专利名称：一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法
技术领域：
本发明涉及改造大肠杆菌染色体基因使之作为外源蛋白生产的细胞工厂，确切地说是一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法。
背景技术：
重组蛋白药物市场增长迅猛，已成为一个巨大的高新技术产业。其中重要的重组蛋白药物有细胞因子，蛋白类激素，酶和抗体等。但因这些药物生产成本高，找到高效低成本的生物系统与生产工艺尤为必要。重组蛋白的生产通常使用微生物系统。微生物系统具有生长快与成本低的优点。 大肠杆菌是使用最广泛的微生物系统。在大肠杆菌系统中，根据重组蛋白表达后的空间定位，可分为胞内表达与胞外表达。胞外表达正常情况下为可溶性产物。胞内表达又可分为胞质中表达与周质空间表达，且常形成包涵体。胞外表达与周质空间表达的蛋白较少受到蛋白酶的降解，有利于目标产物的积累。大肠杆菌有多种转运系统将蛋白分泌至周质空间，最常用的是Sec系统。但大肠杆菌缺乏天然的胞外分泌机制，绝大多数外源蛋白无法分泌到胞外。胞内重组蛋白药物常规生产工艺包括菌株构建、发酵、破壁、蛋白分离与精制。但因胞内杂蛋白成分复杂、易形成无活性的包涵体，因而分离成本高、产率低。特别是胞内表达需要破碎细胞，而导致产品中存在磷脂多醇与蛋白复合物等热原成份，严重影响药品生产。因此，一种通用、高产、简便和高效而稳定的生产体系亟待建立。目前，仅少量文献报道了大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法。且多为理化诱变的方法，可以筛选到胞外高产突变株，但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，遗传性改造可使大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌的细胞外膜缺陷，导致周质空间蛋白部分释放到培养基中。使用渗漏菌株进行胞外蛋白的生产鲜有报道。如大肠杆菌的T/7/7基因突变体可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中，但目标蛋白的渗漏比率及其产量仍然有提闻的空间。
发明内容
本发明提供一种大肠杆菌重组蛋白的发酵和胞外分泌同时进行的重组蛋白生产方法，通过遗传改造的方法得到细胞壁或膜的通透性增强的分泌型菌株，并将胞内合成的目标蛋白质通过信号肽或融合蛋白(如硫氧还蛋白等)导入到细胞周质空间，进而选择性地渗漏至培养基中，提高表达水平和降低分离成本成为本发明的目的。—种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；
所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建方法为使用预先设计的细胞膜蛋白或细胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一种单基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的浓度为 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中饱一种基因打靶片段，并整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到分泌型大肠杆菌菌株。所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株含有的基因/^7编码区发生了突变，或者基因的启动子区域发生了突变，从而使/^7基因无法表达出相应的Pal蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒中，随后克隆到该分泌型大肠杆菌中，进而得到分泌型重组大肠杆菌菌株。所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信 号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于所述的发酵培养基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4。本发明的原理为
本发明所说的大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法，主要包括构建特定的细胞膜或细胞壁改变的分泌型重组大肠杆菌生产菌株和在发酵培养基中使用该特定生产菌株胞外生产外源蛋白。其特征在于，使用预先设计的/^7基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的高浓度(10 1000ng/H)pal基因打靶片段。并将其作为突变工具电转化导入到经过诱导的含PKD46的待突变大肠杆菌出发菌株中，从而实现/^7基因的突变。其中所说的细胞膜或细胞壁改变的分泌型重组大肠杆菌生产菌株指'pal, mrCA,mrcB, mrdA, rodA, murC, rodZ等基因编码区的核苷酸缺失或替换；或在基因的启动子区域的核苷酸缺失或替换的突变菌株。优选和基因突变。集成化方法指的是将各技术整合在一起。本发明的有益效果
I、本发明提供了大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的一种新途径，并提高了目标蛋白的渗漏比率和产量。2、本发明实现了重组蛋白发酵和胞外分泌同时进行。在发酵过程中，重组目标蛋白可以从胞内渗漏且不显著影响菌体的持续生长，降低了目标蛋白的胞内降解，提高了重组蛋白表达；同时减少了重组蛋白的胞内过度积累，而降低了包涵体形成；消除了细胞破壁工艺，减少了热原污染；设计培养基组成，便于分离纯化，进而达到降低了生产成本，提高产品质量的目的。渗漏不仅简化了纯化重组蛋白的工艺，也提高了目标产物的表达水平。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。3、本发明采用大肠杆菌的或fflrcS等基因突变株为宿主和定位于周质空间的重组蛋白质粒，使得重组蛋白的发酵和胞外分泌同时进行。从而实现降低目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少重组蛋白的胞内过度积累，而降低包涵体形成；消除细胞破壁工艺，减少热原污染，方便分离纯化；进而达到降低生产成本，提高产品表达及质量的目的。经检测,超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。
