专利名称：天山雪莲sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到sikRbcS2基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗寒效果进行 评价，增加植物的抗寒性能。
背景技术：
低温是危害农业生产的主要自然灾害之一。低温胁迫可使植物光合作用降低，呼 吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，植物处于饥饿状态，严重影响了植物的 正常生长发育，甚至导致死亡(郭子武，李宪利等，植物低温胁迫响应的生化与分子生物学 机制研究进展，中国生态农业学报，2004，12 (2) 54-57)。提高植物的抗寒性是科技工作者亟待解决的问题。从18世纪末开始，许多科学 工作者对植物抗寒冻害机理进行了研究，相继提出了 “生理干旱”、“饥饿”、“代谢失调”、“毒 物积累”和“膜脂相变”等假说(马建忠.膜脂与植物的抗寒性[J].生物技术通报.1997， (2) 6-9)，至20世纪下叶，随着分子生物技术的发展，对植物寒冻害及抗寒冻机理的研究 进一步深入，并分离和鉴定了植物抗寒冻相关基因(马建忠.植物的冷诱导基因[J].农业 生物技术学报.1996，4(1) :8-14)。低温对植物细胞中多种酶活性有着明显的影响。至于共影响的机制， Guy (Guy GL.Cold acclimationand freezing stress tolerance :role of protein metabolism[J]. Ann Rev Plant Physiol. 1990，41 :187-223)认为可能是由于其三级或四 级结构的破坏，明显地改变了 PH值和离子强度，类囊体膜的蛋白质释放出来造成膜酶复合 物的解离或者通过分子间的聚集(如形成二硫链)而导致酶与蛋白钝化。当组织结冰脱水 时，巯基(-SH)减少，而二硫键(-S-S-)增加。二硫键是由于蛋白质分子内部失水或相邻蛋 白质分子的巯基失水而形成的。当解冻再度失水时，肽链松散，氢键断裂，但-S-S-键还保 存，肽链的空间位置发生变化，蛋白质分子的空间构象改变，因而蛋白质结构被破坏，进而 弓I起细胞的伤害禾口死亡(Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stress [M]. New York =Academic Press. 1972，697)。例如，C4植物光合过程中的关键酶丙酮酸磷酸双 激酶在低温条件下由四聚体变为二聚体，导致活性丧失；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，在低 温下发生构像的可逆变化，使其内部疏水基外露，导致功能丧失。另外，有许多研究表明，低 温也可通过影响酶的数量以及同功酶谱等来影响其活性(沈曼，王明麻，董敏仁.植物抗寒 机理研究进展[J].植物学通报.1997，14(2) :1-8)。这些冷感酶类经冷驯化后，其敏感性 降低，活性增加，抗寒冻性也不同程度提高(Schaffer MA,Fischer RL. Analysis of mRNAs thataccumulate in response to low temperature identifies a thiolprotease gene in Tomato [J], Plant Physiol. 1988，87 :431_436)。还有一些酶类在寒冻过程中，可以通过 变构调节正向调控其动力学行为，以达到克服低温的钝化作用。Rubisco (1，5-二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶，ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是光合碳代谢中的关键酶，催化1，5_ 二磷酸核酮糖和CO2生成二分子3-磷酸甘油酸反应的酶，亦称羧基歧化酶，可由Mg离子的存在被激活。1，5- 二磷酸核 酮糖羧化酶/加氧酶是光合作用中固定CO2的酶，是催化卡尔文循环中的CO2固定的第一步 反应Rubp和CO2反应生成3-磷酸甘油酸；该酶也同时催化光呼吸作用的第一步，使Rubp 和O2反应生成3-磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。处于光合碳还原和光合碳氧化这两个方向相 反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作用和光呼吸的代谢比例，它对净光合速 率起者决定性的影响，是光合碳同化的关键酶。其活性大小对光合速率起着决定性作用。在 所有自养性生物中都有所发现。作为新疆的特色植物，新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)，又名天 山雪莲、雪莲花等。属菊科凤毛菊属，主要生长于海拔2400 4100m的高山草甸、高山冰碛 石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温 3 5°C，最低月平均温-19 -21 °C，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。天山雪莲经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了 适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应 答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植 物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。
发明内容
