专利名称：一个在大肠杆菌中组成型表达的启动子及其在大肠杆菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个可以在大肠杆菌中进行组成型表达的启动子的方法，属于 基因表达技术的研究领域，本发明涉及进一步利用这种启动子进行基因的表达 和有用蛋白的工业表达生产的方法。
背景技术：
基因表达技术是基因工程技术的核心技术，克隆基因表达出所编码的蛋白 质可进行结构与功能的研究，有些在医学上、以至在工业上都是很有应用价值 的具有特定生物活性的蛋白质，可以通过克隆其基因进行人工控制其表达，实 现大量低成本获得目的基因的蛋白质。克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表 达，至今，人们已建立了许多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也 有真核生物基因表达系统，可用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养 的哺乳类动物细胞、以至整体动物。其中大肠杆菌表达系统是基因表达技术中 发展最早，研究最广，应用最广泛的表达系统。大肠杆菌培养操作简单、生长 繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌研究背景清楚，用于外源基因的表达工具 已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因
表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%，因此大肠杆菌 是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
在原核生物中启动子是位于结构基因5端上游，与DNA依赖的RNA聚合酶相结合的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录转录出目标基因的mRNA。以表达目的基因为 目的的基因表达系统是由载体系统和宿主系统组成，而启动子是基因工程表达 载体的重要元件，启动子对外源基因的表达水平影响很大，对研究基因的表达 调控和构建表达载体至关重要。随着基因工程的发展，常常需要构建能高水平 表达异源蛋白质的表达系统，同时其调控方式简单，操作成本低。理想的启动 子具有以下特性作用强；容易调控；容易转导入其他以便筛选大量的 用于生产蛋白的菌株；而且对其诱导是简便和廉价的。
能在五.co//中发挥作用的启动子很多，根据调控的方式不同可以把启动子 分成组成型表达启动子和诱导表达启动子。诱导调控型的启动子只有在诱导剂 存在的条件下才能表达目的产物，这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对 菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒 蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导 表达的，也属于诱导表达系统。目前大肠杆菌最常用的启动子是化学诱导启动 子(Plac，P印)和热诱导启动子U尸L)，利用异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG) 为化学诱导物的杂交启动子toc或frr都是强启动子。虽然化学诱导的启动在调 控性非常容易操作，但是作为诱导剂的IPTG本身具有毒性而且价格昂贵，因 而不适合用于大规模工业的应用或者用于大量生产人用治疗性蛋白，所以大多 应用于基础研究中。热诱导(入户L)启动子是由于编码热敏阻遏蛋白的突 变(Ts)基因的出现使得目前能够对这些启动子进行热诱导。热诱导(入 户L)启动子的调控依赖于突变/^/的菌株，尽管野生型/^/基因也能热诱导， 但不能对其进行严紧型调节，且不能用于/ac/q菌株，因为温度的变化不能遏制由阻遏蛋白的过量表达所造成的严紧性抑制，因此，该系统只能用于生 产对宿主菌无害的一些蛋白。温度诱导型启动子存在不利于在大规模工业表达 的缺点，如在大型发酵罐进行温度的的快速转换存在很大的困难，从而影响到 诱导表达的效果，此外在高于菌体的最适生长温度条件下进行诱导容易使表达 产物形成没有活力的包涵体，同时由于在高温条件下容易激活宿主内的蛋白酶 降解表达的目的蛋白，从而不利于表达产物的积累。在大肠杆菌表达系统中还
