高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株快速筛选的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速筛选高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株的方法。该方法应用新型的高效表达载体，实现目标蛋白在合适的哺乳动物宿主细胞中的高效表达，并通过独特的筛选方法，快速筛选获得高表达目标蛋白的细胞株。利用本发明的方法可大大减少筛选高表达目标蛋白细胞株的时间和成本，并显著提高外源蛋白在哺乳动物宿主细胞中的表达水平。
【专利说明】高表达外源蛋白的晡乳动物细胞株快速筛选 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种快速筛选稳定高产量哺乳动物细胞株的 方法。利用本发明的筛选方法可快速获得高表达外源蛋白的稳定哺乳动物细胞株。 【背景技术】
[0002] 随着生物医药技术的发展，治疗用重组蛋白（包括抗体）已广泛应用于临床实践 中。许多治疗性的重组蛋白要保持其生物活性往往需要特定的翻译后修饰，如糖基化等，而 原核生物或者低级的真核生物细胞表达系统缺少复杂的翻译后修饰功能。随着糖蛋白类药 物的逐渐普及，哺乳动物表达系统尤其是CH0细胞（Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢 细胞）表达系统正成为重组蛋白药物生产的最主要宿主细胞。目前已有多种外源基因如人 组织型纤溶酶原激活剂、促红细胞生成素（Erythropoietin,简称ΕΡ0)、凝血因子VIII和单 克隆抗体CD20等在哺乳动物细胞中得到表达和生产，上述药物均已上市，且每个药物年销 售额超过10亿美元。
[0003] 然而，由于哺乳动物细胞生长慢、培养基成分复杂、生长条件苛刻，而且外源蛋白 表达水平低、筛选表达目标蛋白的稳定高产细胞株耗时耗力、细胞培养成本高、技术复杂等 因素，致使利用哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高、周期长。快速筛选稳定高产量 的细胞工程株，是目前重组蛋白药物研究和生产的主要瓶颈之一。
[0004] 为了获得表达目标蛋白的高表达稳定细胞株，需要应用表达载体将目标基因转染 到哺乳动物宿主细胞并整合到宿主细胞染色体上，随着宿主细胞的转录翻译，目标基因得 以有效表达。因此，获得高表达哺乳动物细胞株的关键要素包括表达载体、宿主细胞、转染 和筛选方法，其中表达载体和细胞株筛选方法是目标蛋白得以稳定高效表达的的最重要因 素。
[0005] 传统的哺乳动物细胞表达载体通常包含四个表达框，分别用于表达目标基因、哺 乳动物细胞抗性筛选标记基因（如博来霉素，Zeocin，简称ΖΕ0)、扩增选择性标记基因（如 二氢叶酸还原酶，dyhidrofolate reductase,简称DHFR)以及在大肠杆菌中复制增殖基因， 每个表达框都含有各自独立的启动子和终止子，位于上述表达基因的上下游。表达载体进 入细胞后，编码蛋白通过细胞的转录和翻译机制以及必要的翻译后修饰产生。对于哺乳动 物宿主细胞来说，外源序列的整合必然会影响到宿主细胞的正常生长，宿主细胞会通过一 系列的机制来抵御外源基因的整合。由于传统哺乳动物细胞表达载体含有4个表达框，载 体一般大于8kb，不利于外源基因整合到宿主细胞染色体上，增加宿主细胞的负担并导致外 源基因对宿主细胞的伤害。因此缩减载体的大小，对于目标基因的高效稳定表达具有重要 意义。另外，由于外源基因非特异性的整合，载体过大会造成其各元件整合到宿主细胞基因 组的不同位置，给后期的筛选工作带来很大的不便。例如，用抗性筛选得到的细胞很可能是 仅仅整合并表达了抗性筛选基因的细胞，而不表达目标蛋白的细胞。因此减小载体大小还 有利于减少筛选到假阳性的几率。
[0006] 快速筛选方法是获得高产量稳定表达细胞株的关键因素。常规的筛选方法是利 用单个筛选标记来筛选含有目标基因的稳定细胞株，单个筛选标记通常为抗性标记，如ZEO 标记，具体来说，将筛选标记基因和目的基因连接在同一载体中，然后转染到宿主细胞中， 实现目的基因和标记基因的共同表达，常规筛选方法中标记基因和目标基因表达水平相 近，有可能筛选到的是表达标记基因的细胞，而不是表达目标基因的细胞。因而常规筛选方 法需要在成千上万个细胞筛选到高表达稳定单克隆细胞，获得稳定高表达细胞株的过程至 少需要半年以上的时间，耗费大量的时间和成本，制约了重组蛋白药物的大规模生产。
