专利名称：一种纤维化纤维微细菌及渗透发酵生产海藻糖的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵生产海藻糖方法技术领域，特别涉及以葡萄糖为基质利用纤维化纤维微细菌渗透发酵生产胞外海藻糖的方法。
背景技术：
据《生物化学与生物物理学报》(Croweet al, Biochim. Biophys. Acta, 1984,769 :151-159)和《食品化学》(Ohtani et al, Food Chem.，1994，2 :91-95)介绍，海藻糖(a -D-吡喃葡糖基-a -D-吡喃葡糖苷)是一种广泛分布在植物、昆虫、真菌和细菌中的非 还原葡萄糖苷，此双糖可用作为能源的一种存储形式和干燥或冷冻等环境压力的防护剂。由于在其分子结构中没有还原端，海藻糖不仅显示出对极端的温度、PH和美拉德反应的抵抗性，而且还具有很高的持水活性，因此海藻糖具有帮助稳定蛋白质结构和生物膜完整性的功能。由于这些有用的特性，据《海藻糖21世纪的新型糖类》(黄日波等，北京，化学工业出版社，2010年第I版74-198页)介绍，海藻糖在医药、化妆品和食品等领域有许多应用，比如可用作抗体药物、疫苗、诊断试剂、活体细胞或组织在冷冻和干燥时的生物活性保护剂，可作为药物传递系统的良好辅料，可用于化妆品的保湿、细胞保护、防止油脂分解及减少体臭、抗辐射等功效成分，作为淀粉老化、蛋白质变性和脂类氧化的抑制剂，以及用作蔬菜或肉类的稳定剂和保鲜剂。据《糖原生物学》(Elbeinet al,Glycobiology, 2003,13 17-27)和《海藻糖》(黄日波等，海藻糖21世纪的新型糖类，北京化学工业出版社，2010年第I版31-55页)中介绍，目前商品化的海藻糖生产方法主要有三种(I)酵母细胞提取法，是采取收集酵母细胞用热乙醇来进行提取。但该方法耗时较长，效率低，提取溶剂用量大，而且胞内海藻糖含量不高，由此导致成本较高，使其在海藻糖需求量最大的食品行业难于推广使用。(2)微生物发酵法，该方法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵产生海藻糖，再从发酵液中提取纯化而获得产品化的海藻糖。虽然之前有效生产海藻糖的微生物已被广泛筛选，且已有几种微生物被分离成功并应用于海藻糖发酵商业生产系统，但到目前为止，由于现有的许多生产系统转化率较低，且发酵液中糖类副产物较多，从而使海藻糖的提取、精制比较困难。(3)细菌酶转化法，是将一些细菌体内相关的海藻糖合成酶提取出来后，利用其转糖基作用于催化底物来合成海藻糖。目前可应用的酶转化法有麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶双酶法、糖基转移酶和淀粉酶双酶法以及海藻糖合成酶法。酶转化法有特异性好、转化率高的优点，但所用的酶需要精制，由于制酶的费用较高，且产品分离过程较复杂，因此生产成本较高。目前应用的酶转化系统大多是从麦芽寡糖生产海藻糖，从葡萄糖(工业生产有机物质的有用起始材料之一)有效生产海藻糖的信息较缺乏。
发明内容
本发明提供一种纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,并利用该纤维化纤维微细菌进行渗透发酵生产海藻糖的方法，以克服现有技术的上述不足，达到生产工艺集约、转化率高且产品易于分离的技术目的。本发明提供的一种新的纤维化纤维微细菌菌株，是从合肥地区榆树枯木枝上分离得到的，命名为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌种保藏号为CGMCC No. 5841，保藏日期为2012年3月2日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。本发明的利用纤维化纤维微细菌渗透发酵生产海藻糖的方法，其特征在于先将菌种保藏号为CGMCC No. 5841的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株进行活化培养，按培养基体积的5%接种量转入置有组分按每升培养基中所含的质量克数为葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米浆10、MgSO4 I、KH2PO4 I和CaC037 (g/L)的发酵培养基的发酵罐中，装液量为发酵罐容积的70%，培养温度为30°C，空气流量4L/min，转速300r/min ;培养30h后，向培养液中添加至终浓度为5_10g/L的(NH4)2SO4和60g/L的葡萄糖，再培养7h ;然后将发酵液离心或过滤除去菌株细胞，得到含海藻糖的溶液；采用截留相对分子量为10000的超滤膜脱除大分子物质，用阴阳离子交换树脂脱盐、分离海藻糖和葡萄糖；将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩，再喷雾干燥，即得到海藻糖成品。