一种改良的扩增受阻突变检测体系引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种改良的扩增受阻突变检测体系引物及 应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是当今最常见的恶性肿瘤之一，也是高致死率的癌症之一，其中80-85%的患 者为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancers，NSCLC)。近年来随着分子生物学水平 的提高，产生了针对分子靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强，能特异的杀伤肿瘤细胞， 效果显著。其中以表皮生长因子受体（Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)为革巴 点的酪氨酸激酶抑制剂在非小细胞肺癌治疗中日渐突出。EGFR作为癌症治疗的靶点，靶向 药物主要有两类：一类是作用于受体胞内的小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinase inhibitor，TKI)主要包括吉非替尼、埃罗替尼、EKB-569、PKI-166、GW-2016 及CI-1033 ;另 一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体（MAb)，包括西妥昔单抗（cetuximab)、ABX-EGF及 EMD72000。这些药物通过阻断EGFR的活性抑制其磷酸化和信号传导，从而起到抗肿瘤作 用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。
[0003] 大量研宄表明，并非所有肺癌患者从TKI治疗获益，EGFR突变与TKI疗效相关。携 带EGFR基因突变的NSCLC患者在接受易瑞沙和特罗凯治疗时疗效显著，但是研宄发现EGFR 外显子20上的I790M位点和插入为耐药位点，会抑制易瑞沙和特罗凯等药物疗效。临床检 测这些突变能够很好地预测TKI治疗效果，为肿瘤用药提供指导依据。
[0004] 扩增受阻突变检测体系（Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)， 又称等位基因特异PCR(Allele-specificPCR，AS_PCR)，是目前应用最广的突变检测技术， 其原理利用Taq酶缺失校正活性完成突变的检测。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个 不同荧光素、或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。可检测 出样品中含量低至〇. 1-1.0%的突变基因。目前，该方法已成为国际上肿瘤个体化分子检 测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS引物 设计时，通常在3'-末端起第2个碱基位置加入错配，以抑制野生型模板的扩增，因此ARMS 具有很好的SNP检测能力；然而，ARMS技术的缺点在于敏感性较低，只能检测10个拷贝左 右的突变。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种有效提高ARMS引物的敏感性和 特异性的改良的扩增受阻突变检测体系引物。
[0006] 本发明的改良的扩增受阻突变检测体系引物，包括上游引物和下游引物，其中，上 游引物的5'末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，并且所述上游引物3'末端倒数第三 个碱基位置引入错配碱基。
[0007] 进一步的，所述上游引物5'末端引入的碱基为GG、CC或CG。
[0008] 进一步的，所述上游引物3'末端的错配碱基为强错配碱基和中强错配碱基，所述 强错配碱基包括C-T和G-A，所述中强错配碱基包括A-A、G-G和C-C。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种改良的扩增受阻突变检测体系引物在扩增受阻突 变检测体系中的应用。
[0010] 本发明的另一目的是提供一种引物，用于采用扩增受阻突变检测体系检测EGFR21 外显子L858RG>T突变，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的5'末端引入 2-3个不与靶序列配对的碱基，并且所述上游引物3'末端倒数第三个碱基位置引入错配碱 基。
[0011] 进一步的，所述上游引物5'末端引入的碱基为GG、CC或CG。
[0012] 进一步的，所述上游引物3'末端的错配碱基为强错配碱基和中强错配碱基，所述 强错配碱基包括C-T和G-A，所述中强错配碱基包括A-A、G-G和C-C。
[0013] 进一步的，所述上游引物为具有SEQIDNO:1所示序列的上游引物，所述下游引物 为具有SEQIDNO:4所示序列的下游引物。
[0014] 本发明的另一目的是提供一种检测EGFR21外显子L858RG>T突变的试剂盒，其特 征在于：包括具有SEQIDNO:1的上游引物以及具有SEQIDNO:4所示序列的下游引物。
