一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，质控引物探针内标混合液包括质控引物对、B-raf基因特异性探针、内标引物对、内标特异性探针和内标模板；检测引物探针内标混合液包括Braf基因V600E突变检测特异性引物对、B-raf基因特异性探针、扩增阻断核酸序列、内标引物对、内标特异性探针和内标模板。该试剂盒将扩增阻碍突变系统和末端磷酸化的野生型扩增阻断核酸序列相结合，将脱氧次黄嘌呤引入到检测B-raf基因V600E突变检测特异性正向ARMS引物中，使每个样本的检测平行进行质控PCR反应和检测PCR反应，每个反应体系均带有能有效避免假阴性及孔间差的内标系统，且成本低，灵敏度高，更能控制批内及批间差。
【专利说明】-种用于检测B-raf基因突变的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变的检测产品，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] B-raf是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/ MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。 B-raf突变状态与多种肿瘤的发生发展相关。在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结 直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf基因突变，约66%恶性黑 色素瘤和15 %的结肠癌中B-raf基因存在体细胞错义突变。大约80-90%的B-raf基因突变 发生在eX〇nl5的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代（V600E)。 目前认为，V600E突变可模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程，从而使得B-raf蛋白异 常激活。对B-raf基因的热点突变V600E位点进行快速、可靠且经济的检测，可指导肿瘤相 关靶向药物的选择、甲状腺癌等分子诊断、为辅助临床医生进行诊断和治疗所需。
[0003] 目前，关于B-raf基因突变检测的方法很多，国内外学者对此进行了大量的研究， 已报道的方法包括：直接测序法，变性高效液相色谱分析（DHPLC)，基于荧光定量PCR平 台开发的的Scorpins-ARMS、ARMS-TaqMAN PCR、等位基因竞争抑制性荧光PCR，以及荧光 PCR-HRM法等。这些方法各有优缺点。其中，直接测序法，简单直观，但其检测能力有限，其 灵敏度仅约为20%，其操作步骤复杂，包括PCR-电泳-测序-测序结果解读等一系列步骤。 DHPLC技术具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变 动范围广、相对价廉等优点，灵敏度可达到3%-1%，但由于不同批次检测时需要重新冲洗过 柱，若冲洗液或者洗脱液浓度稍微有变化，则会导致导致批次间的测量产生差异。目前较为 常用的是基于荧光定量PCR平台开法出的检测方法，其可达到1%甚至含量更低的检测灵敏 度，且为一步加样，一次性闭管检测，无需产物后处理，短时间（1-2小时）内即可完成检测。 而其中荧光PCR-HRM法即为高分辨率熔解曲线法，所使用的仪器较特殊，难以在医院进行 普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。
[0004] 目前，较为先进的B-raf基因突变检测技术是采用扩增阻碍突变系统 (Amplification RegractoryMutationSystem, ARMS)衍生的系列技术。扩增阻碍突变系统本 身于1989年建立，其基本构思是设计2条ARMS上游引物，共用1条下游引物构成PCR反应 体系。等位基因特异性碱基置于引物3末端，这是因为耐热Taq DNA聚合酶缺乏3' -5'外 切校正活性，在PCR反应进行时，位于引物3'末端的特异性碱基分别结合于野生型和突变 型等位基因的位点，若此碱基对形成错配，DNA链延伸反应就会因为3' -5' -磷酸二酯键形 成障碍而受阻；只是ARMS引物3'末端碱基对不同错配区分能力不同，因此对有些突变的区 分能力有限。
[0005] 目前，全球只有两家企业拥有ARMS相关衍生技术和产品：1) Scorpins-ARMS是 英国DxS公司开发的试剂盒，检测灵敏度高，性能稳定。该试剂盒采用探针为Scorpion探 针，Scorpion探针是一种新型的探针，由一条发夹结构的探针和一条引物构成，探针的5' 端和3'端分别标有报告突光和淬灭突光，3'端通过PCR blocker (-个非扩增的单体，防 止探针退火后的延伸)与引物的5'端相连。在自由状态，报告荧光和淬灭荧光很接近，不产 生荧光。变性阶段茎环结构打开，退火时引物与模板结合并延伸，环区与新合成的目的基因 的互补区域结合，此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上，是分子内的结合。由 于发夹结构打开，报告突光和淬灭突光分离，因此可检测到报告突光发出的突光信号。由于 Scorpion探针中序列特异性引物和探针在同一分子上，因此信号的产生特别快。但是该试 剂盒检测成本太高，每份标本需要3000-5000元，不适合广泛推广。2)厦门艾德生物医药有 限公司在生产AmoyDx? BRAF V600E基因突变检测试剂盒，采用ADx-ARMS? (特异引物双扩 增系统）技术，为环形引物双扩增技术，实现了快速和灵敏的检测，但检测费用仍然较高。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种具有完善内标和质控系统，检测快速准确，灵敏度高的 用于检测B-raf基因突变的试剂盒。采用ARMS-TaqMAN PCR和等位基因竞争抑制性荧光PCR 技术的人类B-raf基因突变检测试剂盒，完善内标和质控系统，实现快速、方便、灵敏、经济 检测合批内和批间质量，适合推广应用和产业化。