【发明内容】
[0007] 本发明通过分子生物学技术构建和优化哺乳动物细胞新型表达载体，利用本发明 的表达载体将目标基因转染到合适的宿主细胞，并通过独特的筛选方法获得高表达目标基 因的工程细胞株。本发明可快速、有效地筛选高表达外源蛋白的工程细胞株，实现目标蛋白 在哺乳动物细胞中的高效稳定表达，节约蛋白药物开发成本和时间。
[0008] 本发明的一个目的是提供一种高效的新型哺乳动物细胞表达载体。具体说，本发 明的表达载体是利用分子生物学技术构建和优化的一种新型哺乳动物表达载体。该表达载 体仅含单个表达框，不含有任何目标蛋白在哺乳动物细胞表达系统中不必要的冗余序列， 利用一个启动子实现目标基因的高效表达和标记基因的弱化表达，本发明的哺乳动物细胞 表达载体比传统的表达载体至少小3kb。同时，本发明表达载体中在标记基因和目标基因中 间引入了 IRES(Internal ribosome entry site,内部核糖体进入位点）序列，该序列可弱 化下游标记基因的表达，从而在标记基因表达的同时，确保目标基因得以商效稳定的表达。
[0009] 具体来说，本发明的表达载体是多个基因或基因片段重要元件的优化组合，所述 表达载体由以下元件或序列组成，且最好以下列顺序排列：
[〇〇1〇] a) -个强启动子
[0011] b)目标基因克隆位点
[0012] c)合成的IRES序列
[0013] d)扩增标记基因
[0014] e)FMDV IRES 序列
[0015] f)合成的大肠杆菌EM7元件 [〇〇16] g)嵌合筛选标记基因
[〇〇17] h)转录终止子
[0018] i) 一个启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列。
[0019] 所述的一个强启动子是病毒启动子，如CMV(cytomegalovirus,巨细胞病毒）、 SV40(Simian virus40,猴空泡病毒40)、RSV(Rous sarcoma virus，肉瘤病毒）、MLV(Murine leukovirus，小鼠白血病病毒）、MPSV(myeloproliferative sarcoma virus，骨髓增殖肉瘤 病毒），和/或非病毒启动子（如人铁蛋白重链核心启动子）以及其他调控序列的组合。优 选的强启动子是，CMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0020] 所述的目标基因克隆位点是，用于克隆目标基因的多个限制性内切酶位点。
[0021] 所述合成的IRES序列是本领域内已知的GTX同源结构域蛋白的多个重复的5'非 翻译区域的一部分，具有IRES的功能，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0022] 所述的扩增标记基因是本领域内已知的DHFR序列或GS序列 (Glutaminesynthetase，谷氨酰胺合成酶）。DHFR催化了二氢叶酸转化为四氢叶酸。氨甲 喋呤（MTX)抑制二氢叶酸还原酶，因此转染DHFR缺陷型宿主细胞，能够通过扩增DHFR基因 来形成对MTX的抗性。
[0023] 所述的FMDV IRES序列是本领域已知的来自口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,简称FMDV)的IRES序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0024] 所述的合成的大肠杆菌EM7元件为人工合成的EM7元件，该元件仅含有66个碱基 序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0025] 所述的嵌合筛选标记基因是多个选择性抗性标记基因的组合，抗性基因包括抗 ΖΕ0、PUR(pur〇mycin，嘌呤霉素）、HYP(Hygr〇mycin，潮霉素）或是任何一个荧光标记基因， 优选的包括 GFP(Green Fluorescent Protein，绿色突光蛋白）、RFP(Red Fluorescent Protein,红色突光蛋白）。