[0015] 进一步的，还包括具有SEQIDNO:5的Taqman探针，所述Taqman探针的5'末端 和3'末端分别被FAM和BHQ1标记。
[0016] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：由于上游引物的5'末端引入2-3个不 与靶序列配对的碱基，当扩增2-3循环之后，5'端引入的"GG"、"CC"和"CG"序列则成为下 轮扩增的模板。这样设计的优势：提高了引物与模板的结合力，提升了ARMS引物的敏感性。 另外，由于上游引物3'末端倒数第三个碱基位置引入错配碱基，在PCR的过程中，抑制野生 型模板的扩增。
[0017] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明的原理示意图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 实施例一
[0021] 如图1所示，本发明的改良的扩增受阻突变检测体系引物，包括上游引物和下游 引物，其中，上游引物的5'末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，并且上游引物3'末端 倒数第三个碱基位置引入错配碱基。
[0022] 由于上游引物的5'末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，当扩增2-3循环之 后，5'端引入的"GG"、"CC"和"CG"序列则成为下轮扩增的模板。由于上游引物3'末端倒 数第三个碱基位置引入错配碱基，在PCR的过程中，抑制野生型模板的扩增。
[0023] 实施例二
[0024] EGFR21外显子L858RG>T突变检测。
[0025] 1、L858R标准品的制备。测序筛选L858R阳性和阴性标本，克隆到pGEM-T载体中， 构建成重组质粒，转化至大肠杆菌DH5a中，提取重组质粒，测序鉴定，稀释备用。
[0026] 2、引物探针设计：普通ARMS引物和应用本专利设计引物见表1，以Taqman探针为 信号系统进行荧光检测，引物送往上海生工合成。
[0027] 表1检测EGFR21外显子L858R引物探针
[0028]
【主权项】
1. 一种改良的扩增受阻突变检测体系引物，其特征在于；包括上游引物和下游引物， 其中，上游引物的5'末端引入2-3个不与祀序列配对的碱基，并且所述上游引物3'末端倒 数第=个碱基位置引入错配碱基。
2. 根据权利要求1所述的改良的扩增受阻突变检测体系引物，其特征在于：所述上游 引物5'末端引入的碱基为GG、CC或CG。
3. 根据权利要求1所述的改良的扩增受阻突变检测体系引物，其特征在于：所述上游 引物3'末端的错配碱基为强错配碱基和中强错配碱基，所述强错配碱基包括C-T和G-A，所 述中强错配碱基包括A-A、G-G和C-C。
4. 权利要求1至3任一项所述的改良的扩增受阻突变检测体系引物在扩增受阻突变检 测体系中的应用。
5. -种引物，用于采用扩增受阻突变检测体系检测EGFR21外显子L858R G〉T突变，其 特征在于；所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的5'末端引入2-3个不与祀 序列配对的碱基，并且所述上游引物3'末端倒数第=个碱基位置引入错配碱基。
6. 根据权利要求5所述的引物，其特征在于；所述上游引物5'末端引入的碱基为GG、 CC 或 CG。
7. 根据权利要求5所述的引物，其特征在于；所述上游引物3'末端的错配碱基为强错 配碱基和中强错配碱基，所述强错配碱基包括C-T和G-A，所述中强错配碱基包括A-A、G-G 和 C-C。
8. 根据权利要求5所述的引物，其特征在于；所述上游引物为具有SEQ ID NO ;1所示 序列的上游引物，所述下游引物为具有SEQ ID NO ;4所示序列的下游引物。
9. 一种检测EGFR21外显子L858R G〉T突变的试剂盒，其特征在于：包括具有SEQ ID NO ;1的上游引物W及具有SEQ ID NO ;4所示序列的下游引物。
10. 根据权利要求5所述的检测EGFR21外显子L858R G〉T突变的试剂盒，其特征在于； 还包括具有SEQ ID NO ;5的化qman探针，所述化qman探针的5'末端和3'末端分别被FAM 和B册1标记。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种改良的扩增受阻突变检测体系引物及应用；本发明提供一种改良的扩增受阻突变检测体系引物，包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的5’末端引入2-3个不与靶序列配对的碱基，并且所述上游引物3’末端倒数第三个碱基位置引入错配碱基；本发明还提供一种改良的扩增受阻突变检测体系引物在扩增受阻突变检测体系中的应用。本发明改良的扩增受阻突变检测体系引物及应用，有效提高ARMS引物的敏感性和特异性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104531889
【申请号】CN201510023443
【发明人】张翼飞, 齐飞虎
【申请人】江苏宏泰格尔生物医学工程有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月16日