专利名称：一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法。
背景技术：
转化是将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状的过程，是现代分子生物学最基本的操作技术之一。转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。目前可以通过两种渠道获得大肠杆菌感受态细胞储存物，一种是通过商业途径购买冻存的感受态细胞，其转化效率可靠、稳定，但是所需经费较多，其应用受到限制。另一种方法是实验室自制感受态细胞储存物，常用的方法是CaCl2法，通过用预冷的CaCl2处理培养的大肠杆菌菌株，使之进入感受态得以转化，但所制备的感受态细胞长期冻存以后转化效率会明显下降，需反复制备，耗时耗力。因此研究一种转化效率高、操作简单实用及能长期保存的感受态细胞制备方法，对分子生物学的研究有很大帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法。应用多种阳离子共同作用，即以RbCl、MnCl2等替代传统氯化钙制备法中的CaCl2，从而提供了一种方便、高效、重复性好、保存时间长的感受态细胞制备方法。本发明的技术方案通过下列步骤实现的I)挑取新活化的大肠杆菌单克隆细菌至5ml LB培养基37°C振荡过夜；2)按1%比例 接种至100ml LB培养基中(含20mmol/L MgSO4)，37°C振荡培养2 3小时，至OD值约为O. 4;3) 4 °C、2800r/min离心15min收集细菌，用40ml的冰预冷的TFB I (成分为30mmol/L KAc> 100mmol/L RbCl、10mmol/L CaCl2、50mmol/L MnCl2、15%甘油)重悬细菌,冰上孵育25min ；4)4°C、2800r/min 离心 15min 收集细菌,4ml 冰预冷的 TFB II(成分为 10mmol/I,M0PS、75mmol/L CaCl2、10mmol/L RbCl、15%甘油)重悬细菌，冰浴 15 60min，IOOul/管分装即得感受态细胞，_80°C贮存备用。本发明提供的方法转化效率高，操作简便，重复性好、保存时间长，能满足分子生物学实验要求，是一项实用有效的技术，具有较高的应用价值。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步阐述。实施例1 :本发明的感受态细胞制备方法及转化效率检测。本实施例中所用的材料和试剂如下材料pUC18质粒、受体菌DH5 α购买自北京天恩泽基因科技有限公司。试剂LB液体培养基蛋白栋10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，硫酸镁2. 4克，蒸馏水定容至 1000ml, PH7. 0,121°C灭菌 20min。TFB I 溶液成分为30mmol/L KAc、100mmol/L RbCl、10mmol/L CaCl2、50mmol/LMnCl2、15% 甘油。TFB II 溶液成分为10mmol/L M0PS、75mmol/L CaCl2、lOmmol/L RbCl、15%甘油。本发明的感受态细胞制备过程如下将大肠杆菌DH5CI保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至5ml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v/v)比例接种至100ml LB培养基中，剧烈振荡培养2 3h，至OD值约为0. 4 ;4°C、2800r/min离心15min收集细菌，用40ml冰预冷的TFBI重悬细菌，冰上孵育25min ;4·°C、2800r/min离心15min收集细菌，4ml冰预冷的TFBII重悬细菌，冰浴15 60min，IOOul/管分装，_80°C、贮存备用。转化效率检测过程如下从_80°C冰箱中取出冻存的感受态细胞，冰上解冻后加入IOng pUC18，轻轻摇匀，冰上放置30min，42°C放置90s热激，快速置冰浴，保持2min。每管加IOOOul LB培养基，37°C恒温摇床上培养lh。将转化后菌液于8000r/min离心lmin，倒掉上部分，留IOOul左右菌液，将菌液转移到含抗生素Amp的LB平板上。当液体被培养基吸收后，倒置平板，370C培养12-16h。同时做两个对照。对照组1:以同体积的无菌水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组在常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌水代替DNA溶液，但涂板时只取5ul菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。待菌落长出后，菌落计数，计算转化效率。将该实验重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率。实施例2氯化钙法感受态细胞制备方法及转化效率检测氯化钙法感受态细胞制备过程如下(作为对比)将大肠杆菌DH5 α保存液涂布在无抗生素LB平板上，37°C过夜培养；挑取单克隆细菌至5ml LB培养基37°C振荡过夜；按1% (v/v)比例接种至100ml LB培养基中，剧烈振荡2 3h, OD值约为0. 6 ；4°C >4000r/min离心IOmin收集细菌，用40ml冰预冷的0. lmol/L氯化钙溶液重悬细菌，冰上孵育30min ;4°C、4000r/min离心IOmin收集细菌，4ml冰预冷的0. lmol/L氯化钙溶液(含15%甘油)重悬细菌，冰浴15 60min，IOOul/管分装，_80°C、贮存备用。转化效率检测方法同实施例1。转化效率检测结果如下方法转化效率(107)(平均值土标准差)实施例1 :26 ±3. 4实施例2 (对比)1. 3±1. 5结论由上述可知，本方法转化的效率是传统氯化钙法的20倍左右。实施例3转化影响因素用大肠杆菌DH5a制备感受态细胞，比较两种方法制备的感受态细胞在立即使用、冻存(_80°C ) 3个月、冻存6个月、冻存9个月四个时间点采用同一质粒pUC18进行细菌
转化，克隆计数。结果如下
方法立即使用3个月 6个月 9个月
本法制备413407410402
氯化钙法23201812结论由上述可知，本方法制备的感受态细胞，在保存9个月时间时没有明显的变化，而氯化钙法制备的 感受态细胞，随着时间的延长，感受态细胞的克隆数减少。
权利要求
1.大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，步骤包括在常规液体培养基中培养大肠杆菌，至OD值约为O. 4左右时离心收集细胞，再用氯化物制备感受态细胞。
2.权利要求1的制备方法，其中氯化物为氯化铷。
3.权利要求2的制备方法，其具体步骤为a)挑取新活化的大肠杆菌单克隆细菌至5mlLB培养基37°C振荡过夜；b)按I%比例接种至100ml LB培养基中(含20mmol/L MgSO4)，37°C振荡培养2 3 小时，至OD值约为0.4 ;c)4°C、2800r/min离心15min收集细菌,用40ml的冰预冷的TFB1(成分为30mmol/ L KAcUOOmmoI/L RbCl、10mmol/L CaCl2、50mmol/L MnCl2、15%甘油)重悬细菌，冰上孵育 25min ；d)4* 、2800r/min 离心 15min 收集细菌，4ml 冰预冷的 TFB II (成分为 10mmol/L MOPS、 75mmol/L CaCl2、10mmol/L RbCl、15%甘油)重悬细菌，冰浴 15 60min，IOOul/管分装即得感受态细胞，_80°C贮存备用。
4.权利要求2-3的制备方法，其中大肠杆菌为大肠杆菌DH5a。
全文摘要
本发明提供了一种大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，步骤包括在常规液体培养基中培养大肠杆菌，至OD值约为0.4左右时离心收集细胞，用氯化铷法制备感受态细胞。
文档编号C12N1/20GK103045525SQ20131002159
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者不公告发明人 申请人:康盈创新生物技术(北京)有限公司