[0007] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种用于检测B-raf基因突 变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液， 所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、B-raf基因特异性探针、内标引物对、 内标特异性探针和内标模板； 所述检测引物探针内标混合液包括Braf基因V600E突变检测特异性引物对、B-raf基 因特异性探针、扩增阻断核酸序列、内标引物对、内标特异性探针和内标模板。
[0008] 上述技术方案的一种优选是：上述质控引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述质控引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述B-raf基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述Braf基因V600E突变检测特异性引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，且其3'端第三位核苷酸为脱氧次黄嘌呤；所述Braf基因V600E突变检测特异性引物 对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述扩增阻断核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，且其3'端磷酸化； 所述B-raf基因特异性探针和所述内标特异性探针带有不同的荧光基团。
[0009] 上述技术方案的一种优选是：上述B-raf基因特异性探针的5'端和所述内标特异 性探针的5'端分别带有荧光基团FAM和HEX，所述B-raf基因特异性探针的3'端和所述内 标特异性探针的3'端均带有荧光基团BHQ1。
[0010] 上述技术方案的一种优选是：上述内标引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，所述内标引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述内标特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示； 所述内标模板的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。 toon] 上述技术方案的一种优选是：配置反应体系时，所述质控引物对的终浓度与所述 Braf基因V600E突变检测特异性引物对的终浓度相同；所述质控引物探针内标混合液中 B-raf基因特异性探针的终浓度与所述检测引物探针内标混合液中B-raf基因特异性探针 的终浓度相同。
[0012] 上述技术方案的一种优选是：上述反应体系为1〇μ 1或20μ 1，所述质控引物探针 内标混合液中，质控引物对的上游引物和下游引物的终浓度均是〇. 4 μ M，B-raf基因特异 性探针的终浓度是0. 2 μ M，内标引物对的上游引物和下游引物的终浓度均是0. 04 μ M，内 标特异性探针的终浓度是〇. 2 μ Μ，内标模板的终浓度是lOOOOcopie/ μ 1 ; 所述检测引物探针内标混合液中，Braf基因 V600E突变检测特异性引物对的上游 引物和下游引物的终浓度均是〇. 4 μ M，B-raf基因特异性探针的终浓度是0. 2 μ M，所述 扩增阻断核酸序列的终浓度是〇. 8 μ Μ，内标引物对的上游引物和下游引物的终浓度均是 0. 04 μ Μ，内标特异性探针的终浓度是0. 2 μ Μ，内标模板的终浓度是lOOOOcopie/ μ 1。
[0013] 上述技术方案的一种优选是：上述用于检测B-raf基因突变的试剂盒还包括弱阳 性对照液和空白对照液，所述弱阳性对照液是浓度为l〇ng/μ 1的野生型基因组DNA水溶 液，且弱阳性对照液含有10%的B-raf V600E突变阳性质粒；所述空白对照液为双蒸水。
[0014] 上述技术方案的一种优选是：上述用于检测B-raf基因突变的试剂盒还包括PCR 反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2mM的dNTPs和5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶； 所述PCR缓冲液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置PCR 缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8. 3 ; 所述 2mM 的 dNTPs 分别包括 2mM 的 dATP、2mM 的 dGTP、2mM 的 dCTP 和 2mM 的 dTTP。
[0015] 上述用于检测B-raf基因突变的试剂盒，可以用于肿瘤相关靶向药物的选择、甲 状腺癌分子诊断、辅助临床诊断和治疗。