本发明的一个目的是为植物抗寒育种提供有价值的Rubisco基因sikRbcS2，其发 明的目还在于构建植物表达载体PCAMBIA2301-SikRbcS2，在转基因植物中得到表达，提高 转基因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫性能得到提高，最终获 得抗(耐)低温能力明显增强的植物。本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆sikRbcS2基因，其序列为<210>1。本发明的从天山雪莲中克隆sikRbcS2基因的过程如下以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用RPl其序列为<210>2和RP2其序列 为<210>3为引物进行扩增，得到目的基因；sikRbcS2基因植物表达载体构建构建植物表达载体pCAMBIA2301_sikRbcS2 ；利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植 物转sikRbcS2基因烟草进行低温处理后光化学效率分析，可分成三个等级(高，中， 低)，这与sikRbcS2基因插入烟草基因组中不同位置有关，导致基因的表达量有所不同，引 起低温处理后光化学效率有所不同。其光化学效率并不是和温度直接相关。转sikRbcS2基因烟草从室温降至0°C的过程中，转基因烟草和对照烟草的电导率 差异较小(1%左右)；当温度降至0°c，转sikRbcS2烟草电导率低于对照烟草7%;在-2°c 时，转sikRbcS2烟草电导率则低于对照烟草92%。转sikRbcS2基因烟草在低温下表现出 极强的抗性，提高植物的光合作用，提高植物的抗寒性。本发明不仅得到天山雪莲Rubisco基因sikRbcS2，而且将其构建成的植物表达载 体，在转基因植物中研究了该基因在提高植物耐低温性能中的重要功能。这对于揭示雪莲 的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，提高植物的耐低温能力，具有重要的意义。
图 1 是天山雪莲 sikRbcS2 基因 PCR 扩增图 Figl :sikRbcS2gene PCR amplified图 2 是 pUCm-sikRbcS2 酶切鉴定图 Fig2 =Restriction enzyme digestion identification of pUCm_sikRbcS2图 3 是 pCAMBIA1301-sikRbcS2 PCR 鉴定 Fig3 :PCR identification of pCAMBIA1301-sikRbcS2图 4 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 PCR 鉴定 Fig4 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS图 5 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 酶切鉴定 Fig5 =Restriction enzyme digestion identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2图 6 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 转化 AGL1PCR 鉴定 Fig6 :PCR identification ofpCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl图 7 是 pCAMBIA2301-sikRbcS2 转化烟草 PCR 检测 Fig7 :PCR identification of pCAMBIA2301-sikRbcS2transformed tobacco图 8 是转基因烟草 RT-PCR 分析 Fig8 :RT-PCR analysis on transgenic tobacco图9是温度处理对不同烟草Fv/Fm的影响，图中数据为三个重复的平均值 + S. EFig 9 :Effect of temperature treatment on the Fv/Fm in different tobacco, Resultasmeans士S. Ε. (η = 3)图10 是sikRbcS2基因转化烟草叶片相对电导率的测定FiglO =Relative conductivity of tobaccoleaves图11是天山雪莲sikRbcS2植物表达载体pCAMBIA2301_sikRbcS2的构建流程 1 中1,2 :sikRbcS2 ；3 阴性对照；M =Marker图2 中1,2 :pUCm-sikRbcS2 ；3 :plasmid ；M =Marker III ；图 3 中1 阴性对照；2-4 :pCAMBIA1301-sikRbcS2 ；M =Marker III图 4 中1 阴性对照；2-4 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker III图 5 中1 jplasmid ；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 ；M =Marker图 6 中1 阴性对照；2-6 :pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl ；M =Marker图7 中1 :Negetive control ；2 :positive control ；3-12 :Transgenic tobacco ；M MarkerIII图 8 中1 阴性对照；2-5 :pCAMBIA2301-sikRbcS2 转化烟草；M =Marker
具体实施例方式实验所涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为上海生工公司生产；LA PCRTM in vitro CloningKit 购自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 连接酶(T4-DNA ligase)、 Marker,TRNzol总RNA提取试剂购于TIANGEN公司；限制性内切酶为Fermentas公司原装； 抗生素购自上海Sangon公司。实施例1 天山雪莲cDNA文库单克隆质粒的提取取天山雪莲cDNA文库单克隆保存的甘油管于IOmlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振荡培养过夜。蘸取菌液于LB固体培养基(Cm 50 μ g/ml)平板上划线培 养，37°C暗培养12-16hr。挑取单克隆于20mlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振荡培养14hr，提取质粒，具体方法如下1)将菌液分装于1. 5ml Ep管，12000rpm离心3min，弃上清液；2)加入400ml STE溶液，重悬，12000rpm离心3min，弃上清液；3)沉淀用150 μ L碱裂解溶液I重悬，混勻；4)加入新鲜配制的300 μ L碱裂解溶液II，轻轻混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L碱裂解溶液III，轻轻混勻，冰上放置5min ；离心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等体积三氯甲烷，充分混勻，室温放置5min ；离心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入两倍体积无水乙醇约为850 μ L，-20°C放置 IOmin ；离心(12000rpm, 5min)；8)弃去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C温育 30min。实施例2 从天山雪莲中克隆到sikRbcS2基因以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用RPl其序列为<210>2和RP2其序列为 <210>3为引物进行扩增，得到目的基因；同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。RPl 为<210>2
