专利名称：一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及ー种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法。
背景技术：
转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的ー种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究領域的基本实验技木。受体细胞经过ー些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞，感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。通常有两种方法获得感受态细胞，一种是购于商业公司，这种感受态通常有较高的转化效率，每微克质粒DNA产生IO8个转化克隆的转化效率，但价格比较昂贵。另ー种方法是实验室自己制备，目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和Inoue法。CaCl2法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低；Inoue法虽然感受态细胞的转化效率较高，但细菌的培养条件是18°C，振荡19-50小时，摇菌的时间较长，并且过程相对繁琐。因而，研究ー种转化效率高、操作简单实用的感受态细胞制备方法，对于分子生物学的研究尤为必要。
发明内容
本发明的目的是提供ー种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，它是ー种转化效率高、方便快捷、重复性好的感受态细胞制备方法。本发明的大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，为将常规液体培养至对数生长期的大肠杆菌，在大肠杆菌的最适生长温度下(一般为37°C)振荡扩大培养至0D600为
O.4-0. 5左右，然后转入17-19°C，振荡培养O. 9-1. I小时，再离心收集菌体后，采用氯化钙法制备感受态细胞。具体的，本发明的大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法包括下列步骤I)从LB平板上挑选新活化的大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，37°C，振荡培养过夜；2)将步骤I获得的菌悬液接种于新鮮的LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下(一般为37°C )振荡培养至OD6tltl为O. 4-0. 5左右；3)将步骤2获得的菌悬液转入17_19°C，振荡培养O. 9-1. I小时；4)将步骤3获得的菌悬液加入无菌离心管中，冰浴后，冷冻离心收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；5)用无菌的O. 09-0. IlMCaCl2水溶液重悬步骤4离心分离的菌体后冰浴；6)将步骤5获得的重悬液冷冻离心再次收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀；7)再用无菌的O. 09-0. IlMCaCl2水溶液重悬步骤6离心分离的菌体，即得感受态细胞。步骤I中，长有新活化的大肠杆菌单菌落的LB平板可采用常规方法获得，如将大、肠杆菌贮存菌液在无抗生素的LB平板上划线，37°C过夜培养获得。 步骤1-3中，大肠杆菌振荡培养的转速可采用常规，如200_250rpm。步骤4-5中，冰浴的时间一般为8-12分钟。步骤4-5中，冷冻离心收集菌体的条件可采用常规，如温度为3_5°C，离心カ2950-3050g，离心时间4-6分钟。步骤5和7所用的CaCl2水溶液的浓度及添加量，均可与常规氯化钙法一致。较佳的，步骤5中，CaCl2水溶液与步骤4所取菌悬液的体积比为I : (9_11)。步骤7中，CaCl2水溶液与步骤4所取菌悬液的体积比为I : (48-52)。较佳的，步骤4所述的无菌离心管、步骤5和7所述的CaCl2水溶液均经预冷。进ー步的，在步骤7之后，可加入无菌甘油，使甘油最終含量达到15-20 % (体积百分比)，分装冻存感受态细胞。本发明的有益效果是该方法转化率高，操作简单，重复性好，能满足常规的分子生物学实验要求，是ー项较为实用的新技木，具有极高的应用价值。
具体实施例方式以下列举实施例以进ー步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制专利的保护范围。实施例I :大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备及转化效率測定本实施例中所用的材料和试剂如下材料受体菌DH5a由本实验室保存；pUC19来自生エ生物工程(上海)有限公司。试剂LB液体培养基蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，蒸馏水定容至I升，PH7. 0,121°C灭菌 20 分钟。O. IMCaCl2溶液无水氯化钙11克，蒸馏水定容100毫升，过滤除菌。感受态细胞的制备将大肠杆菌DH5CI贮存菌液在无抗生素LB平板上划线，37°C过夜培养；挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37°C，250rpm振荡培养过夜；次日，按1% (v/v)接入IOOml新鲜的LB液体培养基，370C，250rpm振荡培养至0D600为O. 4-0. 5左右，转入18°C，250rpm振荡培养I小时，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置IOmin后，4°C，3000g离心カ离心5min ;弃上清，再将菌体悬浮于IOml体积的无菌、预冷的O. IMCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；4°C下3000g冷冻离心5分钟；弃上清，再将菌体悬浮于2ml预冷的O. lmol/L的无菌CaCl2溶液中，即为感受态细胞；加入O. 5ml无菌甘油，分装于I. 5ml的Eppendorf管中，姆管200ul,于_80°C冰箱中冻存。转化效率的测定从_70°C冰箱中取100 μ I感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入IOng pUC19，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后；42°C水浴中热休克60秒，迅速置于冰上冷却3分钟。向管中加入Iml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37°C振荡培养I小吋，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amplr)。将上述菌液摇匀后取100 μ I涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养12-16小吋。同时做两个对照。对照组I :以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2 :以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μ I菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。待菌落长出后，菌落计数，计算转化效率。将该实验重复三次，毎次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。对比例(氯化钙法)除了 37°C，250rpm振荡培养大肠杆菌至OD6tltl为O. 4-0. 5左右后，去除转入18°C，250rpm振荡培养I小时的步骤外，其余与实施例I相同。结果如表I :表I三种方法制备的感受态细胞转化效率的比较