图I为单基因敲除突变株目标蛋白表达SDS-PAGE结果，其目标蛋白重组硫氧还人甲状旁腺激素融合蛋白；泳道1-7为胞外蛋白，泳道8-14为胞内蛋白，M为标准蛋白)。泳道I为阳性对照；泳道2为pal基因突变株(实施例I);泳道3-5为基因突变株(实施例2);泳道6-7为阴性对照；泳道8为阳性对照；泳道9为pal基因突变株(实施例I)；泳道10-12为《TM基因突变株(实施例2);泳道13-14为阴性对照。
具体实施例方式本发明所说的大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、大肠杆菌基因突变的分泌型菌株构建
(1)使用预先设计的特定基因敲除引物，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，称为pa/基因打靶片段。打靶片段两端为10 250 bp(优选30 100 bp)的/^7基因同源序列，中间为氯霉素抗性标记序列。将其使用PCR产物纯化试剂盒得到高浓度10 1000 ng/μ (优选100 500 ng/H)pal基因打靶片段；
(2)利用I 100mmol/L (优选5 20 mmol/L)的L-阿拉伯糖诱导含敲除辅助质粒PKD46的大肠杆菌出发菌株O. 2 10 h (优选I 3 h)，再将诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将纯化后的高浓度/^7基因打靶片段电转化导入所得的诱导后的大肠杆菌出发菌株的电转化感受态细胞之中，在含O. 5 50 mmol/L (优选2 25 mmol/L)的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复O. 2 20 h，使用抗性LB固体培养基筛选发生同源重组的突变菌株，并使用PCR法和测序法确定/7^7基因区域发生正确的替换突变后，即得基因突变菌株。具体步骤请参考文献(Datsenko and Wanner 2000 )。B、产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株构建
将合成的人甲状旁腺激素hPTH的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒m^-pthH,转化到基因突变菌株得到分泌型重组菌株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株先使用含5 500 μδ/πι1 (优选25 100Kg/ml)的Amp的LB固体培养基活化该工程菌株，3 72 h (优选12 36 h)后挑单菌落接种到带有3 300 ml (优选10 50 ml)的含5 500 μδ/πι1 (优选10 200 Pg/ml)的Amp的LB种子培养基的250 ml摇瓶中，在温度20 45°C (优选30 42°C )，转速50 500 rpm (优选150 300 rpm)的条件下培养3 72 h (优选12 36 h)，再将O. I 10ml(优选0. 5 5 ml)的该菌液接种到带有3 300 ml (优选10 50 ml)含5 500 μδ/ml (优选10 200 μδ/πι1)的Amp的TB液体发酵培养基的250 ml摇瓶中，当培养基中菌体浓度达到在OD600为O. 05 I. 8 (优选O. 2 O. 8)时加入终浓度为O. 05 5 mmol (优选O. 2 O. 8 mmol)的IPTG，诱导发酵I 24 h (优选2 12 h)后终止发酵。得到发酵液于常温下离心分离，收集上清液即得重组蛋白粗提物。其中所说的种子培养基为0. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及O. 05 5%NaCl ；
发酵培养基为0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4 ；
固体培养基为0. 5 5%的琼脂，O. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及
0.05 5%NaCl。
本发明采用/^7基因突变的大肠杆菌作为外源蛋白质宿主菌株，定位于周质空间的载体作为重组目标蛋白表达质粒。所用原料均为市售品。本发明实现了重组蛋白发酵和胞外分泌同时进行。在发酵过程中，重组目标蛋白可以从胞内渗漏且不显著影响菌体的持续生长，降低了目标蛋白的胞内降解，提高了重组蛋白表达；同时减少了重组蛋白的胞内过度积累，而降低了包涵体形成；消除了细胞破壁工艺，减少了热原污染；设计培养基组成，便于分离纯化，进而达到降低了生产成本，提高产品质量的目的。渗漏不仅简化了纯化重组蛋白的工艺，也提高了目标产物的表达水平。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%。下面结合实施例对本发明作进一步阐述，其目的是更好理解本发明内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明匀采用如下材料
I)菌种
宿主为Escherichia coli JM109 (DE3),敲除辅助质粒pKD46,抗性标记基因质粒pKD3和pKD4，抗性标记基因剔除质粒pCP20。pal基因敲除引物palH+PF和palH+PR，pal基因鉴定引物PalTl和palT2。2)培养基
种子培养基1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
发酵培养基1. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取粉，O. 5%甘油，O. 231%KH2P04，
1.254%K2HP04 ；
固体培养基1. 5%的琼脂，1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
SOC 培养基2% 胰蛋白胨，O. 5% 酵母提取粉，O. 05%NaCl，2. 5 mM KCl 10 mM MgCl2, 20
mM葡萄糖。所用试剂均为市售品。
实施例I
一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建，即大肠杆菌基因突变的分泌型菌株构建包括以下步骤
