专利名称：一种s-腺苷-l-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵方法，具体涉及一种S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法。
背景技术：
S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)是生物体内两种重要的生物活性分子。
SAM，又名腺苷甲硫氨酸，是甲硫氨酸的活性形式，在动植物体内广泛存在，由底物L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)经腺苷甲硫氨酸合成酶(EC 2.5. I. 6)酶促合成的。SAM与人体中许多代谢过程密切相关，是一种改善细胞代谢的生化药物，可以通过转硫基增加肝内GSH、硫酸根及牛磺酸水平，防止肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌，也可防止酒精、药物和细胞素对肝脏的损伤。SAM对于关节炎、纤维性肌肉、偏头痛等疾病也具有很好的治疗效果，而且副作用小。早在上世纪70年代，欧洲已将SAM作为治疗关节炎的处方药使用。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，在美国己成为最畅销的营养品之一。GSH是广泛分布于哺乳动物、植物和微生物细胞内最主要且含量最丰富的低分子三肽，也是生物体内最重要的活性巯基化合物之一，被广泛应用为解毒剂、抗氧化剂、免疫增强剂、风味剂和防腐剂，在临床医学、运动保健、食品加工等很多领域都有着广泛的应用前景。临床方面，GSH常作为肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病的辅助治疗药物，能够保护体内许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能，对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血具有重要意义。GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状也能起到保护作用。同时GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出体外，起到中和解毒作用。最新研究还表明，GSH能够纠正体内乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽，另外，GSH在改善性功能方面也有很好作用。近年来，西方科学家发现谷胱甘肽也具有抑制艾滋病病毒的功能。食品加工方面，将GSH加入到面制品中，可起到还原作用，不仅使制造面包的时间缩短至原来的二分之一或三分之一，劳动条件大幅度改善，并起到强化食品营养的作用；将其加入到酸奶和婴幼儿食品中，相当于维生素C，可起到稳定剂的作用；将其拌到鱼糕中，可防止色泽加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。由于SAM和GSH在多方面的作用，特别是医药方面的突出作用，人们对二者的需求量也迅猛增加，但目前国内需求主要依赖进口，且价格居高不下。SAM和GSH的生产方法有化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中化学合成法由于具有过程复杂、耗时的缺陷，限制了其工业化应用。酶法合成SAM和GSH具有产物纯度高，易提取等优点，但原料ATP价格昂贵成为酶法合成SAM和GSH的限制性因素。目前酵母发酵法被认为是SAM和GSH生物合成最有潜力的方法，然而对于发酵法生产SAM和GSH的已有研究大都集中在其中一种产物的生产上。事实上，由于SAM和GSH均是酵母细胞含硫物质代谢网络中的重要节点物质，二者在合成过程中存在着复杂的关联。值得注意的一点是在SAM的分解代谢过程中会通过转硫作用合成L-半胱氨酸，为GSH的合成提供重要前体从而促进了 GSH的合成。近年来，利用一种微生物菌株发酵联产SAM和GSH也逐渐引起了研究者的广泛关注。在“5·-腺苷硫氨酸和谷胱甘肽联产发酵的环境条件”(《生物加工过程》2011年3月第9卷第2期，第23 28页)一文中，公开了采用产朊假丝酵母util is CCTCCM 209298)进行发酵培养联产SAM和GSH，并对培养条件进行了研究。在SAM和GSH的生物合成过程中，ATP作为限制性底物和能量物质，其作用不可替代，胞内ATP含量的多少决定着底物的转化效率以及SAM和GSH能否高效合成。有研究表明，适时向发酵液中添加适当浓度的外源ATP可以有效地促进SAM和GSH产量的提高。但是由于ATP价格昂贵，外源性ATP添加方式显然难以应用于SAM和GSH的工业化生产。因此寻找到一种ATP的替代性廉价物质，对于SAM和GSH产量的提高，乃至于SAM和GSH的工业化生产无疑具有重要意义。