[0026] 所述的转录终止子是本领域内已知的终止序列，如BGH(bovine growth hormone, 牛生长激素）终止子、SV40 终止子、HSV TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase，单 纯疱疹病毒胸苷激酶基因）终止子。
[0027] 所述的一个启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列是本领域内已知的启动在大 肠杆菌中起始复制的PUC起始序列。
[0028] 本发明的另一个目的是提供一种快速筛选高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株的 方法，该方法包括以下步骤：
[0029] a)利用上述本发明新型的高效表达载体将目标基因转染到宿主细胞；
[0030] b)利用本发明独特的筛选方法快速筛选得到高表达目标蛋白的稳定细胞株。
[0031] 所述的表达载体仅含单个表达框，是多个基因或基因片段重要元件的优化组合， 其结构与上述本发明的表达载体结构相同。
[0032] 所述的宿主细胞选自CH0, NS0, HEK293, Sp2/0,优选的是CH0细胞。
[0033] 所述的转染方法是所述的转染方法包括磷酸I丐法，电转法（electroporation)，脂 质体转染（phospholipids)，优选的转染方法是电转法转染。
[〇〇34] 所述的快速筛选方法是利用嵌合筛选标记进行高表达稳定细胞株的筛选。嵌合筛 选标记可以是ΗΥΡ、ΖΕ0和PUR等抗性基因与DHFR、GS或GFP的任意组合。优选的嵌合筛选 标记为ΖΕ0和GFP的组合（ZE0-GFP)，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0035] 本发明的筛选方法同时采用了嵌合筛选标记，可大大提高筛选效率，具体说，利用 传统筛选方法获得高产稳定表达目标蛋白的细胞株需要6-9个月，而采用本发明独特的筛 选方法，只需8-9周便可获得高表达目标蛋白的细胞株。
[0036] 本发明快速筛选高产稳定细胞株的方法与常规筛选方法相比，具有以下优点和效 果：
[0037] 本发明表达载体仅含有单个哺乳动物细胞表达框，并在目标基因和标记基因之间 引入了合成的优化IRES序列，大大降低了假阳性克隆的概率，并显著提高目标基因在宿主 细胞中的表达水平。
[0038] 基于上述表达载体，本发明采用了独特的筛选方法，常规方法需要在103几何阶数 的细胞中筛选到表达目标基因的细胞克隆，而本发明只需从1〇 2几何阶数的细胞中便可筛 选到高表达目标基因的细胞克隆。特别是嵌合了 GFP荧光标记，可根据荧光强度使用流式 细胞分选仪进行高通量分选，使用荧光显微镜进一步确认阳性表达克隆，简化了筛选步骤， 缩短了筛选时间，因而大大提高了筛选效率。换言之，利用常规表达系统在哺乳动物细胞中 获得重组蛋白的最优表达水平需要6-9个月，而利用本发明表达系统只需8-9周便可获得 商表达目标蛋白的细胞株。 【专利附图】
【附图说明】
[0039] 附图强调了本发明的原则，不一定成比例。
[0040] 图1 :实施例1构建的哺乳动物细胞表达载体示意图。
[0041] A)传统的哺乳动物细胞表达载体pA。传统表达载体含有四个独立的表达框，各兀 件的排列顺序如下：（1)CMV启动子；（2)目标基因克隆位点；（3)BGH终止子；（4)EFl-a启 动子；（5)DHFR扩增基因序列；（6)HSV TK终止子；（7)SV40启动子；（8)ZE0抗性基因；（9) SV40终止子；（10)PUC复制起点；（11)大肠杆菌骨架和氨苄抗性基因（AmpO。
[0042] B)本发明的表达载体pB。本发明的表达载体仅包括单个表达框，不同表达基因间 采用不同的IRES序列连接。表达载体pB各元件的排列顺序如下：（1) CMV启动子；(2)目标 基因克隆位点；（3)合成的GTX IRES序列；（4)DHFR扩增基因；（5)FDMV IRES序列；(6)EM7 元件；（7) ZE(f-GFP嵌合筛选标记基因；（8) SV40终止子；(9) PUC复制起点。
