检测核酸中杂化作用的方法

专利名称：检测核酸中杂化作用的方法
技术领域：
，并且首先是在如临床诊断或工业活性化合物研究等的那些要参照自动化方法来保证高的样品处理量的领域内，需要找到能用以实现测量结果的标准化而毋需高昂的校准测量过程。用于检测核酸中杂化作用的现有技术的体系，以及其用于表达分析方面强烈地依赖于用作核酸试样或作为合成核酸试样模板的待测mRNA的完整性。这些体系首先由于标记要杂化的未结合固相的核酸(核酸试样)而变得易于错误解释，这就会弄错所有的测量结果。
本发明的方法可用于表达分析，并且在这分析过程中未标记的靶核酸与连接固相的探针的序列特异性杂化作用可以定量确定，而并不依赖于核酸试样的完整性。能在表面上检测不同核酸探针的最大数值是受限于光学和“微流控”的面积中的物理限制，而本发明公开了一种使用某种体系的DNA阵列，该体系中不受因光学和“微流控”面积的物理限制而受到限制，而且和现有技术中的体系相比较，特定面积上可检测的核酸试样可以明显提高。
一优选实施方式，公开了一种用于检测在固相结合的核酸探针上发生杂化作用的方法，该方法通过使用固相结合的标记过的探针而实现了测量结果的标准化，使用未标记的核酸试样或靶核酸并同时在特定点上对不同靶核酸的表达进行分析。本发明的固相结合的核酸试样可以是DNA或DNA/PNA嵌合体形式[Finn，P.J.等“Synthesis and properties of DNA-PNA chimericoligomers”，1996，Nuc.Acids.Res.，vol.24(17)Ratilainen.T.等“Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA”，2000，Biochemistry，vol.39；van der Laan，A.C.等“Optimization of the bindingproperties of PNA-(5’)-DNA-Chimerae”，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.，vol.8]，由于其自身序列而构成分子内的次级结构，该结构可以通过双链特异性的核酸内切酶而进行识别和裂解。本发明由于形成分子内次级结构而以双链形式存在的核酸探针的部分基本上是DNA，从而就能保障对双链特异性的核酸内切酶的可达性。
由于本发明的固相结合的探针-靶核酸与待检测的核酸进行杂化作用，因而分子内的二级结构，并因此双链区会分解，并且不再能通过双链特异性的核酸内切酶进行识别和裂解。非杂化的且固相结合的核苷酸探针能被酶裂解。本发明核酸探针的标记部分由于酶的裂解而从表面分离，渗入到周围介质中，并且适当时还可以将其洗去。在紧接着将非杂化的核酸探针进行酶分解后，测定那些杂化过且未被酶平截的核酸探针的荧光团。该方法的信号-本底比只是取决于所用双链特异性的核酸内切酶的质量以及与未杂化的核酸探针的分离完全性，并对应于与用放射性标记的核酸进行杂化作用的信号-本底比。
由于不是对确定的核酸试样或靶核酸，而是对固相结合的核酸探针进行标记，所以可以将许多具有不同序列特殊性的核酸探针固定在表面上的特定的面积或特定的点上(点)，这些核酸探针的数量等于所存在的荧光体团数量，因而具有可以根据其激发或发射最大值而从光谱上进行区分的荧光团。本方法的灵敏度可以通过与核酸探针共价连接的荧光体数目而进行提高。
除了已知的荧光团外也可以使用部分结合对，如洋地黄毒苷、生物素或其他半抗原用于标记固相结合的探针。特别是结合不同半抗原的分子(免疫球蛋白，链菌抗生物素)是与不同底物特异性的酶共价连结的。这些酶可以是碱性磷酸酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶等。因此可以根据可用的不同半抗原的数目和可用的不同酶共轭体的数目，将任意多的具有不同序列特性的核酸探针固定在表面上的特定的面积或点(点)上。
用于与经固定的核酸探针进行杂化作用的核酸试样或靶核酸可以是未经标记的DNA、cDNA、cRNA或mRNA。与传统体系相比，为仅使用部分靶核酸或核酸试样进行杂化作用，这部分是与核酸探针的检测模块互补的，因为在本体系中核酸探针是标记的。所述体系的另一优点是，检测灵敏度并不取决于核酸试样的标记效果，而是只取决于核酸探针的标记。而这就可以更为精确地进行确定。
本发明的核酸探针如

图1A所示。典型的核酸探针具有以下成分·至少一种官能基团(1)如氨基基团(NH2)、硫醇基(SH)，或是部分结合对如生物素、洋地黄毒苷用以接合到固相。
·优选是大于11个C2键长度的间隔模块(2)，且其端部之一与官能基团共价连接。
·序列段α(识别和分裂模块)，其长度优选为5-12个核苷酸，由DNA组成并且其3’-端位上共价连接到与固相连结的间隔模块的末端。序列段α含有用于限制性核酸内切酶的识别序列。
