一种用于鉴定水稻育性恢复基因的特异引物组合以及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用分子标记检测技术领域，更具体涉及一个快速定性检测水稻 育性恢复基因分子标记及其应用，适用于各种水稻三系包台型，红莲型恢复系的筛选和鉴 定。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择育种是现代生物技术与传统的育种技术相结合的产物，它使传 统遗传育种学中粗放、经验型的育种技术向现代精细、定向选择转变，使育种变得更加具有 可操作性。如果我们知道某一标签的DNA序列，那么就可以通过简单的PCR扩增技术或者 RFLP/AFLP技术，跟踪特定的有利基因。由于分子标记具有唯一性，而且可借助PCR技术等 方法，具有操作非常简单、结果可靠、效率高、不依赖表型等优点，在遗传育种上已被广泛应 用，具有非常广阔的应用前景。
[0003] 在三系杂交水稻育种中，根据恢保关系的不同，细胞质雄性不育类型主要有三类， 野败型（WA-CMS)、包台型（BT-CMS)和红莲型（HL-CMS)。多数研究者认为水稻野败型细胞质 雄性不育性由2对隐性基因控制。Bharaj等（1995)认为野败型雄性不育受2对效力不同 的恢复基因控制，其中一对强恢复基因位于第7染色体上，而弱恢复基因位于第10染色体 上。Zhang等（1997)利用RAPD和RFLP分子标记技术把IR24的一个恢复基因座位Rf3定 位于第1染色体RG532和RG140、RG458之间。Yao等（1997)利用RFLP分子标记技术把明 恢63的两个恢复基因分别定位于第1染色体RG532与RG173之间和第10染色体长臂C234 与G4003之间，已证明第10染色体长臂的基因座位的效应值大于第1染色体的恢复基因座 位。张桂权等（1994)以珍汕97A、珍汕97B、IR24和9个以IR24为恢复基因供体、以珍汕 97A为轮回亲本选育的近等基因系为材料，用随机引物扩增的方法，发现6个与育性恢复相 关的RAH)分子标记；以&群体为作图群体，通过连锁分析把与育性恢复相关的基因命名为 Rf3、Rf4,并把Rf3定位于第1染色体。张群宇等（2002)用珍汕97A和恢复基因近等基因 系的杂种F2分离群体中的117株完全不育株进行连锁分析，表明Rf4定位于第10染色体， 从YAC4892获得的亚克隆Y38与Rf4座位的连锁距离为0. 9cM，从YAC4630获得的亚克隆 Y110与Rf4座位的连锁距离为3. 2cM。对红莲型细胞质雄性不育恢复性遗传的研究也有了 进展，恢复系密阳23对红莲型不育系丛广41A的恢复性表现为1对显性主效基因控制（黄 青阳等，1999)，以（丛广41A/密阳23) /丛广41B回交群体为基因定位群体，采用群分法， 将存在于密阳23中的恢复基因定位于水稻第10染色体上，距SSR标记RM258约7. 8cM。采 用相同的方法，刘学群等（2004)以YTA//YTB/9311，YTA//YTB/Milyang23为恢复基因定位 群体，将存在于9311中的恢复基因Rf6定位于第10染色体上，与SSR标记RM5373共分离； 将Milyang23对YTA的恢复基因Rf5的座位定位在第10染色体上，与SSR标记RM3510共 分离。Shinjyo等（1975)运用染色体三体和形态特征及遗传连锁分析技术，将BT型细胞质 雄性不育育性恢复基因Rfl定位于第10染色体上，在fgl(fadedgreenleaf)和pgl(pale greenleaf)两个基因之间。Ichikawa等（1997)进一步将该基因定位于第10染色体长臂 的中部，与RFLP标记G2155紧密连锁。梁国华等（2001)用RFLP和微卫星标记对BT型恢 复基因定位，结果发现BT型恢复基因Rfl与C16(72. 6)和G291 (53. 1)之间的交换值分别 为19. 3%和14.0%。在这些已经定位的恢复基因中，现已将Rfl基因成功克隆，发现其编码 一个含PPR(Pentatricopeptiderepeat)结构的线粒体蛋白（KazamaandToriyama, 2003 ; Komorietal.，2004)。Wang等（2006)发现BT型有两个恢复基因Rfla和Rflb，这两个恢 复基因的物理距离相差90kb左右，其中Rfla编码791个氨基酸蛋白，具有18个PPR结构 域；Rflb编码506个氨基酸蛋白，具有11个PPR结构域。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种鉴定水稻育性恢复基因的特异引物组合，解决了【背景技术】中的 问题，采用该引物组合能够快速鉴定水稻的育性恢复基因，对育种材料的选择由盲目变为 精确，大幅度减少了人力资源的浪费，提高了工作效率。
[0005] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