[0043] 图2 :实施例2中的Western Bloting结果图。比较了含ΕΡ0基因的表达系统 A(pA-EPO)和表达系统B(pB-EPO)稳定表达目标基因的水平。
[0044] 图3 :实施例2中获得稳定转染的含ΕΡ0基因的pA(pA-EPO)和pB(pB-EPO)细胞 株的表达量对比图。
[0045] 图4 :实施例5中的Western Bloting的结果图。比较了含tPA基因的表达系统 A(pA-tPA)和表达系统B(pB-tPA)稳定表达目标基因的水平。
[0046] 图5 :实施例5中获得稳定转染的含tPA基因的pA(pA-tPA)和pB(pB-tPA)细胞 株的表达量对比图。 【具体实施方式】
[〇〇47] 实施例1 :哺乳动物细胞表达载体的构建
[0048] 方法：通过分子生物学技术，如限制性酶切、DNA连接、大肠杆菌转化和克隆筛选 按照《分子克隆实验指南》（第三版，黄培堂译，科学出版社）等标准方法构建传统表达载体 PA和本发明表达载体pB。具体操作方法如下：
[0049] 1. 1传统表达载体pA的构建：以Invitrogen公司pcDNA3. 1载体为模板。
[0050] 人工合成启动子SV40、DHFR、终止子sv40及其他调控序列的融合序列（1. 8kb)并 在其末端分别添加 spel和Nael的酶切位点。将该合成的融合序列采用T4DNA连接酶连接 到经spel和Nael双酶切的pcDNA3. 1，通过大肠杆菌转化，并进行单克隆筛选得到传统表达 载体pA。
[0051] 1. 2本发明表达载体pB的构建：利用限制性内切酶Bglll和Seal双酶切去掉
[0052] pcDNA3. 1载体上的大肠杆菌中的骨架序列（1. 4kb)，用Klenow酶将粘性末端补齐 后再用T4DNA连接酶连接。使用限制性内切酶去除BGH终止子、SV40启动子序列（1. 5kb)， 同时人工合成含有GTX IRES、DHFR、FWDV IRES E7融合序列及嵌合选择标记基因 ZE0-GFP 的融合DNA序列，用T4DNA连接酶将酶切的载体与人工合成的融合序列连接。通过大肠杆 菌转化和克隆筛选得到本发明表达载体PB。
[0053] 结果：图1显示了传统哺乳动物细胞表达载体pA的结构图（大小：7. 4kb)和本发 明表达载体PB的结构图（大小：4. 5kb)。
[0054] 传统表达载体含有四个独立的表达框。表达载体pA各兀件的排列顺序如下：
[0055] a)CMV 启动子；
[0056] b)目标基因克隆位点；
[0057] c) BGH 终止子；
[0058] d)EFl_a 启动子；
[0059] e)DHFR扩增基因序列；
[0060] f) HSV TK 终止子；
[0061] g)SV40 启动子；
[0062] h)ZE0抗性基因；
[0063] i) SV40 终止子；
[0064] j)PUC复制起点；
[0065] k)大肠杆菌骨架序列和氨苄抗性基因（Amp。序列
[〇〇66] 本发明的表达载体pB仅含单个表达框，由以下元件或序列组成，且以如下顺序排 列：
[0067] a)CMV 启动子；
[0068] b)目标基因克隆位点；
[0069] c)合成的GTX IRES序列
[0070] d) DHFR扩增标记基因；
[0071] e)FMDV IRES 序列；
[0072] f) EM7 元件
[0073] g)ZE(f-GFP嵌合筛选标记基因；
[0074] h) SV40 终止子；
[0075] i)PUC复制起点。
[0076] 结果：与含有多个表达框的传统哺乳动物细胞表达载体比较，本发明表达载体pB 仅含一个表达框，只使用一个CMV启动子，同时删除了大肠杆菌中的骨架序列及其他多余 的启动子和终止子序列，比传统载体至少小3kb。
[0077] 实施例2 :快速筛选高表达ΕΡ0蛋白的稳定细胞株
[0078] 2. 1.构建含有目标基因的表达载体：根据NCBI已有的序列信息人工合成ΕΡ0的 编码序列，并通过引入相应的酶切位点（Nhel和Hindlll)将其克隆至实施例1构建的表达 载体pA和pB中，获得含有目标基因的表达质粒pA-EPO和pB-EPO。