·序列片段β(检测模块)，其长度优选为12道30个核苷酸，其3’-端位上共价连接到序列片段α(识别和分裂模块)的5’-端位并且它可以是DNA、RNA或PNA。序列片段β是构成分子的部分该分子，它在适当反应条件下可作为探针和待检测的靶核酸形成异源双链体。序列片段β的核苷酸和/或糖-磷酸盐主链或假肽主链(Pseudopeptidrückgrat)可以和荧光团共价连结。
·序列片段α’(识别和分裂模块)，其由DNA组成并且其3’-端位与序列片段β的5’-端位共价连接。片段α’的序列互补于对应的序列片段α。
·间隔模块(3)，其优选具有大于11个C2键的长度并共价连接到序列段α’的5’-端位。
·适当时还有一分支模块[Newcome G.R.等“Dendritic MoleculesConepts，Synthesis，Perspectives”，1966.CH Publishers](未示出)，其共价连接到间隔模块(3)的端部且其不与序列片段α’的5’-端位连接。在该分支模块的各端上可以连接有直至n个的其他分支模块，从而获得3n末端的最大数，同时在各个末端·连接有荧光团(4)或是部分结合对(生物素或洋地黄毒苷)。
探针通过单元(1)与固态基体连接。此外，该固体表面可以是平整表面，也可以是凸的或是凹的，还可以是纤维或是无机、有机材料制成的微米或纳米颗粒。以下将连接到这种固态基体上的本发明的核酸探针称为DNA阵列。序列片段α和α’是彼此互补的并且可以在适当的条件下形成双链区，也就是双链体α-α’(参见图1B)。通过分子内的双链体形成作用而生成的发夹结构，对于单链构象的热动力学是有利的。于是，在低于序列片段α或α’的平衡熔融温度Tm的温度下，分子只以具有分子内双链体α-α’的发夹结构存在，而该结构通过限制性核酸内切酶而以序列特异性方式分裂。
在利用限制性核酸内切酶进行裂解后，单元(1)，(2)和适当时还有少量的单元(α)的核苷酸还是保持与固相连接。探针的标记单元会渗入周围的介质，并适当时将其洗去。
通过与靶核酸杂化，该核酸可以是RNA或DNA并且其序列是与序列片段β的序列互补的，探针是以与核酸试样构成的双链体形式部分存在。在这种情况下序列片段α和α’以单链形式存在，并不能通过限制性核酸内切酶或其他双链特异性的核酸酶裂解。与分子内双链体α-α’相比，为保证由核酸试样和序列片段β所组成的异源双链体能具有足够的稳定性，序列片段β的平衡熔融温度Tm(β)必须要高于序列片段α或α’的；也就是Tm(β)＞Tm(α)[Bonnet，G.等，“Thermodynamic basis of the enhanced specificity ofstructured DNA probes”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96]。理想的是，由核酸试样与序列片段β所构成的异源双链体的平衡熔融温度Tm(β)要高于分子内双链体α-α’的平衡熔融温度10℃-25℃。和带有相同靶核酸的线形核酸探针相比，可以构成次级结构的核酸探针具有更高的序列特异性。不具有错配碱基的核酸探针/靶核酸双链体和具有错配碱基的核酸探针/靶核酸双链体的平衡熔融温度差ΔTm，在能构成次级结构的核酸探针中约为在线形核酸探针中的两倍高[[Bonnet，G.等，“Thermodunamic basis of the enhanced specificity ofstructured DNA probes”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96]。
本发明的方法可优选用于多重分析。在这种情况下，将n个不同的核酸探针固定在相同面积上，且这些核酸探针本身在序列片段β中，在荧光团的激发光谱和发射光谱内[Vet，J.A.M.等，“Multiplex detection of four pathogenicretroviruses using molecular beacons”，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.96；Marras，S.A.E.等，“Multiplex detection of single-nucleotide variations using molecularbeacons”，1999，Genetic Analysis；Biomolecular Engineering，vol.14]，以及适当时也在包含于序列段α和α’中的对于限制性核酸内切酶的识别序列方面是可以相互区分的。用印刷法将含有等摩尔量的这些n个不同核酸探针的水溶液沉积并固定在固体表面上[Cheung，V.G.等“Making and readingmicroarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Optionsavailable-from start to finish-for obtaining expression data by microarray”，Nature Genetics，vol.21，1999]。这些面积可以是DNA阵列上的“点”或者是微米或纳米颗粒的表面。