5 ‘ ttatcagtcgaaggtacgg3'
RP2 为<210>3
5' gctttctagaccattcgttggcgcg 3'
PCR反应体系(20 μ 1)为:
10XPCR Buffer2. 0μ 1
dNTPs(各 2. 5mM)0. 5μ 1
MgC12(25mM)1. 0μ 1
上游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase (2. 5U,/μ 1) 0. 3ul
ddH2014. 7μ 1
Total20. 0μ 1PCR 反应程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，68°C复性 120s，30cycles ；72°C 延伸IOmin ；4°C保温。PCR反应结束后，产物经浓度为1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用上海生工 的琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书方法分别回收目的基因，得到的目的片段命名为 sikRbcS2。如图1所示。实施例3 构建sikRbcS2基因植物表达载体构建植物表达载体pCAMBIA1301-sikRbcS2和 pCAMBIA2301_sikRbcS2。将 PCAMBIA1301 和 pCAMBIA2301 的 E. coli DH5 α 用 Nco I/BstE II 分别双酶切植物表达载 体，获得载体片段。回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行体外连 接，经鉴定正确的重组质粒分别命名为pCAMBIA1301-sikRbcS2和pCAMBIA2301_sikRbcS2。 在本实施方案中，我们选用烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。在本实施方案中，sikRbcS2基因和pCAMBIA2301构成植物表达载体，用于植物的 转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了 PCAMBIA2301之外，还 可以选用其他植物表达载体。如图3、4、5所示。实施例4 农杆菌的转化4. 1农杆菌感受态的制备1)从新鲜的AGLl平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振荡培养 48hr ；2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液体培养基中 活化培养至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分装菌液于1.5ml离心管，于4°C，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细 胞；4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0. 05mol/LCaCl2重悬，4 °C，8000rpm离心 5min ；5)弃上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重悬细胞，保存于_70°C。4. 2植物表达载体转化根癌农杆菌AGLl (冻融法)1)吸取10 μ 1上述重组载体质粒(约0. 5 μ g/ μ 1)，与75 μ 1 AGLl感受态细胞轻 轻混勻，冰浴30min，然后液氮冻存5min ；2)迅速置于37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液体 LB 培养基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振荡培养 5hr ；4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500 μ 1液体培养 基，剩余100 μ 1重悬细胞；5)将菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固体 LB 培 养基平板上，28°C培养24-48hr。4. 3阳性克隆筛选挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为 pCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl。在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转 化植物。如图6所示。实施例5 烟草遗传转化及再生本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各 种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农 杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用于转化的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好使被转化的序列稳 定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶 植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。5. 1农杆菌浸染液的制备1)从_70°C保存的含有PCAMBIA2301-sikRbcS2-AGLl农杆菌甘油管中挑取菌块， 接种于 5ml 附加有 Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml 的 LB 液体培养基中，28 °C， 200rpm振荡培养约30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液体培养基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀释，28°C，200rpm 振荡培养约 4hr ；3)活化的菌液培养至OD6tltl = 0. 4-0. 6时，即为转化用的浸染液。5. 2 浸染1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成Icm2大小的方 块，放入菌液中，振荡浸染IOmin ；2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；3)在共培养基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶 盘均勻地摆放在滤纸上；在26°C暗培养条件下共培养2-3天。5. 3抗性愈伤组织筛选及出芽诱导将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每15-20天转接一次，转接
