[0026]高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M)的
上游引物=PRRSV-MF:5，- AGCTGATGACACCTTTGAGTGAGT-3’ (SEQ ID N0.7)；
下游引物:PRRSV-MR:5’ - GACAAATCCAGAGGCTCATCCT-3’ (SEQ ID N0.8),
荧光探针:PRRSV-MP:5，-CY5- AGAACTGTGACAACAACGCTGACGCAC -BHQ2-3，(SEQ IDN0.9)，扩增片段长度为97bp。
[0027]用于检测猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，淬灭基团为BHQl ;用于检测猪蓝耳病病毒(通用型)的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为BHQl ;用于检测高致病性猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ2 ；
2、标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型包括猪的组织、血清、分泌排泄物等。组织标本:无菌条件下取组织约100?200mg左右，置入1.5ml洁净EP管中，保存待检。血清:用一次性无菌注射器抽取受检猪静脉血3-5ml，留取血清，保存待检。分泌排泄物:无菌条件下采集，保存待检。采集的标本应该尽快送检，或者保存于_20°C。
[0028]3、阳性质控品的制备
分别以猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒通用型(PRRSV-U) RNA以及高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV-M) RNA标准品为模板，进行PCR扩增，步骤如下:
反转录体系:
Oligo dT Primer (50 μ Μ) I μ 1、dNTP Mixture (10 mM ) I μ I 以及总 RNA 2 μ g,65°C 5min,激冷，然后加入 5 XPrimeScript Buffer 4 μ 1(TAKARA 公司)、RNase Inhibitor(40 U/ μ I) 0.5 μ 1、PrimeScript RTase (200 U/ μ I) I μ I 和 RNase free H2O 4.5 μ I反转录条件:
30°C 1min,然后42°C，30min,进行逆转录和成cDNA。
[0029]PCR 体系:
1X 多色荧光定量 PCR Buffer 5 μ 1、TaKaRa Taq (5 U/μ I) I μ 1、dNTP Mixture(各 2.5 mM) 4μ 1、上述 CSFV、PRRSV-U 和 PRRSV-M 上下游引物(10 μ M)各 0.5 μ 1、上述cDNA0.5 μ I 和 RNase free Η2039.25 μ I,
PCR条件:
按照94°C 3分钟预变性，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 45秒，共35个循环，72°C延伸10分钟。
[0030]反应后取5 μ I PCR扩增产物用2 %的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与 pMD-18T 载体连接，重组质粒 pMD-18T-CSFV、pMD-18T-PRRSV-U 及 pMD-18T_PRRSV_M 涂布于培养皿上，转化感受态DH5a细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，取品5μ I稀释测其A260nm和A280nm吸光度值，计算其浓度并换算成绝对拷贝数，稀释成1.0X 17拷贝/ μ 1，作为多色荧光定量PCR的阳性质控品。
[0031]上述所有1X多色荧光定量PCR buffer中含有以下成分:500mMTris-HCl(ρΗ8.0)、30mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSOUOU 的 RNaseOut (U)。
[0032]4、病毒RNA的提取
1)固体组织:取0.5g左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待勻衆后转至1.5ml的EP管中，1000rpm离心2min,取上清100 μ I于1.5ml的EP管中，加入200 μ I RNA提取液A充分震荡，静置3min ；
2)血清或病毒液:取100μ I血清加入200 μ I RNA提取液A充分震荡，静置3min，然后加入200 μ I RNA提取液B，用力震荡15s，4°C 13，OOOrpm离心5min ;
3)弃上清,加入Iml75%乙醇,充分混勻，13，OOOrpm离心5min,小心吸去大部分残留液体；
4)将提取管敞口在室温空气中干燥lOmin，使液体挥发干净，用20μ I DEPC水溶解沉淀即为待检测的病毒RNA。
[0033]5、多色荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系配制如下，多色PCR MIX 20μ 1、反转录酶系0.5Pl、Taq酶系0.5μ1，瞬时离心，然后加入待检测的RNA 4μ1 ;同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品4μ I进行扩增。
[0034]其中，PCR MIX的配方为:
1X多色荧光定量PCR buffer2.5μ1
CSFV-F (ΙΟμΜ)?μ?
CSFV-R (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-UF (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-UR (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-MF (ΙΟμΜ)?μ?
PRRSV-MR (ΙΟμΜ)?μ?
CSFV-P (ΙΟμΜ)0.5μ1
PRRSV-UP (ΙΟμΜ)0.5μ1
PRRSV-MP (ΙΟμΜ)0.5μ1
dNTPS (1mM)?μ?
ddH20 (不含核酸酶)1.5μ1
Total20.0 μ 1
[0035]将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(检测CSFV的报告基团选择FAM，淬灭基团选择BHQl ;检测PRRSV-U的报告基团选择VIC，淬灭基团选择BHQl ;检测PRRSV-M的报告基团选择CY5，淬灭基团选择BHQ2)，设定循环条件:ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000 、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等仪器循环条件为93°C—2分钟，后93°C 30秒一55°C 45秒，40个循环。LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93°C—2分钟，后93°C 5秒一58°C 45秒，共40个循环。
[0036]6、结果分析和判定
反应结束后，调整阈值使阴性质控品无Ct值或Ct值为40，FAM荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为CSFV阳性，VIC荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV-U阳性，CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV-M阳性。多个通道荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，则为对应通道的检测项目呈共阳型。
[0037]当CY5荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线，VIC荧光Ct值大于等于35个循环或没有呈S型扩增曲线，需复检。
[0038]7、灵敏度实验
上述阳性质控品(17拷贝/ μ 1)，依次稀释为1.0Χ106、1.0Χ105、1.0Χ104、1.0 X 103、1.0Χ102、1.0XlO1U.0X 10。拷贝/μ 1，进行灵敏度实验。
[0039]多色荧光定量PCR体系中CSFV检测的敏感性实验见图1，多色荧光定量PCR体系中PRRSV-U检测的敏感性见图2，多色荧光定量PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性见图3。图1为多色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为I X 108、I X 17,1 X 106、IX 105、1X 104、1X 103、1X 12拷贝/μ I的标准品的扩增结果。图2为多色荧光PCR体系中PRRSV-U检测的敏感性实验，从左到右依次为I X 18、I X 107、I X 16、I X 105、I X 104、I X 13,1 X 12拷贝/ μ I的标准品的扩增结果。图3为多色荧光PCR体系中PRRSV-M检测的敏感性实验，从左到右依次为I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷贝/μ I的标准品的扩增结果。
[0040]结果证实本试剂盒检测灵敏度为:1.0X 12 μ Γ1，该多色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍，精确性优于普通PCR方法。
[0041]8、特异性实验
根据上述的多色荧光定量PCR检测方法，用猪瘟病毒野毒株(CSFV)、猪蓝耳病病毒美洲型疫苗株(PRRSV-CH1R)、高致病猪蓝耳病病毒疫苗株PRRSV-HuM和PRRSV-JXA1、以及其它病毒如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪流感HlNl (SIV-HlNl)、口蹄疫病毒O型緬甸98株(FMDV-O Mya98)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、阴性对照进行验证实验并对产