这样，就可以同时分析具有不同序列的n个不同的靶核酸与其序列片段α和α’含有对限制性核酸内切酶相同的识别序列的n个不同核酸探针之间的杂化作用。如果核酸探针的序列片段α和α’含有针对n个不同限制性核酸内切酶的n个不同的识别序列，则就可以对n个不同序列的不同靶核酸与n个不同核酸探针之间的杂化作用进行同时或是优选进行顺次的分析。
可以根据以下方法而将本发明的方法用于对核酸探针与靶核酸或核酸试样之间的杂化作用进行多重分析在下述的优选条件下使由一个或多个连接到固态基体的本发明的核酸探针组成的DNA阵列与可以是RNA或DNA的未标记的核酸试样相接触。根据要杂化的表面而在45℃下用20μl-200μl合适的杂化缓冲液培养DNA阵列。
将0.1μg-50μg的未标记核酸试样溶于300μl合适的杂化溶液中，在与DNA阵列的杂化作用开始前在约99℃加热5分钟，并接着冷却5分钟至约45℃。从DNA阵列中去除杂化缓冲液，并用含有核酸试样的杂化液代替。用核酸试样在45℃-60℃下培养DNA阵列16小时。在去除了核酸试样溶液之后，各在50℃-65℃下用不同离子浓度的洗涤缓冲液洗涤DNA阵列。根据核酸试样的种类(DNA或RNA)，它们的长度以及根据被固定的核酸探针的种类(DNA，RNA或PNA)和长度来挑选合适的杂化和洗涤条件[Anderson，M.L.M.“Nucleic acid Hybridization”，1998，Springer-Verlag Telos；Schena，M.“DNA-MicroarraysA practical approach”.1999，Oxford University Press]。
在α-α’双链体范围内通过限制性核酸内切酶而进行的未杂化核酸探针的裂解过程优选是在25℃-37℃下并在生产商所推荐的反应条件下进行。限制性核酸内切酶的活性可以通过向反应物料中添加类脂类化合物而提高到高达34倍[Kinnunen等，“Materials and methods for digestion of DNA or RNA usingrestriction endonucleases”，美国专利5879950]。在洗涤步骤后，根据要杂化的表面，而在25℃-37℃下用20μl-200μl由生产商所推荐的反应缓冲液来培养DNA阵列20-60分钟，并且该缓冲液含有0.5U-5U的能在α-α’双链体范围内裂解核酸探针的限制性核酸内切酶。在室温下通过用1×TE缓冲液洗涤，将被裂解的核酸试样，标记和限制性核酸内切酶从DNA阵列的表面分离除去。
由本发明方法得到的信号和数据优选按以下方法来检测和分析在使用印刷法将标记过的探针转移和固定到固态表面上去[Cheung，V.G.等“Making and reading microarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Options available-from start to finish-for obtaining expression data bymicroarray”，Nature Genetics，vol.21，1999]之前，要确定每个核酸探针的标记度。通过在260nm的波长下借助Lambert-Beerschen规则测定核酸水溶液的吸收量来确定核酸浓度(A260＝ε×d×c，其中A260是λ＝260nm时的吸收量，ε是核酸的摩尔消光系数[cm-1M-1]，其取决于碱基序列和待测核酸的长度，d是所用比色皿的层厚度而c是核酸的浓度[M])。
共轭连接核酸探针的荧光团的浓度是通过利用Lambert-Beerschen规则，在符合荧光团吸收最大值(λmax)的波长处，测定标记过的核酸探针水溶液的吸收度来确定。为了能精确确定与荧光团共轭连接的核酸的浓度，必须要考虑到大多数的荧光团都吸收波长为260nm的光。在260nm处的总吸收度中要扣除荧光团提供的部分，这部分是在荧光团最大吸收度(λmax)的波长处的荧光团吸收度与校正因子CF260的乘积(A核酸＝A260-(Aλmax×CF260))。不同荧光团的摩尔消光系数和260nm处的吸收度的校正因子(CF260)都可从这些荧光团的生产商那里得到(Molecular Probes，BioRad等)。