在上述生产菌株培养30h后，优选向培养液中添加终浓度为8g/L的(NH4)2S04。本发明方法由于以葡萄糖为底物，利用纤维化纤维微细菌菌株培养后，纤维化纤维微细菌以葡萄糖为基质渗透发酵，从而可以大量合成胞外海藻糖。采用本发明方法生产海藻糖，生产工艺集约、设备投资少、且无糖类副产物、产品易于分离，其突出特点是海藻糖转化率高达60%，使生产成本降低，从而为海藻糖的广泛应用奠定了基础。采用本发明方法所制备的海藻糖由于其对生物大分子良好的非特异性保护作用而在医药、化妆品和食品等领域有广阔的应用前景。由于本发明方法中米取了向发酵培养基中添加适量的(NH4)2SO4来提高培养环境的渗透压，胁迫培养纤维化纤维微细菌使得菌株细胞内应激产生较多的海藻糖合成酶系，同时细胞膜失去了原有的选择透过性，细胞内产生的海藻糖可以自由扩散到细胞外发酵液中。经测定，同样发酵条件下，没有添加(NH4)2SO4的纤维化纤维微细菌发酵液中没有海藻糖生成，而添加适量(NH4)2SO4的纤维化纤维微细菌发酵液中海藻糖发酵单位可达34g/L。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。本发明实施例中所用于配制培养基的成分的原料葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、MgS04、KH2PO4和CaCO3以及(NH4) 2S04均为市售产品。本发明使用的纤维化纤维微细菌菌株是从合肥地区榆树枯木枝上自主分离得到的，命名为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌种保藏号为CGMCCNo. 5841，保藏日期为2012年3月2日，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址中国科学院微生物研究所。实施例I :本实施例利用纤维化纤维微细菌进行渗透发酵生产海藻糖的方法，包括纤维化纤维微细菌培养、渗透发酵与海藻糖的合成和海藻糖的提取分离。具体操作步骤如下(I)纤维化纤维微细菌培养取菌种保藏号为CGMCC No. 5841的纤维化纤维微细、菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株进行活化培养，按培养基体积的5%接种量转入置有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量3. 5L，培养温度30°C，空气流量4L/min，转速300r/min，培养时间 30h。上述发酵培养基组分按每升培养基中所含的质量克数为葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨 5、玉米浆 10、MgS04 UKH2PO4 I 和 CaCO3 7 (g/L)。(2)渗透发酵向培养30h后的培养液中添加28§(见14)2504和21(^葡萄糖，再培养7h。添加铵盐(NH4)2SO4可以提高生产菌株培养环境的渗透压，诱导其细胞应激产生较多的海藻糖合成酶系，并成为透性化细胞；同时葡萄糖进入到细胞内被转化为海藻糖，海藻糖可以自由扩散到细胞外发酵液中。(3)海藻糖的分离与纯化将发酵液离心或过滤除去菌株细胞，得到海藻糖含量 为34g/L的溶液。采用截留相对分子量为10000的超滤膜脱除大分子物质，用阴阳离子交换树脂脱盐、分离海藻糖和葡萄糖。将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩，再喷雾干燥，得到海藻糖粉末102g。实施例2:(I)纤维化纤维微细菌培养取纤维化纤维微细菌保藏菌种活化培养，按培养基体积的5%接种量转入置有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量3. 5L，培养温度30°C，空气流量4L/min，转速300r/min，培养时间30h。所述发酵培养基与实施例I中相同，组分按每升培养基中所含的质量克数为葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米浆10、MgS04 UKH2PO4 I和CaCO3 7 (g/L)。(2)渗透发酵向培养30h后的培养液中添加17. 5§(见14)2504和21(^葡萄糖，再培养7h。(3)海藻糖的分离与纯化将发酵液离心或过滤除去菌株细胞，得到海藻糖含量为32g/L的溶液。采用截留相对分子量为10000的超滤膜脱除大分子物质，用阴阳离子交换树脂脱盐、分离海藻糖和葡萄糖。