[0079] 2. 2. DNA转染至CHO-dhfr-悬浮细胞株：将上述含有目标基因的表达质粒pA-EPO 和pB-EPO,以及表达载体对照pA和pB分别转染到DHFR酶缺陷的CH0细胞（CH〇-dhfr_)中。 CH〇-dhff细胞为悬浮培养，转染时细胞密度为1. 5X106/ml，转染体积为30ml。转染方法 按照Lipofectamine2000(购自Invitrogen)使用说明操作。
[0080] 2. 3.稳定表达ΕΡ0细胞株的筛选：
[0081] 具体方法如下：
[0082] (1)将上述DNA转染至CH〇-dhfr_细胞后，摇瓶培养48小时，分别取样观察细胞活 力，活力大于90%可以进行种板。用新鲜的选择培养基（含100yg/ml Zeocin)重悬离心 后的细胞，以1000-5000个/孔种在96孔板中。转染20天可见明显的细胞克隆生长。
[0083] (2)分别挑选转染了 4种DNA的全部细胞克隆于另外的96孔板中，用不含抗性的 悬浮培养基培养3天，取上清用ELISA测定96孔板中ΕΡ0的表达，以此计算阳性克隆率。
[0084] (3)将培养了 4种DNA的细胞克隆96孔板的上清分别收集并混合后做Western Blotting，用于检测4种转染了不同DNA的细胞表达。
[0085] (4)根据ELISA测定结果，分别选择5-10个转染了 pA-EPO和pB-EPO表达质粒的 最高0D读数的细胞克隆进行扩增，扩增时用不含抗性的悬浮培养基培养。当各个克隆扩增 至细胞数大于1X 1〇7个时，为了提高目的基因的拷贝数和目标基因的稳定表达，各个克隆 采用MTX加压筛选方法。
[0086] (5)转染了 pA-EPO 的细胞克隆用梯度 ΜΤΧ (50ηΜ、500ηΜ、1μΜ、2μΜ、3μΜ、4μΜ、 5 μ Μ)进行逐步加压筛选，每次接种于96孔板的细胞密度为每孔100-500个,每个梯度的筛 选时间为10-15天，并用ELISA检测较高表达的1-2个克隆用于下一梯度ΜΤΧ加压，最终得 到稳定表达的细胞株。
[〇〇87] (6)转染了 pB-EPO的细胞克隆首先用流式细胞术筛选出荧光最亮的5%的细胞， 用5 μ Μ MTX进行加压筛选，接种于96孔板的细胞密度为每孔100-500个，筛选时间为 10-15天，并用ELISA检测较高表达的1-2个克隆作为稳定表达的细胞株候选，最终通过比 较得到最终的工程细胞株。
[0088] (7)两种转染了含ΕΡ0表达质粒的细胞克隆分别保种5X107细胞总数后扩增至 100ml，密度以IX 106/ml开始，每日检测细胞的密度和表达量，连续培养10天，记录下各个 细胞克隆的每日的细胞密度及表达水平，并绘制生长曲线以及表达曲线。
[0089] 结果：与传统的筛选方法比较，本发明的筛选方法采用含嵌合ZE0-GFP荧光标记 的表达载体。经过筛选得到的细胞克隆，ELISA分析结果显示，本发明筛选方法的阳性克隆 率为95%，传统筛选方法的阳性克隆率仅为15%，即本发明的筛选方法假阳性率显著低于 传统的筛选方法（P < 〇. 05)。
[0090] Western Blotting的结果表明（图2)，与阴性对照（pA、pB)相比，转染了 pA-EPO 和pB-EPO的细胞能检测到目标基因的表达，且本发明筛选方法（pB-EPO)中ΕΡ0表达水平 明显高于传统筛选方法（pA-EPO) (P < 0. 05)。
[0091] 经过MTX加压筛选得到稳定表达ΕΡ0的细胞株，连续培养10天后检测其中的ΕΡ0 蛋白表达量，结果显示，本发明筛选方法（表达载体pB-EPO)从第4天开始表达量明显比传 统筛选方法（表达载体pA-EPO)中的ΕΡ0表达量高（图3)，到第10天时本发明筛选方法中 蛋白表达量为136.9mg/L，而传统筛选方法中蛋白表达量仅为15. 5mg/L(表1、图3)。
[0092] 本发明筛选方法采用含嵌合ZE0-GFP荧光标记的表达载体，特别是嵌合了 GFP荧 光标记，可根据荧光强度使用流式细胞分选仪进行高通量分选，简化了筛选步骤，缩短了筛 选时间，因而大大提高了筛选效率。
[0093] 同时，本发明结合利用IRES使得标记基因 DHFR弱化表达，在相同浓度MTX加压 时，本发明表达方法获得的目标基因拷贝数远远高于传统表达方法，从而本发明表达体系 中的假阳性率远远低于传统筛选体系，并且表达水平更高。因此传统筛选方法需要MTX加 压梯度更多，至少需要32周才能获得稳定表达的细胞株。而本发明筛选方法由于其阳性率 高，MTX加压梯度少，仅需要9周便得到了高表达目标蛋白的细胞株（表1)。
