一个组成型表达启动子及其应用的制作方法

专利名称：一个组成型表达启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及ー个水稻组成型表达启动子KT632P的功能鉴定和应用。
背景技术：
外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业 生物技术领域广泛应用的主要是ー些组成型的强启动子，比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-I启动子(Battraw and Hall,1990; Christensen et al. 1992)。植物特有的NAC转录因子数量众多，广泛分布于陆生植物中，构成了最大的转录因子家族之一(Duval et al. , 2002;Ooka et al.，2003)。NAC家族的命名源于矮牵牛(Petunia hybrida)NAM(No Apical Meristem)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATAFl、ATAF2 以及 CUC2 (cup-shaped cotyledon)基因(Souer et al. , 1996; Aida et al. , 1997)。NAC转录因子在多个生长发育和胁迫应答过程中发挥着重要作用，已成为当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点(Olsen et al. , 2005a; Zheng et al.，2009)。目前发现，拟南芥中至少包含107个NAC基因(Riechmann et al.，2000)，而水稻(Oryza sativa)中含有140个(Fang et al.，2008)。根据N端保守序列的相似程度,Ooka等(2003)将拟南芥以及水稻全部NAC蛋白分为2个大类(I和II)，各包含14和4个亚类。同一亚类基因的功能往往相似，例如ATAF亚类中的大多数NAC基因都与植物响应环境胁迫有关(Delessert et al. , 2005; Jensen et al.，2007)。当然，应用不同的算法和软件得到的NAC基因进化树会存在差异。最近发现烟草(Nicotiana tabacum)中也包含152个NAC基因(Rushton et al.，2008)。Paul等将之与拟南芥、水稻、大豆(Glycine max)和番爺(Lycopersicon esculentum)等多种植物的NAC基因汇集到一起,作了更为广泛的进化关系分析，认为NAC基因家族包含7个亚家族，其中6个亚家族为各科植物所共有，而另ー个家族为茄科所特有，命名为 TNACS (tobacco NAC genes) (Rushton et al. 2008)。TNACS 蛋白在N端保守区域与其它亚家族存在明显的差异，目前还不知道这种结构上的差异是否意味着功能的变化(Rushton et al.，2008)。随着各类NAC基因序列信息的不断丰富，更广泛的聚类分析将可能为我们带来新的发现。熊立仲等人通过生物信息学研究分析发现，水稻中含有138个NAC基因。通过将水稻中NAC转录因子家族的基因进行进化树分析，发现水稻NAC基因家族分为5个亚家族。亚家族I包含54个水稻NAC基因，所有已报道的与发育相关的NAC转录因子都包含在亚家族I中；亚家族II也含有54个NAC基因序列，到目前为止还没有亚家族II中的基因被报道；亚家族III含有14个NAC基因，所有已发表的胁迫相关的NAC基因都包含在这个亚家族中，如来自水稻的SNACl和0sNAC6基因，来源于拟南芥的ANAC019、ANAC055和ANAC072基因，来自西红柿的 StNAC 基因，烟草中的 TERN (GenBank accession number: AB021178)基因也包含在这个亚家族中；亚家族IV含有14个水稻NAC基因；亚家族V含有2个水稻NAC基因，已报道的烟草中的SENU5基因也包含在这个群体中(Yujie Fang et al. , Mol GenetGenomics (2008) 280:547 - 563)。根据已报道的文献，本发明所提供的KT632基因即为水稻基因0NAC028，其基因ID是 L0C_0s02g34970。根据进化树分析結果，KT632 (0NAC028, L0C_0s02g34970)基因属于亚家族II群体。应用实时定量PCR技术分析水稻各NAC基因的组织特异表达特性和逆境诱导表达特性，结果发现KT632基因受干旱和盐胁迫的诱导，但是不受冷胁迫的诱导(YujieFang et al. ,Mol Genet Genomics (2008) 280:547 - 563)。目前为止，还没有关于 KT632基因是ー个组成型表达基因的报道。本发明通过实验分析，发现KT632 (0NAC028，L0C_0s02g34970)基因自翻译起始位点ATG往上-IOOObp的启动子片段KT632P，呈现出很强的组成型表达特性，在KT632P转基因水稻中，其所驱动的报告基因GUS在转基因水稻的根、茎、叶和花等器官中都表现出很强的表达水平，这些数据充分表明KT632P为ー个很强的组成型表达启动子。

发明内容
本发明提供了一个能在植物各组织器官中驱动组成型表达的启动子核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。在一些实施方式中，包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括SEQ ID No 1的启动子，以产生表达盒；和(b)生成含有该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。本发明所提供的组成型表达启动子，含有序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列，还包含与SEQ ID No :1中所列核苷酸序列至少具有95%相似性的核苷酸序列，可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物各器官中的组成型表达。本发明启动子为水稻0NAC028基因的启动子序列，0NAC028基因的编码区序列如SEQ ID No :2所示，其基因组DNA序列如SEQ ID No 3 所示。实施方案中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本文所列的完整KT632P启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括(但不限干)水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜猜、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黒麦(Rye)、粟、蜀黍、小黒麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘鹿、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖_、薯蓣、观赏植物和松类等。