1-2次以后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。5. 4转化植株的生根培养和移栽待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养。转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植 株，去除封口膜，室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭 石腐质土 = 2 1)中，26 ，16^40μπιΟ1 · πΓ2 · s—1光照，70 %相对湿度条件下培养，前
2-3天需遮阴、避光、保湿。实施例6 转基因烟草的分子检测6. 1转基因烟草的PCR鉴定6. 1. 1 烟草 DNA 的提取(SDS 法)1)取0. Ig新鲜叶片，用玻棒在1. 5ml离心管内充分研磨；2)加入400 μ 1提取缓冲液，充分混勻，12000rpm离心5min ；
3)小心吸取300 μ 1上清液，加入300 μ 1异丙醇，室温沉淀20min, 12000rpm离心 lOmin，收集沉淀；4)将沉淀充分风干，加400 μ 1 TE溶解沉淀；5)加入400 μ 1氯仿/异戊醇(24/1)，充分混勻，静置20min，12000rpm离心 IOmin ；6)小心吸取上清，加入40 μ 1 3丽aAC(pH5. 2), 800 μ 1无水乙醇，_20°C沉淀过夜；7)4°C，12000rpm 离心 15min，弃上清；8) 70%酒精洗涤两次，吹干后用30 μ 1 ddH20溶解。6. 1.2转基因烟草的PCR鉴定以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用RP3其序列为<210>4和RP4其序列为 <210>5为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施 例2。如图7所示。6. 2转基因烟草的RT-PCR检测6. 2. 1待检测植株总RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草 总 RNA 1)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均 使用0. 1 %的DEPC处理，高压灭菌；2)取植物幼嫩叶片约0. Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状；3)将粉末分装至1. 5mL的小离心管中，加入Iml的TRNzol提取试剂，充分快速混 勻，室温放置3-5min。4) 10000rpm，4°C离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡 混勻；5) 10000rpm，4°C离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600 μ 1预冷 的异丙醇，于_20°C沉淀30min ；6) IOOOOrpm,4°C离心IOmin后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为 总 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30 μ 1 ddH20 (DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。6. 2. 2cDNA 第一链的合成在DEPC 处理的 0. 2ml 离心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1μ l,ddH20 5μ 1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在离心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反转录酶 0. 5 μ 1，42°C lhr,95°C 5min 后，冷却至 4°C。7. 2. 3cDNA第二链的合成及扩增在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 补足至 20 μ 1，反应条件同实施例2。如图8所示。实施例7 光化学效率的测定Fv/Fm是重要的荧光参数之一，习惯上称其为PS II最大光化学效率，它是暗适应下PSII反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映了 PS II反应中心最大光能转换效 率。在非胁迫条件下，Fv/Fm的值很稳定，但在逆境条件下，Fv/Fm显著降低。因此，Fv/Fm 的降低常作为发生光抑制或PSII遭受伤害的指标。本试验采用Dual-pamlOO仪器测定，如 图9所示。
0138]实施例8 转基因植株的模拟寒害处理及叶片质膜透性测定
0139]转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成 舌后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行模拟寒害处理。分别用打孔器从叶片中打取小圆 片测定叶片质膜透性。如图10所示。
0140]序列表
0141]<110>石河子大学
0142]<120>天山雪莲sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的应用
0143]<160>3
0144]<210>1
0145]<211>965
0146]<212>DNA
0147]<213> 天山雪莲(Saurrea. involucrata Kar. et Kir.)
