专利名称：神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物反应器系统，具体是一种神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统。用于生物工程技术领域。
背景技术：
1992年Reynold和Weiss第一次从成年小鼠的中枢神经系统中分离出了神经干细胞，并成功使其在体外扩增，标志着神经干细胞的研究进入了一个崭新的阶段。由于神经细胞不是专门的抗原递呈细胞(APCs)，对移植的异体神经组织的免疫反应没有其他组织那样强烈，故在体外扩增的异体神经干细胞在移植手术中将摆脱此制约因素，成为治疗神经性疾病的有力手段。现神经干细胞已被尝试用于中枢神经疾病，如帕金森综合症、多发性脑脊髓硬化症和亨廷顿氏舞蹈病的治疗。神经干细胞及其分化细胞还可作为有关药物的针对性筛选系统，神经干细胞分化为各种表型，可模拟体内中枢系统中细胞与组织间复杂的相互作用，在药学研究领域具有广泛的用途。在各种细胞的药理作用和毒性实验中，神经干细胞将为中枢系统疾病侯选药物的药理、药效、药代及毒理等方面提供细胞水平的研究手段，大大减少药物检测所需要动物的数量，降低成本。另外，由于神经干细胞类似于早期胚胎的细胞，它还有可能用来揭示哪些药物会干扰胎儿脑部神经发育和引起出生缺陷等。以上所有应用都要以神经干细胞的大量获得为前提，因此必须有一种生物反应器系统能对其进行大规模扩增才能满足临床与科研的需要。而目前国内外大多数神经干细胞的培养还是在组织培养瓶中进行的，要获得大量神经干细胞，仅仅靠增加组织培养瓶的数目是非常昂贵而低效的，且需耗费大量劳力。除以上问题外，每次从培养瓶到培养瓶的转移中都有染菌和操作失误(如细胞计数/存活率/接种量计算)的危险。
经对现有技术文献的检索发现，Michael S.Kallos等人在《Biotechnology andBioengineering》1999，65(5)589-599上发表的“Extended Serial Passaging ofMammalian Neural Stem Cells in Suspension Bioreactors”(哺乳动物神经干细胞在悬浮生物反应器中长期连续传代培养，《生物技术与生物工程》)一文中，提出了扩增神经干细胞的悬浮生物反应器系统，该系统主要由转瓶、磁力搅拌器和培养箱构成，当神经干细胞生长达到一定浓度时被取出，接种到另外的生物反应器中继续扩增。该装置不能灵活调控O2、CO2等气体的供给，不能为反应器连续地提供培养基并同时移去代谢副产物，从而无法维持神经干细胞最适的生长环境。而且在神经干细胞的接种过程中还有染菌的危险。此外，由于这整个培养过程是在培养箱中进行的，对于观测和取样都极不便利，且培养箱固有的体积在一定程度上又限制了神经干细胞扩增的规模。总而言之，该系统在设计上过于局限且不利于操作和实际应用，即未能摆脱培养箱的限制，不利于扩大扩增规模，无法同步检测；在设计上缺乏弹性，无法为神经干细胞的长期培养提供最适宜的环境。因此用这种生物反应器系统扩增神经干细胞将不仅耗费科研人员的时间和精力，更重要的是，这样的装置无法实现对神经干细胞的长期连续高密度培养。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统。使其摆脱了培养箱的限制，有利于长期大扩增规模和同步检测，并为神经干细胞的长期高密度培养提供了最适宜的环境。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括供气单元、培养液供给单元、细胞扩增单元和第一蠕动泵，其连接方式为供气单元末端通过硅胶输气管与细胞扩增单元相连，培养液供给单元末端通过硅胶输液管与细胞扩增单元相连，第一蠕动泵在硅胶输液管中间。供气单元以最适的比例和流速向细胞扩增单元输入气体，培养液供给单元按照细胞生长的需要，通过调节第一蠕动泵向细胞扩增单元输送培养基，以满足细胞对氧气和营养物质的需求。