本文中“启动子” ー词指DNA调控序列，其中通常含有ー个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，、本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。本文中的“组成型表达”是指目的基因在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达或变化很小这类基因的表达方式。本发明所提供的KT632P启动子就是ー个在植物的各个发育阶段的根、茎、叶和花等组织器官中都有较强表达的组成型启动子。启动子的活性和強度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(importer gene)是ー种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是ー个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。本发明通过⑶S报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据⑶S基因检测所用的底物不同，有三种检测方法组织化学法、分光光度法和荧光法(灵敏度为分光光度检测法最高)，其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了 GUS基因，并表达出了 GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化ニ聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有⑶S表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的強弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情況。本发明的实施案例中也包括DNA载体，该载体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子，该启动子含有本发明公开的序列，并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述DNA载体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列ΚΤ632Ρ操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。本文所公开的ΚΤ632Ρ植物组成型表达启动子及其变异体和片段可用于植物基因工程，例如制备转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可単独或与重组DNA载体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。
“转基因事件”通过以下步骤获得，使用外源DNA载体(含有核酸表达盒，其中含有本发明所提供的启动子序列)转化植物细胞，用基因组插入了外源DNA构建体的植物细胞再培养获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上，“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源DNA的后代。本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的功能基因(编 码目的蛋白)。实施方案中的功能基因包括參与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等，持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剤)等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是提高植物对除草剂的抗性，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达。其中根据RNA干扰技术(RNA interference, RNAi ),操作性连接于本文所公开的KT632P启动子上的异源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链DNA分子。当导入到植物细胞中后，反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源mRNA互补，并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。下面通过具体实施方式
，结合附图对本发明做进ー步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。


图I是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的启动子；Tnos表不nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；BamHI和EcoRI分别表示限制性内切酶BamHI和EcoRI的酶切位点；启动子即为本发明所分离鉴定的组成型表达启动子。图2是KT632P转基因水稻的组织器官⑶S染色。愈伤、叶片、茎、根、颖壳和花等分别表示水稻各组织器官的染色結果。图3是KT632P转基因水稻干旱处理后的⑶S染色分析。其中A为正常生长的叶片染色为干旱处理后的叶片染色；C为干旱处理后的茎染色；D为正常生长的根染色；E为干旱处理后的根染色。图4为KT632P转基因水稻盐处理后的⑶S染色分析。其中A为正常生长的叶片染色；B为盐处理后的叶片染色；0为正常生长的莖染色；D为盐处理后的莖染色；E为正常生长的根染色；F为盐处理后的根 染色。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-ΤΙ连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自PiOmega公司，方法均參照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。I.启动子KT632P的分离和鉴定 设计克隆启动子KT632P所需引物
引物 I :5’_ ggatccATACAACAGGAGGACAACATCTGG _3’
引物 2 :5’- gaattcGCTACAACTACAAGTGCAACTTACAA _3’