(I)使用预先设计的/基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50 bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20 ng/μ 的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2 h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
B、产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株构建
将合成的人甲状旁腺激素hPTH的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a(+)中，得到重组质粒pET32a-A/7iA，转化到基因突变菌株中得到分泌型重组菌 株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο实施例2
一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、大肠杆菌基因突变的分泌型菌株构建包括以下步骤
Cl)使用预先设计的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性标记基因质粒PKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp ^nwcB基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物mrcBTl和mrcBT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
B、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建(产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株构建)
将合成的人甲状旁腺激素hPTH的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-A/7iA，转化到fflrM基因突变菌株中得到分泌型重组菌株，即产人甲状旁腺激素的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο实施例3
一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、单基因突变菌株的构建包括以下步骤
(1)使用预先设计的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2 h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变菌株；
B、产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株构建
将合成的B淋巴细胞刺激因子BLyS的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-67_^s，转化到pal基因突变菌株中得到分泌型重组菌株，即产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο实施例4
一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、大肠杆菌基因突变的分泌型菌株构建包括以下步骤(1)使用预先设计的fflrM基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性标记基因质粒PKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp ^nwcB基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并 使用鉴定引物mrcBTl和mrcBT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
B、产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株构建
将合成的B淋巴细胞刺激因子BLyS的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pET32a-67_^s，转化到fflrM基因突变菌株中得到分泌型重组菌株，即产B淋巴细胞刺激因子的分泌型重组菌株。C、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程(重组蛋白发酵)
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο实施例5
一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、单基因突变菌株的构建包括以下步骤
(1)使用预先设计的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性标记基因质粒pKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp的基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2 h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物PalTl和palT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变菌株；
B、产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株构建
将合成的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶SvOM的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a (+)中，得到重组质粒pETSZa-sra ，转化到pal基因突变菌株中得到分泌型重组菌株，即产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο实施例6 一种大肠杆菌渗漏发酵重组蛋白的方法，包括以下步骤
A、大肠杆菌基因突变的分泌型菌株构建包括以下步骤