[0016] 本发明具有积极的效果： (1)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒采用ARMS-TaqMAN PCR和等位基因 竞争抑制性荧光PCR技术，首次将内标系统引入人类B-raf基因突变检测试剂盒。内标系 统包括内标引物对、内标特异探针和内标模板，内标模板来自非人源合成DNA.每个反应管 中加入内标系统，正常情况下，无论样本为阳性或阴性样本，内标系统的扩增都应该是正常 的；经反复实验所确认的内标系统不影响质控PCR反应体系或检测PCR反应体系。内标系 统引入B-raf基因突变检测试剂盒是为保证检测结果的准确性，此步设计的优势在于：1) 监测每个PCR管内是否存在抑制导致的假阴性情况；2)判断是否存在扩增孔间差；或3)每 个PCR管内是否存在人为加样错误导致的假阴性结果。
[0017] (2)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒在人类B-raf基因突变检测试剂 盒的开发中，首次使每个样本的检测在两个PCR管内平行进行两组实验：1)质控PCR反应 以及内标系统；2)检测PCR反应以及内标系统。这样设计的优势在于：既可以检测模板质 量，又可以监测假阴性及批间情况；平行进行，可避免重复实验。
[0018] (3)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒首次将扩增阻碍突变系统 (amplification refractory mutation system，ARMS)和野生型扩增阻断核酸序列相结合， 用于B-raf基因突变分型；且在引物的设计上首次将脱氧次黄噪呤（deoxylnosine, dl)引 入到检测B-raf基因V600E突变检测特异性正向ARMS引物中，能在不影响ARMS引物对突 变序列扩增特异性的情况下，提高ARMS引物的扩增效率；同时加入的野生型扩增阻断核酸 序列采取末端磷酸化修饰，从而抑制V600E突变区野生型模板的非特异性扩增，大大增加 B-raf突变检测的灵敏度和特异性。
[0019] (4)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒敏感度达到0. 1?0. 5%，批内CV 和批间CV小于3% ;检测时间为90分钟。实现B-raf基因热点突变检测的高效、低成本、高 灵敏度和准确性；对其它基因突变检测试剂盒的开发具有借鉴意义。
[0020] (5)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒单次检测成本在50元左右，预计 试剂盒定价在200元左右，与国外动则数千元/次的检测费用相比，能让受检者享受到实实 在在的优惠。
[0021] (6)本发明的用于检测B-raf基因突变的试剂盒灵敏度高、内标系统完善，与现有 技术相比，更能适合产业化的标准生产及应用，更能控制批内及批间差。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1采用本发明的B-raf基因突变检测试剂盒实施例1检测未突变样本扩增图； 图2采用本发明的B-raf基因突变检测试剂盒实施例1检测突变样本扩增图。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆 实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的 所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似 或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0024] 实施例1 一、试剂盒的组成。
[0025] 本实施例的用于检测B-raf基因突变的试剂盒，包括：PCR反应液、质控引物探针 内标混合液、检测引物探针内标混合液、弱阳性对照液和空白对照液，如表1所示。PCR反应 液由10XPCR缓冲液、2mM的dNTPs和5U/y 1的热启动酶配制而成。10XPCR缓冲液包括 100mM 的 Tris-HCl、500mM 的 KC1 和 15mM 的 MgCl2，用于配置 PCR 缓冲液的 Tris-HCl 缓冲 液的pH值为8. 3。2mM的dNTPs分别包括2mM的dATP、2mM的dGTP、2mM的dCTP和2mM的 dTTP。热启动酶是Taq DNA聚合酶。十倍浓度的PCR缓冲液和2mM的dNTPs装在A管内， 质控引物探针内标混合液装在B管内，检测引物探针内标混合液装在C管内，热启动酶、弱 阳性对照液和空白对照液分别装在三根不同的管内。
[0026] 质控引物探针内标混合液包括质控引物对、B-raf基因特异性探针、内标引物对、 内标特异性探针和内标模板。检测引物探针内标混合液包括Braf基因V600E突变检测特 异性引物对、B-raf基因特异性探针、扩增阻断核酸序列、内标引物对、内标特异性探针和内 标模板。
[0027] 弱阳性对照液是浓度为lOng/μ 1的野生型基因组DNA水溶液，且弱阳性对照液中 含10% B-raf基因V600E突变阳性质粒。
[0028] 空白对照液为双蒸水。
[0029] 应用本发明的试剂盒进行B-raf基因突变的检测时所采用的反应体系为10μ 1或 20μ 1，试剂盒各组分的使用浓度及在反应体系中的终浓度见表1。
[0030] 表1试剂盒组成表
【权利要求】
1. 一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物 探针内标混合液，其特征在于 ： 所述质控引物探针内标混合液包括质控引物对、B-raf基因特异性探针、内标引物对、 内标特异性探针和内标模板； 所述检测引物探针内标混合液包括Braf基因V600E突变检测特异性引物对、B-raf基 因特异性探针、扩增阻断核酸序列、内标引物对、内标特异性探针和内标模板。