所述的供气单元包括CO气体钢瓶、空气压缩机、第一气体流量计、第二气体流量计、第一0.2μm微孔滤膜过滤器、第二0.2μm微孔滤膜过滤器、气体增湿装置、气体增湿装置水浴层、第二蠕动泵、第一水浴锅、第三0.2μm微孔滤膜过滤器和T形三通管，CO气体钢瓶通过铜输气管道依次与第一气体流量计和第一0.2μm微孔滤膜过滤器相连，空气压缩机通过铜输气管道依次与第二气体流量计和第二0.2μm微孔滤膜过滤器相连，第一0.2μm微孔滤膜过滤器和第二0.2μm微孔滤膜过滤器分别通过硅胶输气管与T形三通管相连，T形三通管通过硅胶输气管与气体增湿装置的入气口连接，气体增湿装置外部包有气体增湿装置水浴层，气体增湿装置水浴层的入口和气体增湿装置水浴层的出口分别通过橡胶管与第一水浴锅相连，第二蠕动泵在气体增湿装置水浴层的入口和第一水浴锅中间的橡胶管上，气体增湿装置的出气口上连有第三0.2μm微孔滤膜过滤器。
所述的第三0.2μm微孔滤膜过滤器与供气单元的末端相连接，第三0.2μm微孔滤膜过滤器通过硅胶输气管与细胞扩增单元连接。
所述的培养液供给单元包括第四0.2μm微孔滤膜过滤器、储液罐水浴层、第三蠕动泵、第二水浴锅和储液罐，储液罐的通气口连接第四0.2μm微孔滤膜过滤器，储液罐外部包有储液罐水浴层，储液罐水浴层的入口和储液罐水浴层的出口分别通过橡胶管与第二水浴锅相连，第三蠕动泵设在储液罐水浴层的入口和第二水浴锅中间的橡胶管上。
所述的储液罐的通气口与培养液供给单元的末端相连接，储液罐的通气口通过硅胶输液管与细胞扩增单元连接，在储液罐上设有出液管。
所述的细胞扩增单元包括气体分布器、磁力搅拌杆、转瓶、转瓶水浴层、第四蠕动泵、第三水浴锅、磁力搅拌器、在线监测探头、数据接收处理器、第五蠕动泵、截留装置、废液缸和第六蠕动泵，转瓶外部包有转瓶水浴层，转瓶设在磁力搅拌器之上，转瓶水浴层的入口和出口分别通过橡胶管与第三水浴锅相连，第四蠕动泵设在转瓶水浴层的入口和第三水浴锅中间的橡胶管上，转瓶上设有磁力搅拌杆，转瓶通过硅胶输气管与气体分布器相连，转瓶的一个臂口上接入各种在线监测探头，这些在线监测探头通过数据线和数据接收处理器相连，转瓶的另一个臂口通过硅胶输液管连接截留装置，第五蠕动泵与截留装置相连接，废液缸和截留装置之间通过硅胶输液管相连，第六蠕动泵在废液缸和截留装置之间的硅胶输液管上。
在所述的转瓶的大口和两臂上各设有无毒塑料盖，该三个无毒塑料盖上均有孔眼，在大口的塑料盖上设有进气管、进液管、细胞培养液出口，进液管与细胞扩增单元的培养液起始端相连接，进气管与细胞扩增单元的气体起始端相连接，转瓶的一个臂口上设有细胞回流入口。
所述的截留装置包括截留装置通气口、第五0.2μm微孔滤膜过滤器、废液出口、截留装置入口和细胞出口，截留装置上端有截留装置入口、废液出口和截留装置通气口，底端设有细胞出口，截留装置通气口上还连有第五0.2μm微孔滤膜过滤器，截留装置入口一直由外纵深入截留装置底端近细胞出口处，截留装置入口、细胞出口和废液出口分别通过硅胶输液管与细胞培养液出液口、细胞回流入口和废液缸相连，截留装置主体成中空圆柱形，底部呈抛物面状。