[0006] -种用于鉴定水稻育性恢复基因的特异引物组合，包括正向引物F和反向引物R， 其中正向引物F的基因序列如SEQIDNO. 1所示：5'CCATGACAAGAGGACCAG3'，反向 引物R的基因序列如SEQIDN0. 2 所示：5'GITATAAGTGACGACATCCG3'。
[0007] -种基于上述引物组合的快速鉴定水稻育性恢复基因的方法，步骤如下：首先提 取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用上述的特异引物组合进行PCR扩增，最后针对 扩增DNA片段进行检测。
[0008] 提取目标植物基因组的方法具体如下：首先取一段水稻嫩叶及粉末状石英沙，依 次放入离心管中，将叶片研磨成浆，加入CTAB提取液，60?70°C水浴加热25?30min;
[0009] 其次在水浴后的离心管中加入体积比为24 :1的氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离 心，取上清液转移至另一离心管；
[0010] 再加入无水乙醇，于-20°C下混匀，再于4°C条件下放置20min，12000rpm离心 15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于30iU无菌水即可。
[0011] PCR扩增体系的建立如下：
[0012] 标准的PCR扩增反应体系为25iil，组成如下：
[0013]
【主权项】
1. 一种用于鉴定水稻育性恢复基因的特异引物组合，其特征在于：包括正向引物F和 反向引物R，其中正向引物F的基因序列如SEQ ID NO. 1所示：5'CCA TGA CAA GAG GAC CAG 3'，反向引物 R 的基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示：5' GTT ATA AGT GAC GAC ATC CG 3'。
2. -种基于权利要求1所述的引物组合的快速鉴定水稻育性恢复基因的方法，其特征 在于步骤如下：首先提取目标植物基因组，然后以基因组为模板，用权利要求1所述的特异 引物组合进行PCR扩增，最后针对扩增DNA片段进行检测。
3. 根据权利要求2所述的快速鉴定水稻育性恢复基因的方法，其特征在于：提取目标 植物基因组的方法具体如下：首先取一段水稻嫩叶及粉末状石英沙，依次放入离心管中，将 叶片研磨成浆，加入CTAB提取液，60?70°C水浴加热25?30min ; 其次在水浴后的离心管中加入体积比为24 :1的氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心， 取上清液转移至另一离心管； 再加入无水乙醇，于_20°C下混匀，再于4°C条件下放置20min，12000rpm离心15min，倒 掉上清液，将离心管倒置IOmin使酒精滤干，然后溶于30 μ 1无菌水即可。
4. 根据权利要求2所述的快速鉴定水稻育性恢复基因的方法，其特征在于：PCR扩增体 系的建立如下： 标准的PCR扩增反应体系为25 μ 1，组成如下：
反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下： 1 个循环：94°C 5min 30 个循环：94°C Imin ;58°C Imin ;72°C Imin I 个循环：72°C 5min ; 停止：4°C。
5. 根据权利要求2所述的快速鉴定水稻育性恢复基因的方法，其特征在于：扩增DNA 片段检测方法如下： 首先是扩增片段在1. 〇%浓度的琼脂糖胶上电泳，用DNA提取回收盒纯化回收，克隆测 序； 然后对阳性育性恢复基因的鉴定： (1)以水稻品种9311以及粤泰A作为对照，其中对照材料9311有一条762bp的扩增条 带，粤泰A具有424bp的条带； (2)与9311具有相同的扩增条带的材料就具有该育性恢复基因，与粤泰A-致的就无 该育性恢复基因。
【专利摘要】本发明提供了一种鉴定水稻育性恢复基因的特异引物组合，适用于各种水稻三系包台型，红莲型恢复系的筛选和鉴定。该方法包括下列步骤，首先是育性恢复基因特异分子标记PCR引物设计；其次是DNA的提取；第三是标准PCR扩增体系的建立；第四是扩增DNA片段检测分析。本发明方法简便，操作方便，该方法以水稻育性恢复基因分子标记为基础，快速、准确、可靠地通过实验室筛选水稻恢复系种质材料，使三系配套选育更具有目的性和针对性，克服了传统育种方法的盲目性和低效、工作量大的缺陷，提高了三系，两系杂交育种的选育效率。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104531894
【申请号】CN201510054521
【发明人】谭艳平, 徐鑫, 王春台, 刘学群
【申请人】中南民族大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月31日