广泛应用T7启动子，T7启动子本身不是属于化学调控，而是受T7RNA聚合 酶调控的，但T7表达系统的T7 RNA聚合酶调控又是受Plac启动子的化学调 控，所以在实际超过过程还是利用IPTG进行化学诱导的，所以大肠杆菌的T7 表达系统也是属于化学诱导的表达系统。
组成型表达启动子也就是一直不停表达目的蛋白的启动子，利用这类型的 启动子可以构建组成型表达系统，如pMAL系统。组成型表达持续性表达通常 表达量比较高，而且不需要添加诱导剂在工业规模表达目的基因时可以减少生 产成本，还可以避免表达药物蛋白不能加入有毒的IPTG诱导剂，因而组成型 表达系统被认为是工业表达有用蛋白的理想启动子。
发明内容
本发明的目的在于提供一个在大肠杆菌中组成型表达的启动子及其在大肠 杆菌中的应用，该启动子能够在不需要添加诱导剂的条件下实现外源基因在大 肠杆菌中的高水平表达。
本发明是这样实现的，通过提取土壤微生物总DNA构建宏基因组文库，然 后对文库进行随机测序获得大量的DNA序列，再将获得的大量DNA序列放到启 动子的预测分析网站http:〃www. fruitfly. org/seq—tools/promoter, html进行启动子的预测分析，同时结合利用Vector NTI软件进行分析，得到可能为启 动子的DNA序列。
所述启动子的DNA序列它具有
SEQ ID NO. 1的信息
序列信息NO.:l
序列长度51碱基对
序列类型核酸
链型双链
拓朴学线性
分子类型基因组DNA
假设的NO 反义的NO
来源土壤未培养微生物
序歹(J: aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
其全部序列或者部分序列具有在大肠杆菌中启动子转录活性。 其全部序列的连续或者非连续序列具有在大肠杆菌中启动子转录活性。 其突变体和变异体具有在大肠杆菌中启动子转录活性。 在大肠杆菌中组成型表达的启动子的应用，是将该启动子用于构建表达载 体，然后转化到大肠杆菌中高水平表达。
在大肠杆菌中组成型表达的启动子的应用，是将外源基因连接到该启动子 的下游，然后引导外源基因导入大肠杆菌驱动外源基因的高水平表达。
能在大肠杆菌中组成型表达的启动子，其表达宿主包含大肠杆菌所有的菌株。
由于构建文库的DNA来源于土壤未培养微生物，因此需要对获得可能为启 动子的DNA序列进行同源性的分析，从而确定其可能的来源。分析的方法把序 列放到http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi即NCBI数据库中进行同源 性检索分析，把同源性较低的序列确定候选的启动子DNA序列，然后再进行基 因大肠杆菌表达实验以确定该启动子在大肠杆菌具有组成型转录活性。
本发明的有益效果和突出的实质性特点在于
1、 本发明提供的启动子的DNA序列在NCBI数据库同源检索分析，在 Highly similar sequences的检索项中检索不到和本序列高度同源的序列，表 明本启动子DNA是一个新的DNA序列。
2、 本发明提供的启动子能在大肠杆菌中组成型表达，不需要添加任何化学 诱导物，也不需要物理条件的诱导就可以实现高水平表达。
3、 本发明提供的启动子能应用与表达外源基因，能够应用于构建组成型表 达载体导入大肠杆菌种进行表达。
4、本发明的目的提供一种启动的序列，具有全部或部分活性的DNA序列， 包含这样启动子序列的载体，和被这种启动子转化了的宿主细胞，利用这样重 组细胞生产重组蛋白的方法。
由于本发明启动子的序列来源于未培养微生物的宏基因组文库，其真正来 源宿主不能确定，因此本说明书所述的外源基因，也是指目的基因，没有特定 的指定来源的指定，可以包括编码蛋白质的基因的DNA序列，也包括编码核酸 酶和反义核酸的DNA序列，其来源可以是真核的，也可以是原核的，也可以是人工合成的核酸序列。
图1是本发明所述的在大肠杆菌中组成型表达7力e7m &'AVs/mcs淀粉酶 基因和对照相比的SDS-PAGE电泳分析图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作详细描述
在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(五^/zeWc/h'aco")菌株， 载体pMD18-T Vector克隆载体购自TaKaRA;限制性内切酶、修饰酶等试剂等 购自TaKaRA、 MBI; Sac/〃w//c/2em/o，&菌株购买于工业菌种保藏中心。 1.预测和筛选候选启动子DNA序列