Cl)使用预先设计的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性标记基因质粒PKD3为模板，进行聚合酶链式反应合成特定的PCR产物，得到基因打靶片段，打靶片段的两端为50bp ^nwcB基因同源序列，中间是氯霉素抗性标记序列，将所得的PCR产物使用PCR产物纯化试剂盒得到20ng/^l的纯化后的高浓度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖诱导含有敲除辅助质粒pKD46的大肠杆菌出发菌种JM109 (DE3) 2 h，再将所得的诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；
(3)将步骤(I)所得纯化后的高浓度的基因打靶片段导入步骤(2)所得的诱导后的菌液的电转化感受态细胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培养基恢复2h后，使用抗性平板筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物mrcBTl和mrcBT2进行PCR法和测序法确定基因区域发生替换突变后，即得基因突变的分泌型菌株；
B、产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株构建
将合成的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶SvOM的基因片断，测序正确后将其克隆到分泌型表达质粒pET32a(+)中，得到重组质粒ρΕΤ32α-5·ι· ,转化到基因突变菌株中得到分泌型重组菌株，即产咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的分泌型重组菌株。C、重组蛋白发酵
将得到的外源蛋白表达的分泌型重组菌株使用含50μ8/πι1的氨苄青霉素的LB平板活化该工程菌株，20 h后挑单菌落接种到带有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液体培养基的250ml摇瓶中，370C的200转摇床培养18 h，再将该菌液接种到带有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液体发酵培养基的250ml摇瓶中，使培养基菌体浓度保持在0D600为O. I左右，200转摇床培养8 h后加入终浓度为O. 5mmol的IPTG，诱导发酵4 h后终止发酵，取Iml发酵液作为样品，用于后续分析。结果将发酵液于4°C条件下以6000 rpm的速度离心lOmin，收集上清液即得重组蛋白粗提物。经检测，超过40%的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10 30%ο序列表
mrcB ,pal基因敲除引物
权利要求
1.一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程； 所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建方法为使用预先设计的细胞膜蛋白或细胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一种单基因敲除引物进行PCR反应，得到两端为10 250 bp特定目标基因同源序列及中间为氯霉素抗性标记序列的浓度为 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中饱一种基因打靶片段，并整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到分泌型大肠杆菌菌株。
2.根据权利要求I所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株含有的基因/^7编码区发生了突变，或者基因的启动子区域发生了突变，从而使/^7基因无法表达出相应的Pal蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。
3.根据权利要求I所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建方法为将外源目标蛋白质基因先重组到分泌型质粒中，随后克隆到该分泌型大肠杆菌中，进而得到分泌型重组大肠杆菌菌株。
4.根据权利要求I所述的一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株含有编码外源蛋白的重组基因质粒，该重组质粒中外源蛋白基因与定位于周质空间的信号肽编码序列相连，从而使胞内合成的外源蛋白通过信号肽导入于周质空间进而渗漏到培养基中。
5.根据权利要求I所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于所述的分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程指的是在发酵培养基中使用外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株生产外源蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的大肠杆菌构建方法，其特征在于所述的发酵培养基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% Κ2ΗΡ04。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌胞外生产外源蛋白的集成化方法，包括单基因突变的分泌型大肠杆菌的菌株构建、外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌的菌株构建及分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程。本发明采用大肠杆菌的pal或mrcB等基因突变株为宿主和定位于周质空间的重组蛋白质粒，使得重组蛋白的发酵和胞外分泌同时进行。从而实现降低目标蛋白的胞内降解，提高重组蛋白表达；同时减少重组蛋白的胞内过度积累，而降低包涵体形成；消除细胞破壁工艺，减少热原污染，方便分离纯化；进而达到降低生产成本，提高产品表达及质量的目的。经检测，超过40％的重组蛋白渗漏到培养基中，表达水平为10～30%。
文档编号C12R1/19GK102827904SQ201210287000
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者童望宇, 宋俊兰, 陈昭元 申请人:安徽大学