2. 根据权利要求1所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 质控引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述质控引物对的下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述B-raf基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述Braf基因V600E突变检测特异性引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示，且其3'端第三位核苷酸为脱氧次黄嘌呤；所述Braf基因V600E突变检测特异性引物 对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述扩增阻断核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示，且其3'端磷酸化； 所述B-raf基因特异性探针和所述内标特异性探针带有不同的荧光基团。
3. 根据权利要求2所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 B-raf基因特异性探针的5'端和所述内标特异性探针的5'端分别带有荧光基团FAM和 HEX，所述B-raf基因特异性探针的3'端和所述内标特异性探针的3'端均带有荧光基团 BHQl〇
4. 根据权利要求3所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 内标引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，所述内标引物对的下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述内标特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示；； 所述内标模板的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示。
5. 根据权利要求2所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：配置 反应体系时，所述质控引物对的终浓度与所述Braf基因V600E突变检测特异性引物对的终 浓度相同；所述质控引物探针内标混合液中B-raf基因特异性探针的终浓度与所述检测引 物探针内标混合液中B-raf基因特异性探针的终浓度相同。
6. 根据权利要求5所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：所述 反应体系为1〇μ 1或20μ 1，所述质控引物探针内标混合液中，质控引物对的上游引物和下 游引物的终浓度均是〇. 4 μ M，B-raf基因特异性探针的终浓度是0. 2 μ Μ，内标引物对的上 游引物和下游引物的终浓度均是〇. 04 μ Μ，内标特异性探针的终浓度是0. 2 μ Μ，内标模板 的终浓度是l〇〇〇〇copie/y 1 ; 所述检测引物探针内标混合液中，Braf基因V600E突变检测特异性引物对的上游 引物和下游引物的终浓度均是〇. 4 μ M，B-raf基因特异性探针的终浓度是0. 2 μ M，所述 扩增阻断核酸序列的终浓度是〇. 8 μ Μ，内标引物对的上游引物和下游引物的终浓度均是 0. 04 μ Μ，内标特异性探针的终浓度是0. 2 μ Μ，内标模板的终浓度是10000copie/ μ 1。
7. 根据权利要求1至6之一所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在 于：还包括弱阳性对照液和空白对照液，所述弱阳性对照液是浓度为lOng/μ 1的野生型基 因组DNA水溶液，且弱阳性对照液含有10%的B-raf V600E突变阳性质粒；所述空白对照液 为双蒸水。
8. 根据权利要求7所述的一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，其特征在于：还包 括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2mM的dNTPs和5U/ μ 1的Taq DNA聚合 酶； 所PCR缓冲液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓 冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8. 3 ; 所述 2mM 的 dNTPs 包括 2mM 的 dATP、2mM 的 dGTP、2mM 的 dCTP 和 2mM 的 dTTP。
9. 一种如权利要求1所述的用于检测B-raf基因突变的试剂盒，在肿瘤相关靶向药物 的选择、甲状腺癌分子诊断、辅助临床诊断和治疗上的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104099425SQ201410377953
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】赵新泰, 王明, 金芬芬 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司