[0094] 表1.传统筛选方法和本发明快速筛选方法获得的ΕΡ0稳定细胞株各参数对比
[0095]
【权利要求】
1. 一种新型的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述的哺乳动物表达载体仅含有 单个表达框，由一个强启动子带动目标基因、筛选标记基因和扩增标记基因的表达。这些基 因之间通过IRES序列连接。
2. 根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其中单个表达框包括下列原件，且 优选以如下顺序排列：（a)强启动子；(b)目标基因克隆位点；（c)合成的IRES元件；（d)扩 增标记基因；（e)FMDV IRES元件；（f)合成的大肠杆菌EM7元件；（g)嵌合筛选标记基因； (h)转录终止子；和（i)启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列。
3. 根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中强启动子包括CMV、SV40、 EFl-a、RSV、MLU、MPSV启动子，优选CMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4. 根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中合成的IRES元件包括FMDV IRES序列和合成的GTX IRES序列，所述的FMDV IRES核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，所 述的合成的GTX IRES核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
5. 根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中扩增标记基因包括DHFR基因和 GS基因。
6. 根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中嵌合筛选标记基因包含具有双 功能的抗生素筛选基因如ZEO，HYP，NEO，和荧光蛋白基因如GFP，RFP的嵌合体，前者可用于 转化子的抗生素筛选，后者可作为荧光显微镜或流式细胞仪分选标记。
7. -种高表达外源蛋白的哺乳动物细胞株的快速筛选方法，该方法包括以下步骤：1) 采用权利要求1-6任意一项权利要求所述的哺乳动物细胞表达载体将目标基因转染到合 适的哺乳动物宿主细胞，2)利用筛选方法快速筛选高表达目标蛋白的稳定细胞株。
8. 根据权利要求7所述的快速筛选方法，其中所述的转染方法包括磷酸钙法，电转法， 脂质体转染，优选的转染方法是电转法转染。
9. 根据权利要求7所述的快速筛选方法，其中所述的哺乳动物宿主细胞选自中国仓鼠 卵巢CH0细胞，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0,优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢CH0细胞。
10. 根据权利要求7所述的快速筛选方法，其特征在于，将多个不同的筛选标记基因进 行组合，采用嵌合筛选标记进行高表达细胞株的筛选，所述的嵌合筛选标记包括ZEO、HYP、 PUR等抗性基因与GFP、RFP的任意组合，优选的嵌合筛选标记为ZE0和GFP的组合ZE0-GFP， 其核苷酸序列如SEQ ID NO : 5所示。
【文档编号】C12N5/10GK104087612SQ201310232148
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年6月13日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】侯永敏, 李强, 李屹晨, 雷瑶 申请人:广州优联康医药科技有限公司