本发明的工作原理是气体增湿装置保证转瓶内的水分不会被不断通入的气体所带走，气体增湿装置水浴层使通入转瓶的水保持在最适宜的温度，使对环境条件极为挑剔的神经干细胞能很好的生长。CO2气体钢瓶和空气压缩机为神经干细胞生长提供最为适宜的5％CO2和95％空气的气体环境，分设双重0.2μm微孔滤膜过滤器确保通入转瓶的气体绝对无菌。储液罐的通气口使储液罐内外气体压力保持恒定，第四0.2μm微孔滤膜过滤器确保储液罐内气体与外界气体进行交换时不会带来外源污染，储液罐外的恒温水浴使流入转瓶的培养液也始终保持在适合细胞生长的最适温度。截留装置通气口使截留装置内外的气压保持平衡，第五0.2μm微孔滤膜过滤器保证了截留装置内的无菌。细胞悬液从截留装置入口进入，细胞经沉降后从细胞出口流出，废液从废液出口被泵出。在线监测探头包括pH计、温度计、溶氧仪、CO2测定仪等，通过这些装置可以实时监测神经干细胞的生长状态，以利于调节气体与培养基的流速。转瓶外的恒温水浴层使细胞培养整个过程中的温度保持恒定。新鲜培养基不断泵入转瓶，而在截留装置中废液则被泵出，神经球下沉，返回转瓶，这使整个培养过程一直维持在适宜的培养基条件之下，且没有细胞的损失，有利于长期大规模扩增神经干细胞。
本发明工作时，供气单元中的CO2和空气经过滤后以适当的比例混和，经增湿装置并再一次过滤后，通过气体分布器进入转瓶中；培养液供给单元中的培养液被蠕动泵泵入转瓶中；神经干细胞以神经球的形式在转瓶中培养，有蠕动泵以适宜的、极缓慢的速度将细胞悬液泵入截留装置中，因重力作用神经球下沉，回流入转瓶中继续培养；而与神经球一起进入截留装置的培养液则被泵出到废液缸中；细胞扩增单元中的在线监测装置实时反应细胞生长条件的变化，从而调节各蠕动泵的转速。
本发明的有益效果是神经干细胞的生长提供了一个最为适宜的环境，适合其长期大规模稳定扩增，包括供气、供液等培养条件与工程参数摸索等常规试验所需的软硬件单元都整合在一个完整的系统之中。此整合的单元还便于对细胞生长时单一参数或多参数进行同步实时研究，提供神经干细胞生长的第一手资料，使试验数据更为可靠、有说服力。带有水浴的增湿装置和储液罐彻底脱离了细胞培养箱的限制，具有更大的灵活性、可调控性和观察性；在线监测系统实时提供细胞生长环境的变化，为随时调整灌注速率提供依据，而不是在取样若干天后才一起检测细胞培养环境的情况；带有截留装置的灌注培养系统在不断泵出废液的同时泵入新鲜培养液，使培养环境保持在恒定的状态，而细胞则在重力的作用下沉降，重新回到转瓶中继续培养，将细胞的损失减小到最低。这些设计都为神经干细胞的长期大规模扩增提供了最为有利的条件。
图1为本发明结构示意2为本发明供气单元结构示意3为本发明培养液供给单元结构示意4为本发明细胞扩增单元结构示意5为本发明截留装置结构示意图具体实施方式
如图1-5所示，本发明包括供气单元1、培养液供给单元2、细胞扩增单元3和第一蠕动泵4，其连接方式为供气单元1末端通过硅胶输气管与细胞扩增单元3相连，培养液供给单元2末端通过硅胶输液管与细胞扩增单元3相连，第一蠕动泵4在硅胶输液管中间。
所述的供气单元1包括CO2气体钢瓶5、空气压缩机6、第一气体流量计7、第二气体流量计8、第一0.2μm微孔滤膜过滤器9、第二0.2μm微孔滤膜过滤器10、气体增湿装置11、气体增湿装置水浴层14、第二蠕动泵17、第一水浴锅18、第三0.2μm微孔滤膜过滤器19和T形三通管20，CO2气体钢瓶5通过铜输气管道依次与第一气体流量计7和第一0.2μm微孔滤膜过滤器9相连，空气压缩机6通过铜输气管道依次与第二气体流量计8和第二0.2μm微孔滤膜过滤器10相连，第一0.2μm微孔滤膜过滤器9和第二0.2μm微孔滤膜过滤器10分别通过硅胶输气管与T形三通管20相连，T形三通管20通过硅胶输气管与气体增湿装置11的入气口12连接，气体增湿装置11外部包有气体增湿装置水浴层14，气体增湿装置水浴层14的入口15和气体增湿装置水浴层14的出口16分别通过橡胶管与第一水浴锅18相连，第二蠕动泵17在气体增湿装置水浴层14的入口15和第一水浴锅18中间的橡胶管上，气体增湿装置11的出气口13上连有第三0.2μm微孔滤膜过滤器19。