土壤未培养微生物的宏基因组文库包含大量未知的DNA序列，本发明人构 建的土壤未培养微生物宏基因组文库经过随机测序获得了大量新的DNA序列， 在这些序列中有可能存在我们需要的目的启动子DNA序列，通过预测和实验研 究就可能找到我们需要的启动子DNA序列。通常原核生物的启动子的大小都在 100 bp以下，因此要从大量的序列找出启动子序列是首先要经过预测分析，然 后再进性转录活性的研究分析才能获得目的启动子。首先把随机测序获得的DNA 序列放到http: //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html进行启动子的 预测分析，该网站预测分析是通过得分高低的形式提供获得一些可能为启动子 的DNA序列，但是不能保证这些序列就是我们需要的启动子序列，还需要进行 转录实验的证实。为了保证我们研究的启动子是新的DNA序列，需要将上面预 测分析得到的启动子序列放到http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi上 进行同源性检索分析以排除同源性高的序列，把检索不到的或者同源性很低的启动子作为候选的目的启动子来进行下一步的实验验证。 2、 5acz7/w //c/zem/om^淀粉酶基因表达载体的构建
以Sa"7/m //ctem/onT^淀粉基因BLA来检测启动子的转录活性，根据 Genbank登记号为AY630336的BLA基因序列设计以下引物
A: 5 -aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctcatgaaacaacaaaaacg-3 B: 5- atgaaaca3caaa犯cggc-3 C: 5-ctatctttgaacataaattg-3
引物A和B都是BLA基因的上游引物，引物B没有启动子的序列作为对照， 而为了把要表达的BLA基因连接到待检测启动子的下游，在引物A的5'端设计 启动子序列aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc， 引物C为基因 的下游引物。提取Sflcz7/us //ctem/orm^总DNA为模版，采用Taq酶以引物A 和B来BLA基因，利用AT连接法与pMD18-T Vector克隆载体连接，用CaC12 法将连接产物转化到大肠杆菌JM109中，筛选得到BLA基因的重组子即为BLA 基因的表达载体用于检测启动子的转录活性；同样方法以引物B和引物C同样 方法扩增BLA基因连接到pMD18-T Vector克隆载体上用于检测转录活性的对 昭。
本发明是经过对许多由步骤1预测分析获得的候选启动子序列进行转录活 性的研究分析才获得的，本发明所陈述的实施方法仅仅是对获得本发明启动子 序列实验过程的陈述，仅对一个序列而不包括对其它候选启动子转录活性的转 录活性研究过程的陈述。 获得的启动子DNA序列
aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
3、 BLA基因的表达和检测
10将步骤2构建的表达载体和对照载体同时导入大肠杆菌菌株JM109和BL21 获得重组菌株，然后分别接种到20ml含100 ii gZml氨苄青霉素的LB培养基中， 37°C， 220rpm振荡培养12个小时。11000rpm离心3min，收集菌体，用4ml， pH7. 0 ， 100腿的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9min， 12000rpm离心10min 得到上清就是淀粉的粗酶液用于检测淀粉酶的活力。
酶活测定方法取1%， pH7. O可溶性淀粉溶液lml，，于80。C下水浴预热10min 后，加入粗酶液1 ml精确反应10 min后，用2ml 0.1 mol/l盐酸终止反应，再取 0. 2ml混合液体于盛有2ml碘液的试管中，摇匀，并立即用分光光度计于660nm处 测定吸光度。用同样方法测定空白值，但不加酶液,而代之以1.0 ml的蒸馏水， 作为空白对照液。酶活定义 一个淀粉酶单位相当于在8(TC、pH7. O条件下，lmin 将1%淀粉溶液的显蓝强度降低1%时所需酶量。酶活=[(DO - D) X 100 Z DOX 10 ] X稀释倍数，DO为空白值吸光度，D为主值吸光度，100为系数(％)， IO为反应时 间(min)。
