一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测小反刍兽疫病毒（PPRV)的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 小反会兽疫（pestedes petits ruminants, PPR)，是由小反会兽疫病毒（PPRV) 引起的一种急性、烈性、接触性传染病，主要感染山羊、绵羊等小反刍兽，特别是山羊高度易 感，野生动物偶然发生，感染率和死亡率高达100%和90%。OIE曾将该病例为发病必须报告 的A类动物传染病，我国将其列为I类动物疫病，一旦发现必须采取紧急严厉的措施进行 控制和扑灭。在我国周边的老挝、孟加拉国、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和緬甸等国家 大规模暴发疫情，对我国养羊业构成了严重威胁。2007年7月，我国西藏日土县发生PPR疫 情，虽然及时采取有效措施扑灭了这次疫情，但这些年我国的一些省份都有小反刍兽疫阳 性病例的报道，这提醒我们要对该疾病持续监测，防止疫情再次出现。因此，建立特异、敏感 的PPR诊断技术非常重要。
[0004] 目前，小反刍兽疫病毒的检测技术主要病毒分离鉴定、抗体血清学检测、病毒核酸 检测。病毒分离鉴定方法，其结果准确可靠，但该方法操作复杂，需要复杂的仪器设备和安 全级别高的实验室环境，对操作人员的技术水平要求高，此外所需时间长，以及受影响的因 素多等缺点，不利小反刍兽疫病毒的快速诊断。抗体血清学检测技术主要是采用OIE推荐 的病毒中和试验（VNT)和竞争ELISA(c-ELISA )。由于小反刍兽疫病毒和同属的牛瘟病毒， 在血清检测中具有共同的抗原，中和试验也有一定程度的交叉反应，因此二者极易混淆；竞 争ELISA也费时且要求活病毒存在。病毒核酸检测方法主要普通的RT-PCR方法和荧光 RT-PCR方法，后者的检测敏感性比前者高，虽然这两种方法较病毒分离鉴定和血清学检测 方法快速准确，RT-PCR需要昂贵的PCR仪，且在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容 易造成实验室污染导致出现假阳性结果，尽管荧光RT-PCR在结果判定上可直接在仪器上 读取结果，但是荧光PCR仪比普通PCR仪更昂贵，且试剂费更高，不利于基层检测以及现场 批量检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决基层快速、批量、准确检测小反刍兽疫（PPRV)，提供一 种方便基层简便、快捷准确地检测PPRV的试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案 为：一种检测小反刍兽疫病毒的转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、 2X反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水、阳性对照和阴性对照，所述的 RT-LAMP 引物包括外引物 F3 (SEQ ID N0:1)与 B3 (SEQ ID N0:2)、内引物 FIP (SEQ ID NO :3)与 BIP (SEQ ID NO :4)和环引物 LF (SEQ ID NO :5)与 LB (SEQ ID NO :6); 其中引物的序列分别为： F3 GACCAGAGAAGGGGTCAAAG B3 CTGCAGCCTGAAGAGTGC FIP TCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG BIP GCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT LF GTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC LB AGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT ； 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
[0006] 以上所述的反应模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病 毒的RNA，或者疑似小反刍兽疫病毒感染的组织的RNA。
[0007] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0008] 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 40-50mM、KCL 20-30mM、MgSO4 16-20mM、（NH4)2SO4 20-25mM、Tween20 0· 2-0. 5 %、Betaine I. 6-3. 2M 和 dNTPs 2· 8-4 mM， 其配制方法在pH为8. 8条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0009] -种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，主要用于检测 兽医临床上疑似PPRV感染的病变组织是否存在PPRV，具体检测步骤包括： (1) 模板RNA模板的提取 (2) RT-LAMP 检测。
[0010] 所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒反应体系建立以25 μ L计， 2X反应缓冲液 12. 5 yL 酶混合物EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 模板 5 μ L 超纯水 补足25 μ L。
[0011] 以上所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测过程采用实时浊度仪LA-320C进 行密闭全程监控，反应程序为63°C反应60分钟，80°C灭活5分钟。
[0012] 本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出小反刍兽疫（PPRV)，所检测的阴性对照病 毒和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、 无需昂贵复杂的仪器，对操作人员的技术水平要求较低。
[0013] 2)灵敏度高 普通的RT-PCR检测方法的灵敏度为9. 8 X 10 3 ng/ μ L，而使用本发明的RT-LAMP检测 方法，检测限约为9. 8 X 10 4 ng/ μ L，是普通RT-PCR的10倍。
[0014] 3)耗时少 普通RT-PCR法需先进行反转录（RT)，然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两 个反应程序，扩增结束后得通过凝胶电泳的方法进行结果判定，整个过程在24小时左右才 能得出结果；而本发明的RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，在20-30 分钟间出现扩增，一个小时内即可完成扩增，从病毒RNA提取到获得最终结果可在2-3小时 内完成，特别是在于批量检测，优势更明显。
[0015] 4)结果判读简便 本发明的RT-LAMP方法在扩增结束即可判读结果，在可见光下将阳、阴性管进行比较， 通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部 有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管 在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析 显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果。
[0016] 5)不造成污染 目前虽然已经建立有RT-LAMP显色法用于检测小反刍兽疫病毒，但显色法只能是反应 结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电 泳的方法进行结果判定，开盖检测容易造成气溶胶产物污染实验室。而本发明的RT-LAMP 荧光目视检测方法，荧光染料是在反应前加入，避免开盖造成污染。此外，本发明的RT-LAMP 检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光 染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0017] 5)可实时定量 本发明利用LA-320C浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度 对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的小反刍兽 疫病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明RT-LAMP检测方法特异性检测结果；其中：1 :小反刍兽疫病毒；2 : 口 蹄疫病毒；3 :蓝舌病病毒；4 :犬痕热病毒；5 :牛病毒性腹泻病毒；6 :牛冠状病毒；7 :细小 病毒；8 :传染性胃肠炎病毒；9 :水对照。特异性检测结果显示，只有小反刍兽疫病毒反应管 出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
[0019] 图2和图3是本发明RT-LAMP检测及普通RT-PCR检测的敏感性检测结果；其 中 I :9. 8X 100ng/ yL ;2 :9. 8X 10 1 ng/ yL ;3 :9. 8X 10 2ng/ yL ;4 :9. 8X 10 3ng/ μ L ; 5 :9. 8Χ 10 4ng/ μ L ;6 :9. 8Χ 10 5ng/ μ L ;7 :9. 8Χ 10 6ng/ μ L ;8 :9. 8Χ 10 7ng/ μ L ;9 : 9.8Χ108 ng/yL ;10 :water。PPRV 原始 RNA 的起始浓度为 9.8X10°ng/yL，经 10 倍倍比 连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示RT-LAMP法检测限约为9. 8 X 10 4ng/ μ L，而 RT-PCR 法检测限为 9. 8 X 10 3ng/ μ L。
[0020] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为PPRV RNA为模板的反应情况，为阳 性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0021] 图5是本发明定量检测PPRV的标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对