所述的第三0.2μm微孔滤膜过滤器19与供气单元1的末端相连接，第三0.2μm微孔滤膜过滤器19通过硅胶输气管与细胞扩增单元3连接。
所述的培养液供给单元2包括第四0.2μm微孔滤膜过滤器22、储液罐水浴层24、第三蠕动泵27、第二水浴锅28和储液罐29，储液罐29的通气口21连接第四0.2μm微孔滤膜过滤器22，储液罐29外部包有储液罐水浴层24，储液罐水浴层24的入口25和储液罐水浴层24的出口26分别通过橡胶管与第二水浴锅28相连，第三蠕动泵27设在储液罐水浴层24的入口25和第二水浴锅28中间的橡胶管上。
所述的储液罐29的通气口21与培养液供给单元2的末端相连接，储液罐29的通气口21通过硅胶输液管与细胞扩增单元3连接，在储液罐29上设有出液管23。
所述的细胞扩增单元3包括气体分布器31、磁力搅拌杆32、转瓶33、转瓶水浴层34、第四蠕动泵37、第三水浴锅38、磁力搅拌器39、在线监测探头40、数据接收处理器41、第五蠕动泵42、截留装置44、废液缸46和第六蠕动泵48，转瓶33外部包有转瓶水浴层34，转瓶33设在磁力搅拌器39之上，转瓶水浴层34的入口35和出口36分别通过橡胶管与第三水浴锅38相连，第四蠕动泵37设在转瓶水浴层的入口35和第三水浴锅38中间的橡胶管上，转瓶33上设有磁力搅拌杆32，转瓶33通过硅胶输气管与气体分布器31相连，转瓶33的一个臂口上接入各种在线监测探头40，这些在线监测探头40通过数据线和数据接收处理器41相连，转瓶33的另一个臂口通过硅胶输液管连接截留装置44，第五蠕动泵42与截留装置44相连接，废液缸46和截留装置44之间通过硅胶输液管相连，第六蠕动泵48在废液缸46和截留装置44之间的硅胶输液管上。
在所述的转瓶33的大口和两臂上各设有无毒塑料盖，该三个无毒塑料盖上均有孔眼，在大口的塑料盖上设有进气管47、进液管30、细胞培养液出口43，进液管30与细胞扩增单元3的培养液起始端相连接，进气管47与细胞扩增单元3的气体起始端相连接，转瓶33的一个臂口上设有细胞回流入口45。
所述的截留装置44包括截留装置通气口49、第五0.2μm微孔滤膜过滤器50、废液出口51、截留装置入口52和细胞出口53，截留装置44上端有截留装置入口52、废液出口51和截留装置通气口49，底端设有细胞出口53，截留装置通气口49上还连有第五0.2μm微孔滤膜过滤器50，截留装置入口52一直由外纵深入截留装置44底端近细胞出口53处，截留装置入口52、细胞出口53和废液出口51分别通过硅胶输液管与细胞培养液出液口43、细胞回流入口45和废液缸46相连，截留装置44主体成中空圆柱形，底部呈抛物面状。