与核酸探针共轭连接的荧光团浓度对核酸探针浓度的比等于与核酸探针共轭连接的荧光团的量。为了确定被标记的核酸探针的特定荧光，就要确定的这些核酸探针特定量的荧光。然后特殊的荧光就可以在与靶核酸或核酸试样进行杂化作用之前精确确定连接在固态基体上的核酸探针分子的数量。这样，要考虑被固定核酸探针的含量变化，这种变化影响与靶核酸或核酸试样进行的杂化作用，并对其计算修正。因此，按本发明基于靶核酸或核酸试样与核酸探针之间的杂化作用而进行的测量可以是标准化的。
优选通过聚焦激光扫描显微镜来确定DNA阵列中每个样品点的荧光放射。用于在很小面积上确定荧光放射的装置可由一系列的厂商提供，并且在生物技术领域中是实验室标准的[Cheung，V.G.等“Making and readingmicroarrays”，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999；Bowtell，D.D.L.，“Optionsavailable-from start to finish-for obtaining expression data by microarray” ，Nature Genetics，vol.21，Jan.1999]。为使测量结果标准化，就要在杂化作用前确定被固定的核酸探针的荧光。如果在阵列的每一个样品点上都固定有核酸探针该探针是特定序列特异性并用特定荧光团标记，则可以用具有相应于荧光团最大吸收值(λAbs.max)的波长的光来激发荧光，并在相应于最大发射值(λEm.max)的波长处进行检测。如果在DNA阵列的每个样品点上固定有具有不同序列特异性的n个不同核酸探针，且这些探针标记有n个不同的光谱上区分的荧光团，则可以用具有相应于这些荧光团最大吸收值(λAbs.max)的波长的光来激发n个不同荧光团的荧光，并在相应于最大发射值(λEm.max)的波长处进行检测。根据所用的仪器，可以同时或相继确定不同荧光团的荧光。
本发明将通过以下实施例更详细地得到阐述。
实施例1将两次改性的的低聚脱氧核苷酸且其5’-和3’-端位各以C22的间隔与共价连接到异硫氰酸盐荧光素(FITC)和氨基基团(NH2)(序列AFITC-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACAgcgcgggc3-(C22)NH2和BFITC-5’gcccgcgcTTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3-(C22)NH2)溶入100μl的偶合缓冲液(500mM Na2HPO4，pH8.5，1mM EDTA)中(浓度500pmol/ml)。在RT(室温)下于微滴定盘(Thermowell M PCR-Platte，Corning*Surface Technologies)的孔中，在各情况下培养100μl低聚核苷酸溶液30min，且该低聚核苷酸共价连接在孔的表面，如表1所示
表1

表1微滴定盘上核酸试样A和B的位置然后用200μl的10mM Tris pH8.0，150mM的NaCl洗涤微滴定盘中的孔5次。然后在荧光分光光度计中(分子设备(Molecular Devices)SpectramaxGemini XS)，于λAbs.max＝490nm的激发波长和λEm.max＝520nm的发射波长的条件下测定结合在微滴定盘孔中的低聚核苷酸的荧光强度。所得数据列于表3和画于图2(图表1)中表3

表3共价连接在微滴定盘孔中的低聚核苷酸的荧光强度×1000各用125μl的含有0.1mg/ml鲑鱼精子DNA碎片(Gibco BRL/LifeTechnologies)；0.5mg/ml乙酰化的BSA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)的杂化溶液在60℃温度下对微滴定盘的孔进行预杂化4小时。
在分离了预杂化溶液后，将125μl的含有1nmol在0.1mg/ml鲑鱼精子DNA碎片(Gibco BRL/Life Technologies)中的样品-RNA-低聚核苷酸(序列A’＝5’UGUUGAGCCAUCCCUAUU3’和B’＝5’GGCGCUUUCAUUUUGCACUCUAA3’)；0.5mg/ml乙酰化的BSA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mMMES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)的杂化溶液添加到微滴定盘的孔中。配料列于表2中表2

表2微滴定盘上以A’，B’和-标记的区域与核酸试样A’，B’或预杂化溶液进行杂化。
在95℃加热配料20min，在一小时内再冷却到60℃并在60℃下杂化16小时。
