一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法
【专利摘要】本发明公开了 一种同时检测 12 种常见呼吸道病毒的方法 ，本发明根据12种常见呼吸道病毒（甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒）的基因保守区设计引物和探针，提取待测样品中的核酸片段进行扩增，最后使用毛细管电泳方法分离样品。本发明具有所需样本量低、灵敏度及准确性高、特异性好、成本低的优点。既克服了常规单管多重荧光PCR检测引物设计困难和多色荧光相互干扰不易分型的缺点，也克服了芯片检测方法的操作繁琐，检测成本高等缺点，为呼吸道病毒的筛查提供了新的方法。
【专利说明】-种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学方法进行病毒检测领域，具体涉及一种检测12种呼吸道 病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 呼吸道病毒是一大类能侵犯呼吸道主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据 统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，其中以呼吸道病毒最常见，包括流感病毒、鼻病 毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等。并且，近年来新的致病性呼吸道病毒还在不断 地被发现，如偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒等，给人类的健康构成很大的威胁。急性呼吸道 感染大多具有潜伏期短、发病急、感染力强、传播快等特点，常可导致较高的发病率和死亡 率，尤其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒易发生各种变异，常突然暴发，病情凶 险，死亡率也较高。呼吸道病毒引起的感染症状比较相似，难以靠临床症状及常规检测方法 进行明确诊断，因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性的方法进行筛查。
[0003] 目前，我国常用的呼吸道病毒的检测方法主要包括以下几种：1、电子显微镜镜检 直接对标本中病毒进行形态学鉴定，缺点：①诊断效率低，且有些病毒难以直接从形态学上 进行区分；②需要昂贵设备和有经验操作者。2、病毒分离培养是病毒诊断"金标准"，缺点 ： ①费时费力，且需要有经验操作者；②生物安全风险较高。3、免疫学检查应用最广泛的是 酶联免疫技术（ELISA)，一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗 与一抗发生特异性的结合，再将酶显色，之后观察结果；优点：①样品通量较高，利用96孔 酶标板，可以同时完成多个样本的检测；②较敏感：利用酶联的特性，可以将原来的抗原信 号放大；③比传统的培养法缩短时间。缺点：①易出现假阳性；②灵敏度不确定；③病毒抗 原发生变异时出现假阴性结果。4分子生物学一PCR检测方法：目前经常使用的有PCR、实 时荧光定量PCR等，都是针对病毒的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法 最为成熟。其优点是：灵敏度高并可以精确定量。但是也存在以下缺点：①通量低，一般一 次只能检测一种病毒，多重荧光检测时存在荧光干扰影响检测结果；②检测成本相对较高。
[0004]GenomeLabGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳 分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用 了 96孔板的排列特性。采用多重PCR方法，通过燃料标记，在同一个PCR管中同时分析多 个基因的表达，克服了上述呼吸道病毒检测方法存在的缺陷，具有以下优点： 1、高通量：采用双96孔板，实现单个反应检测12个位点，可同时做192个反应，一天出 结果；对于交叉感染者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。
[0005] 2、准确性强：本方法采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可以将非特异性 扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性； 3、敏感性高，结果重复性好：本方法克服传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差， 提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性。
[0006] 4、方法简便，使用经济：使用引物混合液，每个样品检测12个位点仅需一次加样； 单个样品的检测成本低，利于大规模推广； 5、易于实现自动化。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种高通量、高灵敏度和高特异性的针对12种呼吸道病毒的 快速分子生物学检测方法。
[0008] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：本发明所述的一种同时检测12种 常见呼吸道病毒的反转录引物组，其特征在于，包括针对12种呼吸道病毒和1种内对照 基因的反转录引物，其序列见表1: 表1
【权利要求】
1. 一种同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组，其特征在于，包括针对12种 呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列见表1: 表1
其中博卡病毒和腺病毒无 RT引物，1种内对照基因为人RNA内参，其基因的反转录引 物为：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。
2. -种同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组，其特征在于，包括针对12种呼 吸道病毒和3种内对照基因的PCR引物，其序列见表2 : 表2
其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3种内对照基因的PCR引物：①人RNA 内参的PCR引物序列为：GCCGTGTGAACCATGTGAC ;②人DNA内参的引物序列为：5' CGCTAGGAATCAGACCAACAC 和 5' ATGGCGGTGITTGCAGAT ;③反应内参的引物序列为：5' GCCAGATATACGCGTTGACA 和 5' AGGGCGTACTTGGCATATGAT。
3. -种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)选取适当的目的基因相关序列，设计特异性检测12种常见呼吸道病毒的特异性引 物具体的核苷酸序列如下表3 : 表3
(2) 取被检样品提取总核酸； (3) 以提取的总核酸为模板进行反转录； (4) 建立RT和PCR反应体系，将上述引物以及各反应组份置于PCR仪中，加入被检样 品提取的DNA模板或反转录产物，进行扩增； (5) 以毛细管电泳的方法进行样品分离、鉴定。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所 述的反转录引物包括10种呼吸道病毒的RT扩增引物和人RNA内参的RT扩增引物，所述的 PCR引物包括2种呼吸道病毒的正反向PCR引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应 内参的正反向PCR扩增引物以及上述IO种呼吸道病毒的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR 扩增引物。
5. 根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所 述步骤（2)中的被检样品包括患者的包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和痰液。
6. 根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所 述步骤（3)，RT反应体系及反应条件为：5-20ng/ ii L的核酸样品5 ii L，DEPC水8 ii L，5XRT 缓冲液4 ii L，RT引物2 ii L，RT酶I ii L ;混匀后进行反转录；反应条件是：48°C 1分钟、42°C 60分钟、95°C 5分钟、4°C直至收取RT产物，反转录引物溶液中各RT引物的浓度为500nM。
7. 根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤（4)，PCR反应体系及反应条件：RT产物8. 6 ii L，10XPCR缓冲液2 ii L，25mM氯 化镁4 iiL，PCR引物溶液2 iiL，DNA聚合酶1.4 iiL，X溶液2 ii L ;混匀后加入到PCR管中 进行PCR反应，反应条件是：95°C 10分钟、94°C 30秒、55°C 30秒、70°C 1分钟，35个循 环、70°C 1分钟、4°C直至收取PCR产物；PCR引物溶液中各种PCR引物浓度均为200nM ;所 述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向扩 增引物带荧光标记。
8. 根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所 述步骤（5)包括制备遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
9. 根据权利要求3或4或5或6或7或8所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒 的方法，其特征在于：所述反应体系设立有阳性对照和阴性对照；所述阳性对照是采用上 述12种呼吸道病毒、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因基因重组克隆质粒；所述 阴性对照是未使用的病毒采样液。
10. -种同时检测12种常见呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所 述的同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组和如权利要求2所述的同时检测12种 常见呼吸道病毒的PCR引物组。
【文档编号】C12Q1/70GK104342503SQ201410594064
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】王宇平, 王凌冰, 张建明, 黄野能, 高博, 何冰 申请人:福建国际旅行卫生保健中心, 新疆国际旅行卫生保健中心