0148]<220>
0149]<221>5， UTP
0150]<222>(1). . . (142)
0151]<220>
0152]<221>CDS
0153]<222>(143). . . (563)
0154]<220>
0155]<221>3， UTP
0156]<222>(564). . . (965)
0157]<400>1
0158]Translation of DNAMAN2(143-563)
0159]Universal code
0160]Total amino acid number :140, MW = 35075
0161]Max ORF starts at AA pos 47(may be DNA pos 143)for 140 AA(420bases), MW = 15631
0162]1 gagcgaagaa agcggccgca taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcagtcga
0163]61 cggtacggga catatgcccg ggaattcggc cattacggcc ggggggattt gcaaaggcta
0164]130140 150 160170179
0165]120 ccctttaaag caaaattacc aaa atg gcc tcc ate tcc tcc tcc gcg gta gcc acc gtc
0166]40MET Ala Ser lie Ser Ser Ser Ala Val Ala Thr Val
0167]190200 210220230239
0168]180 aac egg tcc gcc tcc get caa gcc aac atg gtg get cca ttt acc ggc ctc aag tcc aac
0169]60 Asn Arg Ser Ala Ser Ala Gln Ala Asn MET Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn
0170]250260 270 280 290 299
100171]240gtcgccttc ccagttacc aagaaggcc aacgacttttcctcc cttCCCage aac0172]80ValAlaPhe RroValThr LysLysAla AsnAspPheSerSer LeuRroSer Asn0173]3103203303403503590174]300agagttcag tgcatgaag gtgtggcca ccaCttggattgaag aagtacgag act0175]100ArgValGln CysMETLys ValTrpRro RroLeuGlyLeuLys LysTyrGlu Hir0176]3703803904004104190177]360tacctaccc ccattaagt gaagcatcg ttggccaaggaagtg gactactta ttc0178]120TyrLeuRro RroLeuSer GluAlaSer LeuAlaLysGluVal AspTyrLeu Phe0179]4304404504604704790180]420aaatgggtt CCttgcttg gaattcgag ttggagcacggtttc gtgtaccgt gag0181]140LysTrpVal RroCysLeu GluPheGlu LeuGluHisGlyPhe ValTyr Arg Glu0182]4905005105205305390183]480teatccctg gatattatg acggaagat actggacaatgtgga agttgccta tgt0184]160SerSerLeu AsplieMET IhrGluAsp ThrGlyGlnCys Gly SerCysLeu Cys0185]550560570580590600
ggt gga Gly Gly
ctt tcg Leu Ser
cgc aac Arg Asn
cac aac His Asn
tcg ggt Ser Gly
0186]540 gca ctg att ccg ccc agg tgt tgaaggagct tgaagagtgc aagaaggagt acccgaacgc
0187]180 Ala Leu lie Pro Pro Arg Cys * * *
0188]610620630640650 6600189]601cttcgtccgtattatcggattggacaacgttcgtcaagtccagtgtgtgagtttcatcgc0190]661tgccaagccaccaggttattaagcaatttatcaacaattttgttttaatcCCgggtCggg0191]721tcgggtttgtttgaatctttagggtttttcatcaatttttttttttttatattgggattt0192]781cgtcaatttaatttcatgtccatttccttgttcattcctgaatttttatgagggggataa0193]841aaagatatca ￡Ι ￡Ι ￡1￡1￡1￡Ι aataatttgtCSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL0194]901acagtcggccgcctcggccctcgagaagctttctagaccattcgttggcgcgcgacccag0195]961agagg
0196]<210>2
0197]<211>20
0198]<212>DNA
0199]<213>人工序列
0200]<400>2
0201]gttatcagtcgaaggtacgg
0202]<210>3
0203]<211>25
0204]<212>DNA
0205]<213>人工序列
0206]<400>3
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<212>DNA<213>人工序列<400>4ggcctccatctcctcctccgcg<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5actgattccgcccaggtgttga
权利要求
一种从天山雪莲中克隆sik RbcS2基因，其特征在于该基因全长965bp，其序列为<210>1，编码区420bp，编码139个氨基酸，5’非编码区142bp，3’非编码区402bp。
2.一种利用上述基因sik RbcS2基因构建的植物表达载体。
3.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sik RbcS2基因的用途，其特征在于利用上 述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗寒转基因植物。全文摘要
本发明涉及一种天山雪莲sikRbcS2基因在培育抗寒植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆sikRbcS2基因，利用上述基因构建植物表达载体pCAMBIA2301-sikRbcS2，遗传转化获得抗寒逆转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆sikRbcS2基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物抗低温胁迫的性能得到提高，最终获得抗寒逆能力明显增强的植物。
文档编号C12N15/82GK101899459SQ20091011359
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者孙建富, 张煜星, 王爱英, 祝建波 申请人:石河子大学