本发明固定安装好后，首先打开细胞扩增单元3中的磁力搅拌器39、第四蠕动泵37和数据接收处理器41，使转瓶33中的细胞一开始就处于适宜的温度和搅拌速率之下。其次开启供气单元1中第二蠕动泵17和第一水浴锅18，并开启CO2气体钢瓶5和空气压缩机6，气体增湿装置11和其中的水，以及本专利中的硅胶输气管和硅胶输液管在使用前都经过灭菌。混和气体经过气体增湿装置11后增湿并预热，经第三0.2μm微孔滤膜过滤器19过滤后通过气体分布器31进入转瓶33中。在开启供气单元1的同时开动第一蠕动泵4和第二蠕动泵17，使储液罐29中预热的新鲜培养液以适宜的流速进入转瓶33中。最后，在细胞培养一段时间(如1-2天)后，开启第五蠕动泵42，将转瓶33中的细胞悬液泵入截留装置44中，通过重力沉降作用，使神经球与废液相分离，重新返回到转瓶33中继续培养，废液则被第六蠕动泵48泵入废液缸46中。
权利要求
1.一种神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，包括供气单元(1)和细胞扩增单元(3)，其特征在于，还包括培养液供给单元(2)和第一蠕动泵(4)，供气单元(1)末端通过硅胶输气管与细胞扩增单元(3)相连，培养液供给单元(2)末端通过硅胶输液管与细胞扩增单元(3)相连，第一蠕动泵(4)在硅胶输液管中间。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的供气单元(1)包括CO2气体钢瓶(5)、空气压缩机(6)、第一气体流量计(7)、第二气体流量计(8)、第一0.2μm微孔滤膜过滤器(9)、第二0.2μm微孔滤膜过滤器(10)、气体增湿装置(11)、气体增湿装置水浴层(14)、第二蠕动泵(17)、第一水浴锅(18)、第三0.2μm微孔滤膜过滤器(19)和T形三通管(20)，CO2气体钢瓶(5)通过铜输气管道依次与第一气体流量计(7)和第一0.2μm微孔滤膜过滤器(9)相连，空气压缩机(6)通过铜输气管道依次与第二气体流量计(8)和第二0.2μm微孔滤膜过滤器(10)相连，第一0.2μm微孔滤膜过滤器(9)和第二0.2μm微孔滤膜过滤器(10)分别通过硅胶输气管与T形三通管(20)相连，T形三通管(20)通过硅胶输气管与气体增湿装置(11)的入气口(12)连接，气体增湿装置(11)外部包有气体增湿装置水浴层(14)，气体增湿装置水浴层(14)的入口(15)和气体增湿装置水浴层(14)的出口(16)分别通过橡胶管与第一水浴锅(18)相连，第二蠕动泵(17)在气体增湿装置水浴层(14)的入口(15)和第一水浴锅(18)中间的橡胶管上，气体增湿装置(11)的出气口(13)上连有第三0.2μm微孔滤膜过滤器(19)。
3.根据权利要求2所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的第三0.2μm微孔滤膜过滤器(19)与供气单元(1)的末端相连接，第三0.2μm微孔滤膜过滤器(19)通过硅胶输气管与细胞扩增单元(3)连接。
4.根据权利要求1所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的培养液供给单元(2)包括第四0.2μm微孔滤膜过滤器(22)、储液罐水浴层(24)、第三蠕动泵(27)、第二水浴锅(28)和储液罐(29)，储液罐(29)的通气口(21)连接第四0.2μm微孔滤膜过滤器(22)，储液罐(29)外部包有储液罐水浴层(24)，储液罐水浴层(24)的入口(25)和储液罐水浴层(24)的出口(26)分别通过橡胶管与第二水浴锅(28)相连，第三蠕动泵(27)设在储液罐水浴层(24)的入口(25)和第二水浴锅(28)中间的橡胶管上。
5.根据权利要求4所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的储液罐(29)的通气口(21)与培养液供给单元(2)的末端相连接，储液罐(29)的通气口(21)通过硅胶输液管与细胞扩增单元(3)连接，在储液罐(29)上设有出液管(23)。
