCC VR-2332毒株为代表的北美型毒株。PRRSV具有广泛地变异性和毒株的多样性，欧洲和北美分离毒株之间存在显著的抗原差异性，两者只有很弱的交叉反应，不同毒株毒力和致病性也有明显的差异。我国的PRRSV分离毒株大多属于基因2型，S卩北美型，最近已有报道从临床标本中分离出了欧洲型毒株。我国的分离毒株也存在广泛的变异现象和毒株的多样性。2002年在国际上首次分离到非结构蛋白2 (Nsp2)编码区连续缺失12个氨基酸的毒株，2006年出现的高致病性毒株是以Nsp2编码区不连续缺失30个氨基酸(481缺失I个氨基酸，533-561连续缺失29个氨基酸)为特征的，并对猪呈现致死性。
[0006]概括来说猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。
[0007]荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了 “猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒感染的联合检测方法还未兀吾。
[0008]多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV-U)以及高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)的存在，并能对所检测病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒(经典型和高致病型通用)、高致病性猪蓝耳病病毒三色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。
[0010]本发明所采取的技术方案是:
本发明所采用的猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(经典型和高致病型通用)(PRRSV-U)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)三色荧光定量PCR，包括如下步骤:
I)提取待测样品中的病毒RNA ； 2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒(CSFV)的
上游引物=CSFV-F:5’ -CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物=CSFV-R:5’ -CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.2)；
荧光探针:CSFV-P:5’ -ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-3’ (SEQ ID N0.3)
和猪蓝耳病病毒通用型:
上游引物=PRRSV-UF:5，- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3，(SEQ ID N0.4)；
下游引物:PRRSV-UR:5’ - TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’ (SEQ ID N0.5)；
荧光探针:PRRSV-UP:5’-VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0011]和高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)的
上游引物=PRRSV-MF:5，- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’ (SEQ ID N0.7)；
下游引物:PRRSV-MR:5’ - GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’ (SEQ ID N0.8),
荧光探针:PRRSV-MP:5，-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3，(SEQ IDN0.9)
进行三色荧光定量PCR检测，其中，猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的突光探针报告基团不相同；
3)结果分析:反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、PRRSV-U、PRRSV-M 阳性。
[0012]所述荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25 μ 1，组成如下:多色荧光定量PCRMIX 20μ1、反转录酶系0.5μ1、Taq酶系0.5μ1以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4μ1 ;其中三色荧光定量PCR MIX中含有