合，优选的，所述引物组 合针对EGFR基因delE746-A750突变和/或EGFR基因delL747-S752突变。更优选的， 所述针对EGFR基因delE746-A750突变的引物组合为SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQID N0:9,针对EGFR基因delL747-S752 突变的引物组合物为SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、 SEQIDNO:24,并且SEQIDNO:7和SEQIDNO:22的3'末端碱基进行磷酸化修饰。
[0013] 本发明的目的在于提供一种包括上述引物组合的检测试剂盒。所述检测试剂盒为 普通PCR检测试剂盒或荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒采用探针 法或染料法或分子信标法。所述的荧光定量PCR检测试剂盒可采用市售的Taqman探针荧 光定量PCR检测试剂盒、SYBR染料荧光定量PCR检测试剂盒、分子信标法荧光定量PCR检 测试剂盒。所述的普通PCR试剂盒可采用市售的含PCRmix的检测试剂盒。
[0014] 进一步，所述检测试剂盒组分包含下列组分中的一种或几种：聚合酶、PCR反应缓 冲液、dNTP、阴性对照、阳性对照、探针。所述PCR反应缓冲液可以加入一些PCR促进剂，如 稳定酶活性的明胶、BSA、DTT、甘油、TritonX-100等，或降低解链温度、提供反应特异性的 DMS0、甲酰胺、TMAC、甜菜碱等。
[0015] 本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因突变的方法，包括，1)加样：向离心管 中加入待测样品、权利要求1所述的引物组合及PCR反应所需试剂；2)扩增：PCR反应条 件为：90-95°C预变性 10S-10min;90-95°C变性 5S-3min，55-65°C退火 5S-3min，72°C延伸 5S-3min，共 25-40 个循环；最后 72°Cl_30min;3)检测。
[0016] 优选的，检测EGFR基因delE746-A750突变的最佳反应体系为：每25ULPCR反应 体系包括：12. 5iiL的2XTagmix,三条特异性引物分别为10iiM、10iiM、10iiM，模板40ng， 其余为水。PCR反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性20S，57°C退火10S，72°C延伸9S， 共35个循环；最后72°C5min。检测EGFR基因delL747-S752突变的最佳反应体系为：每 25iiLPCR反应体系包括：12.5iiL的2XTagmix，三条特异性引物分别为10iiM、10iiM、 10uM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性20S，60°C退火 10S，72°C延伸9S，共35个循环；最后72°C5min。
[0017] 本发明的目的还在于提供上述引物组合及上述检测试剂盒在制备检测EGFR基因 突变试剂中的应用。其对临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，监测肿瘤的预后具有很好的实 际应用价值。
【附图说明】
[0018] 图1检测系统对EGFR基因delE746-A750突变型的普通PCR检测
[0019] 1，2泳道以￡6?1?基因(16正7464750突变型重组质粒为模板；3,4泳道以￡6?1?基 因野生型重组质粒为模板
[0020] 图2EGFR基因delE746-A750突变检测系统灵敏度的测定
[0021] 图3检测系统对EGFR基因delE746-A750突变型的荧光定量PCR检测A为分别 以107-10拷贝数的EGFR基因野生型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线；B为分 别以107-10拷贝数的delE746-A750突变型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线
[0022] 图4检测系统对EGFR基因delL747-S752突变型的普通PCR检测1，2泳道以EGFR 基因delL747-S752突变型重组质粒为模板；3,4泳道以EGFR基因野生型重组质粒为模板
[0023] 图5EGFR基因delL747-S752突变检测系统灵敏度的测定
[0024] 图6检测系统对EGFR基因delL747-S752突变型的荧光定量PCR检测A为分别 以107-10拷贝数的EGFR基因野生型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线；B为分 别以107-10拷贝数的delL747-S752突变型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0026] 实施例1
[0027] 实施例一人工构建EGFR基因野生型、delE746-A750突变型、delL747-S752突变 型重组质粒
[0028] 实验步骤如下：
[0029] (1)于临床收集已明确EGFR基因野生型、delE746-A750、delL747-S752突变型的 病人血样，提取基因组DNA，人工设计特异性引物（两端分别带有SalI、XbaI酶切位点）， 具体序列如下：
【主权项】
1. 一套检测EGFR基因突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合针对EGFR基因del E746-A750 突变和 / 或 EGFR 基因 del L747-S752 突变。
2. 根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合为SEQ ID NO ;7、SEQ ID N0;8、SEQ ID N0;9 和 / 或沈Q ID N0;22、沈Q ID N0;23、沈Q ID N0;24,所述沈Q ID NO ;7和SEQ ID NO ;22的3'末端碱基进行磯酸化修饰。
3. -种包括权利要求1或2所述引物组合的检测试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为普通PCR检测试 剂盒或英光定量PCR检测试剂盒。
5. 根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒组分包含下列 组分中的一种或几种：聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、阴性对照、阳性对照、探针。
6. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述英光定量PCR检测试剂盒采用 探针法或染料法或分子信标法。
7. -种检测EGFR基因突变的方法，包括，1)加样：向离也管中加入待测样品、权利 要求1所述的引物组合及PCR反应所需试剂；2)扩增；PCR反应条件为；90-95°C预变性 lOS-lOmin ;90-95°C变性 5S-3min，55-65°C退火 5S-3min，72°C延伸 5S-3min，共 25-40 个循 环；最后72°C l-30min讯检测。
8. 根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述退火的温度为 57-60 〇C。
9. 权利要求1或2所述的引物组合在制备检测EGFR基因突变试剂中的应用。
10. 权利要求3-6任意一项所述的检测试剂盒在制备检测EGFR基因突变试剂中的应 用。
【专利摘要】本发明提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用。发明针对EGFR基因的不同突变设计特异性引物并进行相关修饰，以样本DNA为模板，结合实时荧光定量PCR，通过扩增曲线和溶解曲线判断相关突变是否存在。本发明提供的试剂盒及对突变位点的检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可以检测微量的突变，具有很好的临床应用价值。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531893
【申请号】CN201510031086
【发明人】刘辉琦, 潘韵芝, 舒雄
【申请人】舒雄, 潘韵芝
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月21日