一种检测egfr基因突变的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，涉及医学诊断和生物技术，具体涉及一种检测EGFR基 因突变的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体家族（EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，其介导的信号转导途 径调节细胞的生长、增殖和分化。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变，这些 突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。因此，EGFR基因突变的检测对癌症的个体化治 疗具有重要的参考价值。
[0003]EGFR家族由四个成员组成，分别是erbBl(EGFR/HER1)，erbB2 (neu/HER2)， erbB3(HER3)，erbB4(HER4)。EGFR家族成员结构相似，包括胞外区、跨膜区、胞内区三部 分。正常情况下，EGFR胞外区与相应配体结合，受体二聚化，形成同源二聚体或与其他 家族成员形成异源二聚体。受体二聚化后构象发生改变与ATP分子结合，激活胞内的酪 氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，启动下游信号转导通路。EGFR的主要信号转导途径有： RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PI3K-PDK通路，PLC-Y通路，JAK-STAT通路（CaoC,Lu S,SowaA,etal.PrimingwithEGFRtyrosinekinaseinhibitorandEGFsensitizes ovariancancercellstorespondtochemotherapeuticaldrugs[J].Cancer Letters. 266 (2) : 249-262)。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外 界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
[0004]EGFR基因位于第七号染色体短臂上（7pl2)，长约118kb，由28个外显子组成。其转 录形成的mRNA长约5. 6kb，编码的EGFR是分子量为170kD的跨膜糖蛋白，编码蛋白由1186 个氨基酸组成，具有酪氨酸激酶（tyrosinekinase,TK)活性，是传递胞外信号到胞内的重 要途经蛋白。
[0005]EGFR酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。其中外显子18-20编码N-lobe， 外显子21-24编码C-lobe。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上 (18-21)，目前发现的TK区域突变有 30 多种（SharmaSV，BellDW，SettlemanJ，et al.Epidermalgrowthfactorreceptormutationsinlungcancer[J].NatRev Cancer. 7(3): 169-181)。突变类型主要有三种：缺失突变、点突变、复制或插入突变。缺失 突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE746-A750,点突变最常见的是发生在外显 子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子19的缺失突变（del E746-A750)和外显子21上的点突变（L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90%。 具体阐述如下：
[0006] 1.外显子19碱基缺失。主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变，导致 EGFR蛋白中氨基酸（ELREATS)序列丢失，这一缺失改变了受体ATP结合囊（ATP-binding pocket，ABP)的角度，从而显著增强癌细胞对Gefitinib的敏感性（SordellaR，Bell DW,HaberDA,SettlemanJ.Gefitinib-sensitizingEGFRmutationsinlungcancer activateanti-apoptoticpathways.Science.305(5687):1163-7；KosakaT,Yatabe Y,EndohH,KuwanoH,TakahashiT,MitsudomiT.Mutationsoftheepidermalgrowth factorreceptorgeneinlungcancer:biologicalandclinicalimplications.Cancer Res. 64(24) : 8919-23)。
[0007] 2.外显子21的点突变。主要是第858位密码子出现T-G转换，引起EGFR蛋白 中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸（简称L858R)，此突变位于DFG序列附近，其作 用是使A-loop的稳定性提高，癌细胞对Gefitinib和Erlotinib的敏感性明显增强。
[0008] 3.外显子20的点突变或碱基插入突变。点突变主要是第790位密码子出现C-T 转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸（T790M)，这一突变仅见 于药物治疗后复发者，突变使得癌细胞对Gefitinib和Erlotinib产生抗性（PaoW，Wang TY,RielyGJ,MillerVA,PanQ,LadanyiM,ZakowskiMF,HeelanRT,KrisMG,Varmus HE.KRASmutationsandprimaryresistanceoflungadenocarcinomastogefitinib orerlotinib.PLoSMed. 2(1):el7)〇
[0009] 目前，EGFR基因突变检测的金标准是组织DNA样本的直接测序。该方法由 Lynch(LynchTJ,BellDff,SordellaR,GurubhagavatulaS,OkimotoRA,Brannigan BW,HarrisPL,HaserlatSM,SupkoJG,HaluskaFG,LouisDN,ChristianiDC,Settleman J,HaberDA.Activatingmutationsintheepidermalgrowthfactorreceptor underlyingresponsivenessofnon-small-celllungcancertogefitinib.NEnglJ Med. 350(21) :2129-39)和Paez(PaezJG，JiinncPA,LeeJC，TracyS，GreulichH，Gabriel S,HermanP,KayeFJ,LindemanN,BoggonTJ,NaokiK,SasakiH,FujiiY,EckMJ,Sellers WR,JohnsonBE,MeyersonM.EGFRmutationsinlungcancer:correlationwith clinicalresponsetogefitinibtherapy.Science. 304(5676): 1497-500)率先报道，其 优点是可以确切了解EGFR基因突变的范围及类型，并且基因突变与Gefitinib临床疗效的 关系已得到肯定。但是测序法操作复杂，费用昂贵，灵敏度不高，因此难以在临床上广泛开 展。此外，有些方法如荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱和毛细管电泳等，需要特殊 的仪器设备，因而仍然不能在临床上进行大范围推广。聚合酶链式反应一单链构象多态性 分析，尽管只能做定性的分析，但通过条件优化，临床上可以作为一种初筛突变的方法。总 之，临床上亟待一种简便、快速、准确和经济的肺癌EGFR基因突变检测方法的出现，为肺癌 个体化治疗服务。
[0010] 本方法通过特异性设计PCR引物结合相关修饰，建立一种检测EGFR基因突变的方 法。发明涉及的检测试剂盒可以通过有无PCR扩增来确定样品中有无EGFR基因突变。该 方法和DNA测序、高效液相色谱和毛细管电泳等相比，有快速、准确、方法简单、成本低的优 点，有利用临床使用和推广。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种具有高特异性和灵敏度的检测EGFR基因突变的引物、 试剂盒及其应用。以基因组DNA、肿瘤组织DNA以及血中游离DNA为检测对象，结合普通PCR技术或实时荧光定量PCR技术，通过有无PCR扩增来确定样品中有无EGFR基因突变，可对 EGFR基因的突变进行快速检测。
[0012] 本发明的目的在于提供一套检测EGFR基因突变的引物组