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，通过对方法的改进，以较低的成本提高SAM和GSH的联产量。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，采用产朊假丝酵母保藏号CCTCC M 209298)菌株，经种子培养后，发酵培养18至30小时，再从发酵液中提取获得腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，在发酵培养开始的O 15小时内，向培养液中添加柠檬酸钠，每升培养液中加入2 10克朽1檬酸钠。优选的技术方案，在发酵培养开始的15小时，向培养液中添加朽1檬酸钠，每升培养液中加入2克柠檬酸钠。上述技术方案中，发酵培养的接种量为5 10%，发酵温度28 32°C，搅拌转速300 400 rpm,通气量 3. O 4. O L/min, pH 为 5. O。优选的技术方案，发酵培养时间为24 30小时。由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
I.本发明采取外源性添加廉价的柠檬酸钠的方式，在没有额外添加其他前体氨基酸的情况下进一步提高了 SAM和GSH联产产量，使在好氧发酵过程中间接提高胞内ATP的水平成为可能。2.本发明为SAM和GSH联产发酵过程的优化增添了新的途径，为SAM和GSH的产业化生产提供了技术依据，也为类似耗能合成化合物的过量合成提供了新的思路。
图I是实施例五中联产发酵过程中SAM和GSH的变化结果图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一一种5·-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，采用产朊假丝酵母菌株，经种子培养和发酵培养，从发酵液中提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽。其具体方法如下
Cl)菌株
产朊假丝酵母uti I is) CCTCC M 209298，苏州大学工业微生物实验室筛选
并保存。(2)培养基
斜面及种子培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，pH 6.0 ；
发酵培养基(g/L):蔗糖35，硫酸铵10，磷酸二氢钾12. 3，L-蛋氨酸4. 6，硫酸镁O. 05，pH 5. O。(3)种子培养
斜面种子活化4小时后接入装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30°C，摇床转速200 rpm，培养时间24小时。(4)分批发酵培养
新鲜种子培养液接种至5 L发酵罐(BI0TECH-5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司)中，装液量3 L，接种量10%，发酵温度30°C，搅拌转速350印111，通气量3.0 L/min, pH 5.0(通过自动流加3 mo I/L H2SO4和3 mo I/L NaOH溶液进行调节)，培养时间30小时。在发酵培养的O小时、6小时或15小时，向培养液中添加ATP (对比例)或柠檬酸钠，ATP添加浓度
O.2 mmol/L，柠檬酸钠添加浓度2 g/L或10 g/L。(5)酵母生物量的测定
以细胞干重(DCW)表示酵母生物量。取25 mL发酵液，3500 rpm离心10 min，蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70°C烘干至恒重。(6 )胞内GSH的提取及测定
发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，30°C下在40%乙醇溶液中处理2小时，离心取上清液作为待测样品。采用DTNB [5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法进行测定。(7 )胞内SAM的提取及测定
发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，4°C下用O. 35 mol/L稀硫酸处理2小时，离心，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤作为待测样品。采用HPLC法测定流动相为O. 5 mol/L甲酸铵溶液(pH 4.0)，流速0.8 mL/min，柱温25°C。(8 )胞内ATP的提取及测定
取5 mL发酵液，离心得到湿酵母细胞，将湿细胞重新悬浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，超声波破碎10 min，离心后得到的上清液作为待测样品，采用HPLC法检测ATP含量，流动相为PBS溶液，流速I mL/min，检测波长254 nm，柱温35°C。对比例一按照实施例一中所述发酵条件，分批发酵O小时添加O 0. 2 mmol/LATP的实验结果