在去除核酸试样溶液后，在25℃下用“不精确的”缓冲洗液(6×SSPE；0.01％ Tween 20)对微滴定盘的孔洗涤十次5分钟，接着再在55℃下用“精确的”缓冲洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)对其洗涤五次5分钟。洗涤后，在37℃下用150μl的1×反应缓冲液(NEB Buffer3)使微滴定盘的孔均衡化10分钟，接着各用100μl的含有2单元的限制性核酸内切酶Aci1(New England Biolabs)的1×反应缓冲液在37℃下培养1小时。反应通过添加1/5体积终止液(0.5％w/v SDS，50mM EDTA)和将微滴定盘加热至75℃而终止。接着在室温下用各150μl的1×TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH＝8.0)洗涤微滴定盘孔6次。所有在室温下没有进行的培养物在有盖的加热器的Biometra UNOTMThermoblock中进行加热。然后在荧光分光光度计中(Molecular DevicesSpectramax Gemini XS)，于λAbs.max＝490nm的激发波长和λEm.max＝520nm的发射波长的条件下测定各个微滴盘孔中的荧光强度。所得数据列于表4和图表1(图2)中表4

表4在杂化与限制性消化后，共价连接于微滴定盘孔中的低聚核苷酸的荧光强度×1000可在孔2A-2H，4A-4H，6A-6H，8A-8H，10A-10H，12A-12H，1B，1D，1E，1H，3A，3C，3E，3G，5B，5D，5F，5H，7A，7C，7E，7G，9B，9D，9F，9H，11B，11D，11E以及11G的孔区域检测到的信号对应于系统的背景荧光，并且要将它们从在核酸试样A和B的区域中检测到的信号中扣除。
实施例2以异氰酸酯荧光素(FITC)标记的核酸试样的序列AFITC-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACAgcgcgggc3，BFITC-5’gcccgcgc TTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3’和CFITC-5’gcccgcgc GTTTT TTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’(对照；背景荧光的确定)，在固定在固态基体上不同测试点上使其与从K562细胞中分离出来的5μg样品-RNA，在25pM对照-RNA，0.1mg/ml鲑鱼精子DNA碎片DNA(Gibco BRL/Life Technologies)；0.5mg/ml乙酰化的BSA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mMEDTA，0.01％ Tween 20)中在55℃温度下进行杂化16小时。在去除了核酸试样溶液后，在25℃下用“不精确的”缓冲洗液(6×SSPE；0.01％Tween 20)对DNA阵列洗涤十次5分钟，接着再在50℃下用“精确的”缓冲洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)对其洗涤五次5分钟。
洗涤后，在37℃下用1×反应缓冲液对DNA阵列进行均衡化处理10分钟。接着用100μl含有2单元的限制性核酸内切酶Acil的1×反应缓冲液在37℃下培养1小时。反应通过添加1/5体积终止液(0.5％w/v SDS，50mM EDTA)并将DNA阵列加热至75℃而终止。接着在室温下于1×TE缓冲液(10mM Tri，1mM EDTA，pH＝8.0)中洗涤DNA阵列4-8次。用波长为λAbs.max＝490nm的光波激发滞留在DNA阵列上的杂化过的探针的荧光，并在波长λEm.max＝520nm处的光波下进行检测。可在核酸试样C的范围内检测到的信号对应于系统的背景荧光，并且要将它们从在核酸试样A和B的区域中检测到的信号中扣除。
实施例3将用荧光团FITC(λAbs.max＝490nm，λEm.max＝520nm)，Cascade Blue(λAbs.max＝400nm，λEm.max＝420nm)和BODIPY TR14(λAbs.max＝595nm，λEm.max＝625nm)标记过的核酸试样共同固定到规定面积A(试样点A)上，核酸试样具有序列A(FITC)-5’gcccgcgcAATAGGGATGGCTCAACA-gcgcgggc3’，B(Cascade Blue)-5’gcccgcgcTTAGAGTGCAAAATGAAAGCGCCgcgcgggc3’和C(BODIPY TR14)-5’gcccgcgcTTTCTCTACCTCCTCACATTGTGgcgcgggc3’。