引物I中序列ggatcc为BamHI的酶切位点，引物2中序列gaattc为EcoRI的酶切位点。利用启动子的正反向引物(其中带下划线部分的序列为启动子序列，如Seq IDNO: I所示)，以植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是95°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-ΤΙ，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明所扩增序列为预期的KT632P启动子序列。2.构建表达载体
将测序验证已经插入KT632P启动子序列的质粒用BamHI和EcoRI双酶切，连入同样用BamHI和EcoRI双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为PHPG-KT632P。所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图I所示，其中LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表不潮霉素抗性基因；Pnos表不nos基因的启动子；Tnos表不nos基因的终止子{US表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的终止子；BamHI和EcoRI分别表示限制性内切酶BamHI和EcoRI的酶切位点；启动子即为本发明通过PCR克隆出的组成型表达启动子。3.农杆菌共转化
利用热激法将质粒PHPG-KT632P转入农杆菌AGLO菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行
共转化。4.功能鉴定从转基因植株中分离各组织器官，进行⑶S活性检测，将各组织器官置于含有⑶S染色缓冲液的EP管中，放于37°C温箱温育过夜，然后室温条件下在无水こ醇中脱色保存。4. I转基因水稻苗的组织器官染色
将转化KT632P启动子得到的具有潮霉素抗性的水稻愈伤组织，进行GUS染色实验，结果如图2愈伤所示，抗性愈伤呈现出很强的蓝色，说明本发明启动子启动了 GUS基因在愈伤中的強烈表达。将水稻KT632P转基因水稻苗的组织器官，如叶片、茎、根、颖壳和花分别进行⑶S染色，结果如图2所示，GUS基因在植株的各种组织器官中都有很强的表达，显现出很强的蓝色，说明本发明启动子启动了其所驱动的报告基因GUS在转基因水稻的各种组织器官中 的表达。4. 2 KT632P转基因水稻苗的干旱处理染色
为了检测干旱逆境对本发明启动子KT632P的启动活性的影响，我们将其转基因水稻苗用20%的PEG6000处理了 90分钟，此时植株叶片呈现干旱胁迫后的轻度卷曲状态，剪取其各组织器官如根、茎、叶等分别进行染色，并以正常生长的植株为对照，检测其干旱处理后的表达活性的变化。结果如图3所示，其干旱处理后的叶片、根和茎与对照相比，表达变化很微弱，均表现出很强的表达活性，说明其启动子活性不受干旱胁迫的影响。4. 3 KT632P转基因水稻苗的盐处理染色
为了检测高盐逆境对本发明启动子KT632P的启动活性的影响，我们将其转基因水稻苗用200mM的NaCl处理了 90分钟，再剪取其各组织器官如根、茎、叶等分别进行染色，并以正常生长的植株为对照，检测盐处理后的表达活性的变化。结果如图3所示，其盐处理后的叶片、根和茎与对照相比，表达基本没有变化，均表现出很强的表达活性，说明其启动子活性不受盐胁迫的影响。
权利要求
1.一种转化的植物细胞，其特征是含有一种启动子核酸分子，所述启动子核酸分子具有SEQ ID NO 1所示的序列，或是具有选自SEQ ID NO 1的至少40个连续核苷酸的序列，或是其互补链的核酸序列。
2.权利要求I所述转化的植物细胞，其中所含的启动子核酸分子可与异源核苷酸序列操作性相连。
3.权利要求2所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列指天然状态下没有与所述启动子序列操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源或是异源的。
4.权利要求2或3所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列编码的基因产物可赋予植物对除草剂、盐、低温、干旱、病原体或昆虫的抗性，或是调控植物的生长发育。
5.权利要求2或3所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列为靶基因的部分同源序列，以RNA干扰技术的方式抑制植物内源或外源基因的表达。
6.权利要求I所述转化的植物细胞，其中所述转化的植物细胞来自单子叶植物。
7.权利要求6所述转化的植物细胞，其中所述单子叶植物细胞来自禾本科植物，优选为水稻。
8.权利要求I所述转化的植物细胞，其中所述转基因植物细胞来自双子叶植物。
9.权利要求8所述转化的植物细胞，其中所述双子叶植物细胞来自十字花科，优选为拟南芥。
10.一种在植物中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子含有的核苷酸序列选自 a)SEQ ID NO 1所示的启动子核苷酸序列； b)与SEQID NO :1所示序列至少有95%序列相似性的启动子核苷酸序列,其中所述启动子核苷酸序列可以在植物中驱动异源核苷酸呈组成型表达； c)SEQID NO :1中所示的至少40个连续核苷酸序列，且表现出组成型表达特性。
11.一种核酸分子，其中所述核酸分子选自 a)SEQ ID NO :1所示的启动子核苷酸序列； b)与SEQID NO :1所示序列至少有95%序列相似性的启动子核苷酸序列,其中所述启动子核苷酸序列可以在植物中驱动异源核苷酸呈组成型表达； c)SEQ ID NO 1中所示的至少40个连续核苷酸序列，且表现出组成型表达特性。
12.—种载体，它含有权利要求11所述的核酸分子。
13.—种细胞，它含有权利要求12所述的载体。
14.权利要求13所述细胞，其中所述细胞包括细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或真菌细胞。
15.权利要求14所述细胞，其中所述细菌细胞来自根癌土壤杆菌或大肠杆菌。
16.权利要求13的细胞，其中所述植物细胞为水稻细胞。
全文摘要
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一个水稻组成型表达启动子KT632P的功能鉴定和应用。本发明所公开的KT632基因为一个水稻NAC类转录因子家族基因，其启动子在植物的根、茎、叶和花等组织器官中都有很强的表达，在各种非生物逆境处理条件下也具有很强的表达活性，在植物转基因领域具有很好的应用前景。
文档编号C12N1/15GK102676458SQ20121015293
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2011年6月2日
发明者吴洁芳, 周君莉, 李早霞 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司