6.根据权利要求1所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的细胞扩增单元(3)包括气体分布器(31)、磁力搅拌杆(32)、转瓶(33)、转瓶水浴层(34)、第四蠕动泵(37)、第三水浴锅(38)、磁力搅拌器(39)、在线监测探头(40)、数据接收处理器(41)、第五蠕动泵(42)、截留装置(44)、废液缸(46)和第六蠕动泵(48)，转瓶(33)外部包有转瓶水浴层(34)，转瓶(33)设在磁力搅拌器(39)之上，转瓶水浴层(34)的入口(35)和出口(36)分别通过橡胶管与第三水浴锅(38)相连，第四蠕动泵(37)设在转瓶水浴层的入口(35)和第三水浴锅(38)中间的橡胶管上，转瓶(33)上设有磁力搅拌杆(32)，转瓶(33)通过硅胶输气管与气体分布器(31)相连，转瓶(33)的一个臂口上接入各种在线监测探头(40)，这些在线监测探头(40)通过数据线和数据接收处理器(41)相连，转瓶(33)的另一个臂口通过硅胶输液管连接截留装置(44)，第五蠕动泵(42)与截留装置(44)相连接，废液缸(46)和截留装置(44)之间通过硅胶输液管相连，第六蠕动泵(48)在废液缸(46)和截留装置(44)之间的硅胶输液管上。
7.根据权利要求6所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，在所述的转瓶(33)的大口和两臂上各设有无毒塑料盖，该三个无毒塑料盖上均有孔眼，在大口的塑料盖上设有进气管(47)、进液管(30)、细胞培养液出口(43)，进液管(30)与细胞扩增单元(3)的培养液起始端相连接，进气管(47)与细胞扩增单元(3)的气体起始端相连接，转瓶(33)的一个臂口上设有细胞回流入口(45)。
8.根据权利要求6所述的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，其特征是，所述的截留装置(44)包括截留装置通气口(49)、第五0.2μm微孔滤膜过滤器(50)、废液出口(51)、截留装置入口(52)和细胞出口(53)，截留装置(44)上端有截留装置入口(52)、废液出口(51)和截留装置通气口(49)，底端设有细胞出口(53)，截留装置通气口(49)上还连有第五0.2μm微孔滤膜过滤器(50)，截留装置入口(52)一直由外纵深入截留装置(44)底端近细胞出口(53)处，截留装置入口(52)、细胞出口(53)和废液出口(51)分别通过硅胶输液管与细胞培养液出液口(43)、细胞回流入口(45)和废液缸(46)相连，截留装置(44)主体成中空圆柱形，底部呈抛物面状。
全文摘要
一种用于生物工程技术领域的神经干细胞长期大规模扩增生物反应器系统，本发明包括供气单元、培养液供给单元、细胞扩增单元和第一蠕动泵，其连接方式为供气单元末端通过硅胶输气管与细胞扩增单元相连，培养液供给单元末端通过硅胶输液管与细胞扩增单元相连，第一蠕动泵在硅胶输液管中间。本发明摆脱了培养箱的限制，有利于长期大扩增规模和同步检测，并为神经干细胞的长期高密度培养提供了最适宜的环境。
文档编号C12M1/00GK1687385SQ20051002458
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月24日 优先权日2005年3月24日
发明者董良, 齐瀚实, 陈彦田, 张宝红, 郭雅静 申请人:上海交通大学