将用作用于确定背景荧光的对照物的核酸探针共同固定在另一规定面积B(试样点B)上，该核酸探针是D(FITC)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’，E(Cascade Blue)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’和F(BODIPY TR14)-5’gcccgcgcGTTTTTTTTTTTTGGTTTTTTTTTTTC-gcgcgggc3’。使DNA阵列与0.1μg的样本RNA(cRNA)，在25pM对照-RNA，0.1mg/ml鲑鱼精子DNA碎片(Gibco BRL/Life Technologies)；0.5mg/ml乙酰化的BSA(Gibco BRL/Life Technologies)；1×MES(100mM MES，1.0M NaCl，20mM EDTA，0.01％ Tween 20)中进行杂化16小时，温度为55℃，且试样RNA含有序列D’＝5’UGUUGAGCCAUCCCUAUU3’，E’＝5’GGCGCUUUCAUUUUGCACUCUAA3’和F’＝5’CACAAUGUGAGGAGGUAGAGAAA3’。在去除了核酸试样溶液后，在25℃下用“非精确的”缓冲洗液(6×SSPE；0.01％ Tween 20)对DNA阵列洗涤十次5分钟，接着再在50℃下用“精确的”缓冲洗液(100mM MES；0.1M NaCl；0.01％ Tween 20)对其洗涤五次5分钟。
洗涤后，在37℃下用1×反应缓冲液对DNA阵列进行均衡化处理10分钟。接着用100μl的含有2单元的限制性核酸内切酶Acil的1×反应缓冲液在37℃下培养1小时。反应通过添加1/5体积终止液(0.5％w/v SDS，50mMEDTA)和将DNA阵列加热至75℃而终止。接着在室温下于1×TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH＝8.0)中洗涤DNA阵列4-8次。用波长为λAbs.max＝490nm，λAbs.max＝400nm或λAbs.max＝595nm的光波激发滞留在DNA阵列上且用荧光团FITC，Cascade Blue或BODIPY TR14标记过的杂化探针的荧光，并在波长λEm.max＝520nm，λEm.max＝420nm或λEm.mmax＝625nm处的光波下进行检测。在试样点B的范围内检测到的信号对应于系统的背景荧光，并且要将它们从在试样点A的区域中检测到的信号中扣除。
权利要求
1.通过杂化作用检测靶核酸的方法，其特征在于，在该方法中a)使用至少一种以其端部之一和一固相连接的核酸探针进行杂化作用，其中核酸探针是靶核酸序列或与其互补的序列，该序列以在短核酸序列侧接在其3’-端位并以与该核酸互补的核酸序列侧接到5’-端位上，该核酸构成了一条DNA双链并由此构成裂解模块，该模块可以被双链特异性的核酸酶所裂解并具有的核酸探针在另一端部具有一个标记；b)利用至少一种双链特异性的核酸酶来进行至少一次处理，和c)确定经步骤b)后连接到固相上的标记的比例。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在建立的方法中同时使用多个含有相互不同靶序列的核酸探针。
3.根据权利要求1或2之一的方法，其特征在于，在一过程中使用多个具有彼此不同的并能为不同双链特异性的核酸酶所裂解的分解模块的核酸探针。
4.根据权利要求1-3中之一的方法，其特征在于核酸探针具有多个彼此不同的标记。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于上述标记是指荧光团和/或部分结合对。
6.用于检测与靶核酸进行杂化作用的试验盒，其特征在于试验盒是用于实施一种可使用至少其端部之一和固相连接的核酸探针，和含有靶核酸序列的核酸探针进行杂化作用，该序列以短核酸序列侧接在3’-端位上并以与此核酸互补的核酸序列侧接在5’-端位上，该核酸序列构成了DNA双链并因此而可构成裂解模块并能被双链特异性的核酸酶所裂解，且具有的核酸探针在其另一端具有标记。
7.根据权利要求6的试验盒，其特征在于适于实施如权利要求1至5中之一所述的方法。
全文摘要
本发明公开了通过杂化作用检测靶核酸的方法，在该方法中a)用至少一种其端部之一和固相连接的核酸探针，与具有靶核酸序列或与其互补的序列的核酸探针进行杂化作用，该序列以短核酸序列侧接在3’－端位上并以与其互补的核酸序列侧接在5’－端位上，这构成DNA双链和由此构成的裂解模块，该模块可以被双链特异性的核酸酶所裂解且具有的核酸探针在另一端具有一个标记；b)利用至少一种双链特异性的核酸酶进行至少一次处理，和c)确定经步骤b)后连接在固相上的标记的比例。
文档编号C12N15/09GK1610757SQ02826559
公开日2005年4月27日 申请日期2002年11月25日 优先权日2001年11月29日
发明者克里斯托弗·查尔斯 申请人:富卡斯吉诺米克斯有限责任公司