方法转化效率(107)(平均值土标准差)
实施例I21 ±5.6
对比例(氯化钙法)1.8±1.1
Inoue 法27 ±6.8结论由表可知，本方法的转化效率是传统氯化钙法的12倍左右，与Inoue法转化效率相当。实施例2 :大肠杆菌TOPlO感受态细胞的制备及转化效率測定本实施例中所用的材料和试剂如下材料受体菌T0P10由本实验室保存；pUC19来自生エ生物工程(上海)有限公司。试剂LB液体培养基蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，蒸馏水定容至I 升，PH7. 0,121°C灭菌 20 分钟。O. IMCaCl2溶液无水氯化钙11克，蒸馏水定容100毫升，过滤除菌。感受态细胞的制备将大肠杆菌T0P10贮存菌液在无抗生素的LB平板上划线，37°C过夜培养；挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37°C，250rpm振荡培养过夜；次日，取Iml接入IOOml新鲜的LB液体培养基，370C，250rpm振荡培养至OD6tltl为O. 4-0. 5左右，转入18°C，250rpm振荡培养I小时，将菌液加入事先预冷的无菌离心管中，冰上放置IOmin后，4°C，3000g，离心5min ;弃上清，再将菌体悬浮于IOml体积的无菌、预冷的O. IMCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰上放置20分钟；4°C下3000g冷冻离心5分钟；弃上清，再将菌体悬浮于2ml预冷的O. lmol/L的无菌CaCl2溶液中；加入O. 5ml无菌甘油，分装于
I.5ml的Eppendorf管中，姆管200ul,于-80°C冰箱中冻存。转化效率的测定、
从_70°C冰箱中取100 μ I感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入IOng pUC19，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后；42°C水浴中热休克60秒，迅速置于冰上冷却3分钟。向管中加入Iml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37°C振荡培养I小吋，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amplr)。将上述菌液摇匀后取100 μ I涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养12-16小吋。同时做两个对照。对照组I :以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2 :以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μ I菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。待菌落长出后，菌落计数，计算转化效率。将该实验重复三次，毎次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。对比例(氯化钙法)除了 37°C，250rpm振荡培养大肠杆菌至OD6tltl为O. 4-0. 5左右后，去除转入18°C，250rpm振荡培养I小时的步骤外，其余与实施例2相同。结果如表2 表2三种方法制备的感受态细胞转化效率的比较
权利要求
1.大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，为将常规液体培养至对数生长期的大肠杆菌，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡扩大培养至0D_为O. 4-0. 5左右，然后转入.17-19°C，振荡培养O. 9-11小时，再离心收集菌体后，采用氯化钙法制备感受态细胞。
2.如权利要求I所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，具体包括下列步骤 .1)从LB平板上挑选新活化的大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡培养过夜； .2)将步骤I)获得的菌悬液接种于新鲜的LB液体培养基中，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡培养至OD6tltl为O. 4-0. 5左右； .3)将步骤2)获得的菌悬液转入17-19°C，振荡培养O.9-1. I小时； .4)将步骤3)获得的菌悬液加入无菌离心管中，冰浴后，冷冻离心收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀； .5)用无菌的O.09-0. IlMCaCl2水溶液重悬步骤4)离心分离的菌体后冰浴； .6)将步骤5)获得的重悬液冷冻离心再次收集菌体，弃上清，保留细胞沉淀； .7)再用无菌的O.09-0. IlMCaCl2水溶液重悬步骤6)离心分离的菌体，即得感受态细胞。
3.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤I)-3)中，大肠杆菌振荡培养的转速为200-250rpm。
4.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)-5)中，冰浴的时间为8-12分钟。
5.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)-5)中，冷冻离心收集菌体的条件为3-5°C，离心力2950-3050g，离心时间4_6分钟。
6.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤5)中，CaCl2水溶液与步骤4)所取菌悬液的体积比为I : (9-11)。
7.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤7)中，CaCl2水溶液与步骤4)所取菌悬液的体积比为I : (48-52)。
8.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤4)所述的无菌离心管、步骤5)和7)所述的CaCl2水溶液均经预冷。
9.如权利要求2所述大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，在步骤7)之后，加入无菌甘油，使甘油最终含量达到体积百分比为15-20 %，分装冻存感受态细胞。
全文摘要
本发明提供了一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，为将常规液体培养至对数生长期的大肠杆菌，在大肠杆菌的最适生长温度下振荡扩大培养至OD600为0.4-0.5左右，然后转入17-19℃，振荡培养0.9-1.1小时，再离心收集菌体后，采用氯化钙法制备感受态细胞。本发明的方法转化率高，操作简单，重复性好，能满足常规的分子生物学实验要求。
文档编号C12N1/20GK102634469SQ20121010326
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者付康 申请人:生工生物工程(上海)有限公司