细胞干重14· 47 14. 86 g/L ;SAM 产量270. I 296. 2 mg/L ;GSH 产量257. I
281.I mg/L ;SAM 和 GSH 联产产量:528. 8 562. 9 mg/L ;胞内 SAM 含量1. 96 I. 98% ;胞内 GSH 含量1. 78 I. 81%。
对比例二 按照实施例一中所述发酵条件，分批发酵15小时添加O O. 2 mmol/LATP的实验结果
细胞干重14· 47 14. 77 g/L ;SAM 产量270. I 360. 3 mg/L ;GSH 产量257. I 350. 9 mg/L ;SAM 和 GSH 联产产量:528. 8 701. 3 mg/L ;胞内 SAM 含量1· 96 2. 39% ;胞内 GSH 含量1. 78 2. 35%。实施例二 按照实施例一中所述发酵条件，分批发酵O小时添加2 10 g/L柠檬酸钠的实验结果
细胞干重14. 01 14. 27 g/L ;SAM 产量329. 7 344. O mg/L ;GSH 产量269. 4 310. 3 mg/L ;SAM 和 GSH 联产产量:582. 5 636. 3 mg/L ;胞内 SAM 含量2. 23 2. 41% ;胞内 GSH 含量1. 91 2. 33%。实施例三按照实施例一中所述发酵条件，分批发酵6小时添加2 10 g/L朽1檬 酸钠的实验结果
细胞干重13· 93 14. 20 g/L ;SAM 产量310. 7 328. 6 mg/L ;GSH 产量270. O 301. 5 mg/L ;SAM 和 GSH 联产产量:588. 6 607. 3 mg/L ;胞内 SAM 含量2. 01 2. 42% ;胞内 GSH 含量:2· 05 2. 32%。实施例四按照实施例一中所述发酵条件，分批发酵15小时添加2 10 g/L柠檬酸钠的实验结果
细胞干重14· 02 14. 33 g/L ;SAM 产量308. 4 331. 5 mg/L ;GSH 产量281. 8 344. 6 mg/L ;SAM 和 GSH 联产产量:571. 4 663. 9 mg/L ;胞内 SAM 含量2. 44 2. 55% ;胞内 GSH 含量2. 06 2. 47%ο实施例五按照实施例一所述发酵条件，分批发酵15小时添加2 g/L柠檬酸钠，检测培养过程中SAM和GSH的变化，结果如图I所示。从上述实施例和对比例中可以看出本发明通过在联产发酵过程中添加外源物质ATP和柠檬酸钠，实现了 SAM和GSH联产量的进一步提高；与添加ATP相比，添加柠檬酸钠更加有利于胞内SAM和GSH含量的提高。
权利要求
1.一种S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，采用产朊假丝酵母山 保藏号CCTCC M 209298)菌株，经种子培养后，发酵培养18至30小时，再从发酵液中提取获得腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，其特征在于在发酵培养开始的0 15小时内，向培养液中添加柠檬酸钠，每升培养液中加入2 10克柠檬酸钠。
2.根据权利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，其特征在于在发酵培养开始的15小时，向培养液中添加朽1檬酸钠，每升培养液中加入2克朽1檬酸钠。
3.根据权利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，其特征在于发酵培养的接种量为5 10%，发酵温度28 32°C，搅拌转速300 400 rpm,通气量3. 0 4. 0 L/min, pH 为 5. O。
4.根据权利要求I所述的S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，其特征在于发酵培养时间为24 30小时。
全文摘要
本发明公开了一种S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽联产发酵方法，采用产朊假丝酵母(Candidautilis，保藏号CCTCC M209298)菌株，经种子培养后，发酵培养18至30小时，再从发酵液中提取获得S-腺苷-L-蛋氨酸和谷胱甘肽，其特征在于在发酵培养开始的0～15小时内，向培养液中添加柠檬酸钠，每升培养液中加入2～10克柠檬酸钠。本发明采取外源性添加廉价的柠檬酸钠的方式，在没有额外添加其他前体氨基酸的情况下进一步提高了SAM和GSH联产产量，使在好氧发酵过程中间接提高胞内ATP的水平成为可能。
文档编号C12R1/72GK102776258SQ201210285900
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者卫功元, 王大慧, 王玉磊 申请人:苏州大学