将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩，再喷雾干燥，得到海藻糖粉末96g。实施例3 (I)纤维化纤维微细菌培养取纤维化纤维微细菌保藏菌种活化培养，按培养基体积的5%接种量转入置有发酵培养基的5L发酵罐中，装液量3. 5L，培养温度30°C，空气流量4L/min，转速300r/min，培养时间30h。所述发酵培养基与实施例I中相同，组分按每升培养基中所含的质量克数为葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米浆10、MgS04 UKH2PO4 I和 CaCO3 7 (g/L)。(2)渗透发酵向培养30h后的培养液中添加35§(见14)2504和21(^葡萄糖，再培养7h0(3)海藻糖的分离与纯化将发酵液离心或过滤除菌株细胞，得到海藻糖含量为31g/L的溶液。采用截留相对分子量为10000的超滤膜脱除大分子物质，用阴阳离子交换树脂脱盐、分离海藻糖和葡萄糖。将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩，再喷雾干燥，得到海藻糖粉末93g。本发明方法由于以葡萄糖为底物，利用纤维化纤维微细菌菌株培养后，纤维化纤维微细菌以葡萄糖为基质渗透发酵，从而可以大量合成胞外海藻糖。采用本发明方法生产海藻糖，生产工艺集约、设备投资少、且无糖类副产物、产品易于分离，其突出特点是海藻糖转化率高达60%，使生产成本降低，从而为海藻糖的广泛应用奠定了基础。采用本发明方法所制备的海藻糖由于其对生物大分子良好的非特异性保护作用而在医药、化妆品和食品等领域有广阔的应用前景。
由于本发明方法中采取了向发酵培养基中添加适量的(NH4)2SO4来提高培养环境的渗透压，胁迫培养纤维化纤维微细菌使得菌株细胞内应激产生较多的海藻糖合成酶系，同时细胞膜失去了原有的选择透过性，细胞内产生的海藻糖可以自由扩散到细胞外发酵液中。经测定，同样发酵条件下，没有添加(NH4)2SO4的纤维化纤维微细菌发酵液中没有海藻糖生成，而添加适量(NH4)2SO4的纤维化纤维微细菌发酵液中海藻糖发酵单位可达34g/L。
权利要求
1.一种纤维化纤维微细菌菌株，是从合肥地区榆树枯木枝上分离得到的，命名为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32,菌种保藏号为 CGMCC No. 5841。
2.一种利用纤维化纤维微细菌渗透发酵生产海藻糖的方法，其特征在于先将菌种保藏号为CGMCC No. 5841的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans) S32菌株进行活化培养，按培养基体积的5%接种量转入置有组分按每升培养基中所含的质量克数为葡萄糖20、酵母粉5、蛋白胨5、玉米浆10、MgSO4 UKH2PO4 I和CaCO3 7的发酵培养基的发酵罐中，装液量为发酵罐容积的70%，培养温度为30°C，空气流量4L/min，转速300r/min ；培养30h后，向培养液中添加至终浓度为5-10g/L的(NH4)2SO4和60g/L的葡萄糖，再培养7h ;然后将发酵液离心或过滤除去菌株细胞，得到含海藻糖的溶液；采用截留相对分子量为10000的超滤膜脱除大分子物质，用阴阳离子交换树脂脱盐、分离海藻糖和葡萄糖；将收集的海藻糖组分加热蒸发浓缩，再喷雾干燥，即得到海藻糖成品。
3.如权利要求2所述利用纤维化纤维微细菌渗透发酵生产海藻糖的方法，特征在于在所述生产菌株培养30h后，向培养液中添加(NH4)2SO4至终浓度为8g/L。
全文摘要
本发明公开了一种纤维化纤维微细菌及利用纤维化纤维微细菌渗透发酵生产海藻糖的方法，该新菌株命名为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)S32，菌种保藏号为CGMCC No.5841；本发明方法以葡萄糖为底物，将纤维化纤维微细菌菌株培养后进行渗透发酵，纤维化纤维微细菌细胞应激产生较多的海藻糖合成酶系并成为透性化细胞，胞内海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖。从葡萄糖到海藻糖转化率高达60％，且无糖类副产物、产品易于分离，生产工艺集约、设备投资较少、生产成本较低。所制备的海藻糖由于其对生物大分子良好的非特异性保护作用而在医药、化妆品和食品等领域有广阔的应用前景。
文档编号C12P19/12GK102634470SQ20121010336
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者宋建民 申请人:宋建民