经过淀粉酶活力的检测，带有启动子序列的BLA基因表达载体在大肠杆菌 菌株的活力JM109是431 U/ml，在菌株BL21的活力是621 U/ml，而不带有 启动子序列的对照载体没有检测到淀粉酶活力活力。
实验结果表明该启动子序列在大肠杆菌的不同菌株都具有转录活性，而且 不需要添加化学诱导剂，也不需要进行物理条件的诱导，是一种组成型表达的 启动子。
4 、 T7^rwoZ)zy^ayksca淀粉酶基因的表达
为了研究启动子对其它基因是否具有同样的转录活性，根据Genbank上登 记号为DQ473479的rterwo&yWa/wca淀粉酶基因的序列设计以下引物
Sense Primer: 5- aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctcatg gcg ccg tea ggc aac-3，Antisense Primer: 5國tcagcgccaggagtcgta-3
采用与步骤3，步骤4同样的方法将MeiT^/^/jVa /k ca淀粉酶基因连接 到目的启动子的下游构建表达载体，然后导入大肠杆菌进行表达。重组菌株分 别接种到20ml含100pg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C， 220rpm振荡培 养12个小时。然后11000rpm离心lmin，收集菌体，用SDS-PAGE电泳检测 7%e2m^j'/_2Va /kscs淀粉酶基因的表达。
经过SDSPAGE电泳分析，和对照相比，根据泳道2所表达的蛋白质特征条 带表明，连接在启动子下游的7力ei7^Zu'/i^/lAsw淀粉酶基因得到很好的表达。
实验结果再次表明我们获得的启动子序列在大肠杆菌中具有转录活性，能 够表达不同的基因，而且不需要添加化学诱导剂，也不需要进行物理条件的诱 导，是一种组成型表达的启动子。
所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明。
12序列表
1、 SEQ ID NO. 1
(1)序列特征
a. 长度51碱基对
b. 类型核酸 C.链型双链 d.拓朴学线形
(2) 分子类型基因组DNA
(3) 序列描述 aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc
权利要求
1、一个能在大肠杆菌中组成型表达的启动子Pinv的DNA，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1的信息序列信息NO.1序列长度51碱基对序列类型核酸链型双链拓朴学线性分子类型基因组DNA假设的NO反义的NO来源土壤未培养微生物序列aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc。
2、 如权利要求l所述的DNA，其特征在于，其全部序列或者部分序列 具有在大肠杆菌中启动子转录活性。
3、 如权利要求l所述的DNA，其特征在于，其全部序列的连续或者非 连续序列具有在大肠杆菌中启动子转录活性。
4、 如权利要求l所述的DNA，其特征在于，其突变体和变异体具有在大 肠杆菌中启动子转录活性。
5、 如权利要求1所述的能在大肠杆菌中组成型表达的启动子的应用，其特征在于将该启动子用于构建表达载体，然后转化到大肠杆菌中高水平表达。
6、 如权利要求l所述的能在大肠杆菌中组成型表达的启动子的应用，其特 征在于将外源基因连接到该启动子的下游，然后引导外源基因导入大肠杆菌驱 动外源基因的高水平表达。
7、 如权利要求5或权利6所述的能在大肠杆菌中组成型表达的启动子的应 用，其特征在于，其表达宿主包含大肠杆菌所有的菌株。
全文摘要
一个能在大肠杆菌中组成型表达的启动子Pinv的DNA，它具有SEQ ID NO.1的信息，其序列信息为NO.1，序列长度为51碱基对，序列类型为核酸，链型为双链，拓朴学为线性，分子类型为基因组DNA，假设的为NO，反义的为NO，来源为土壤未培养微生物，序列为aacattgaggcaacgacaaggtcgattctgctatccttgaggaggctcctc。该启动子在不需要化学和物理条件的诱导就能够实现外源基因在大肠杆菌中高水平表达。获得的启动子可以用于外源基因在大肠杆菌的表达，用于有用蛋白的生产。
文档编号C12R1/00GK101560516SQ20091011382
公开日2009年10月21日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者杜丽琴, 韦宇拓, 黄日波 申请人:广西大学