物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性或假阳性，吻合度为100%，实验结果见图4、图5、图6。
[0042]图4为多色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，由图可以看出，CSFV为阳性，PRRSV-CH1R 株、PRRSV-JXAl 株、PRRSV_HuN4 株、BVDV、SIV-H1N1、FMDV_0 Mya98、JEV 及阴性质控品均为阴性。
[0043]图5为多色荧光PCR方法中PRRSV-U的特异性实验，由图可以看出，PRRSV-CH-1R株为阳性、PRRSV-HuN4 株为阳性、PRRSV-JXAI 株为阳性，BVDV, SIV-HlNU FMDV-O Mya98、JEV及阴性质控品均为阴性。
[0044]图6为多色荧光PCR方法中PRRSV-M的特异性实验，由图可以看出，PRRSV_HuN4株为阳性、PRRSV-JXAl株为阳性、，其余样品及阴性质控品均为阴性。
【主权项】
1.一种猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)提取待测样品中的病毒RNA； 2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒(CSFV)的 上游引物=CSFV-F:5’ -CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’ (SEQ ID N0.1)； 下游引物=CSFV-R:5’ -CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.2)； 荧光探针:CSFV-P:5’ -ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-3’ (SEQ ID N0.3) 和猪蓝耳病病毒通用型: 上游引物=PRRSV-UF:5，- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3，(SEQ ID N0.4)； 下游引物:PRRSV-UR:5’ - TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3’ (SEQ ID N0.5)；荧光探针:PRRSV-UP:5’ -VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)；和高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)的 上游引物=PRRSV-MF:5，- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’ (SEQ ID N0.7)； 下游引物:PRRSV-MR:5’ - GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’ (SEQ ID N0.8), 荧光探针:PRRSV-MP:5’ -CY5-AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC-BHQ2-3’ (SEQ IDN0.9)； 进行三色荧光定量PCR检测，其中，猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的突光探针报告基团不相同； 3)结果分析:反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、PRRSV-U、PRRSV-M 阳性。
2.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于:所述荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25 μ 1，组成如下:多色荧光定量PCR MIX 20μ1、反转录酶系0.5Pl、Taq酶系0.5μ1以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品4μ1 ;其中三色荧光定量PCR MIX中含有1X多色荧光定量PCR buffer、dNTPs。
3.根据权利要求2所述的联合检测方法，其特征在于:所述1X多色荧光定量PCRbuffer 中含有以下成分:500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的DMSOUOU 的 RNaseOut (U)。
4.根据权利要求2所述的联合检测方法，其特征在于:所述多色荧光定量PCRMIX的组成为: 1X多色荧光定量PCR buffer2.5μ1 CSFV-F (ΙΟμΜ)?μ? CSFV-R (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-UF (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-UR (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-MF (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-MR (ΙΟμΜ)?μ? CSFV-P (ΙΟμΜ)0.5μ1 PRRSV-UP (ΙΟμΜ)0.5μ1 PRRSV-MP (ΙΟμΜ)0.5μ1 dNTPS (1mM)?μ? ddH201.5μ1 Total20.0 μ I ο
5.根据权利要求1所述的联合检测方法，其特征在于:多色荧光定量PCR反应条件为:93 0C 2分钟，然后93 °C 30秒，55?58 °C 45秒，采集荧光信号，40个循环。
6.一种同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分:病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B、反转录酶系、Taq酶系、多色荧光定量PCR MIX、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所述多色荧光定量PCRMIX中含有1X多色荧光定量PCR buffer、dNTPS、及猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒通用型、高致病性猪蓝耳病病毒的特异性引物及多色探针，序列分别为: 猪瘟病毒:上游引物=CSFV-F:5’ -CAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAG-3’ (SEQ ID N0.1)；下游引物=CSFV-R:5’ -CGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTG-3’ (SEQ ID N0.2)；荧光探针:CSFV-P:5’ 6-Fam-ACCTCGAGATGCTACGTGGACGA-BHQl-3’ (SEQ ID N0.3)； 猪蓝耳病病毒通用型: 上游引物=PRRSV-UF:5，- GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3，(SEQ ID N0.4)； 下游引物=PRRSV-UR:5，- TCTGGCGAGTCAAACTCACAA-3，(SEQ ID N0.5)；荧光探针:PRRSV-UP:5’ -VIC- TGTTCAAGCCTGTGTCCGACCCAG-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)； 高致病性猪蓝耳病病毒上游引物=PRRSV-MF:5，- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’ (SEQ ID N0.7)；下游引物:PRRSV-MR:5’ - GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’ (SEQ ID N0.8), 荧光探针:PRRSV-MP:5，-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3，(SEQ IDN0.9)； 其中，猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQl ;猪蓝耳病病毒通用型的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQl ;高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:10X多色荧光定量PCRbuffer中含有以下成分:500mMTris-HCl (pH8.0)、30mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSO、1U 的 RNaseOut(U)。
8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述多色荧光定量PCRMIX的组成如下: 1X多色荧光定量PCR buffer2.5μ1 CSFV-F (ΙΟμΜ)?μ? CSFV-R (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-UF (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-UR (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-MF (ΙΟμΜ)?μ? PRRSV-MR (ΙΟμΜ)?μ? CSFV-P (ΙΟμΜ)0.5μ1 PRRSV-UP (ΙΟμΜ)0.5μ1 PRRSV-MP (ΙΟμΜ)0.5μ1 dNTPS (1mM)?μ? ddH201.5μ1 Total20.0 μ I ο
9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述病毒提取液A每100ml中含有:异硫氰酸胍 480g，0.1M Tris-HCl (pH 6.4) 500ml, 0.2M EDTA (ρΗ8.0) 120ml，余量为水。
10.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于:所述病毒提取液B的组成为异丙醇。
【专利摘要】本发明公开了一种CSFV、PRRSV-U和PRRSV-M的三色荧光PCR检测方法及其试剂盒，该检测方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒的存在，并能对每种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒、猪蓝耳病毒通用型以及高致病性猪蓝耳病毒三色荧光定量PCR 联合检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，最低检测浓度为1×102拷贝/μl。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104531897
【申请号】CN201410742262
【发明人】陈琴苓, 魏文康, 吕殿红, 温肖会, 翟少伦, 袁洁
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月5日