专利名称：：天山雪莲sikLTP基因在培育抗逆植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(SaussureainvolucrataKar.etKir)中克隆得到sikLTP基因，构建植物表达载体，转化植物，并对植物抗寒、抗旱和抗虫效果进行评价，增加了植物的抗逆性能。
背景技术：
：LTP即脂质转移蛋白(Lipidtransferprotein)，是一类小的Cysteine-richlipid-binding蛋白(Jian-XunFENG,Sheng-JianJI,AnalysisofFiveDifferentiallyExpressedGeneFamiliesinFastElongatingCottonFiber,ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2004,36(1):51-56)，具有在细胞膜内外转移磷脂的能力。植物中的LTP具有共同的结构和功能性质分子量较低(大约为9-lOkDa)(Ζ.S.Gao·W.Ε.vandeffeg*J.G.Schaart,I.M.vanderMeer*L.Kodde*M.Laimer,LinkagemappositionsandallelicdiversityoftwoMal(non-specificlipidtransferprotein)genesinthecultivatedapple(Malusdomestica),TheorApplGenet,2005,110:479-491)(F.Chen·Μ.R.Foolad,Nucellar-cell-specificexpressionofalipidtransferproteingeneinbarley(HordeumvulgareL.)，PlantCellR印orts，1999，18:445-450)、高等电点、存在7-8个Cysteine残基、具有90_93个氨基酸、位于保守位点并形成4个二硫桥、表达具有专一性(MariangelaS.S.Diz,AndreO.CarvalhoandValdireneΜ.Gomes,PurificationandmolecularmassdeterminationofalipidtransferproteinexudedfromVignaunguiculataseeds,Braz.J.PlantPhysiol,2003,15(3):171_175)0LTP具有4个α螺旋(α-helice)和一个C端，由4个二硫键所稳定，并具一个内陷的疏水腔，LTP运输磷脂分子时就是磷脂分子的疏水脂肪链尾嵌入LTP的疏水。LTP的这一特点恰好适于转运磷月旨功能(KrestenLindori-Larsen,JakobR.ffinther,Surprisinglyhighstabilityofbarleylipidtransferprotein,LTP1,towardsdenaturant,heatandproteases,FederationofEuropeanBiochemicalSocieties,2001,488:145-148),LTP在膜之间进行磷脂转运比较公认的模式是LTP与磷脂形成LTP磷脂复合体。LTP对酰基链的强烈结合作用，及LTP空间结构已表明有一疏水腔，LTP正好以其疏水腔容纳磷脂分子的一个酰基链，而不是整个磷脂分子。磷脂分子的两个酰基链同LTP的作用是一个强一个弱，这有利于当LTP携带磷脂分子到达膜表面时，进行磷脂的交换。LTP能够在生物膜之间转运磷脂，参与了细胞内生物膜形成，近期的研究又发现LTP具信号肽，可从细胞内分泌到细胞外，位于细胞壁上，因而又对其在细胞内的转运脂质能力产生疑问。而有证据表明LTP参与了角质与腊质的形成、植物的抗病反应和植物对环境变化(温度、盐、干旱协迫)(张明永，梁承邺，植物脂质转运蛋白的研究进展，生物化学与生物物理进展，2000,27(3):244-247)的适应。Hany(HanyΑ.Μ.Sror,a,GilbertTischendorf,Cryoprotectinprotectsthylakoidsduringafreeze-thawcyclebyamechanisminvolvingstablemembranebinding,Cryobiology,2003,47:191-203)等人发现，LTP虽然在菠菜的抗寒中通过与类囊体膜结合，稳定膜结构从而增加了菠菜的抗寒性。LTP的定位研究提供了LTP可将酰基单体转运到细胞外的证据，从而认为LTP参与了腊质(wax)和角质(cutin)的形成(JohanEdqvist,IsabelleFarbos,Characterizationofgermination-specificlipidtransferproteinsfromEuphorbialagascae，Planta，2002，215:41-50)。这一假设可从LTP是花椰菜叶表面腊质中一种主要的蛋白质，并且LTP基因主要在周边细胞及幼胚中表达得到证实。LTP的向外分泌功能与体胚发生的联系可解释为它可能参与了幼胚外保护层的形成。最近的研究还表明LTP参与了植物的抗病反应，是一种植物的抗病蛋白，纯化的植物LTP蛋白在体外可抑制细菌及真菌的生长(SubhankarRoy-Barman,ChristofSautter,ExpressionofthelipidtransferproteinAce-AMPIintransgenicwheatenhancesantifungalactivityanddefenseresponses,TransgenicRes,2006,15=435-446)LTP参与植物抗病的机制却不明确，一种观点认为它可能作为一种极性蛋白质影响了真菌的细胞膜。洋葱的一种抗病蛋白与LTP有同源性，但它不表现在转运脂质的功能。还有研究表明，LTP的表达受环境因子影响，如温度、盐和干旱协迫可诱导LTP基因的表达。NaCl、甘露醇、脱落酸(ABA)处理蕃茄可诱导LTP基因在茎的表达，大麦、棉花的LTP基因则可由低温和ABA诱导表达。它们在逆境协迫下的表达同植物的抗逆性有关。LTP除了具有以上功能外，S.Gorjanovic等人发现大麦中的LTP还扮演着一个重金属清道夫的角色(S.Gorjanovic.D.Sunjevic.M.Beljanski,Barleylipid-transferproteinasheavymetalscavenger,EnvironChemLett,2004(2):113-116),以及LTP$±曾与虽胃iffllfill白勺CJeroenNieuwland,RichardFeron,etal,LipidTransferProteinsEnhanceCellWallExtensioninTobacco,ThePlantCell,2005,7(17)2009-2019)等方面具有作用。国内对LTP基因的研究相对较少。葛晓春(葛晓春，陈继超，水稻非特异性脂质转移蛋白的原核表达、纯化及抑菌功能，生物化学与生物物理学报，2002,34(1)83-87)等人在国内首先克隆得到了两个水稻的LTP，并且对LTP的脂质结合活性以及对水稻病原真菌稻瘟病菌作了活性测定和抑菌实验。证明LTP确实具有结合脂肪酸分子的特性以及LTP浓度在13;3mg/L时能够明显抑制水稻病原真菌稻瘟病菌的生长。新疆雪莲(SasussuredinvolucrateKar.etKir.)为多年生一次性开花结实的高山草本植物，主要分布在MOO4000m的高原寒带地区，其境特异，最高月平均温度35°C，最低月平均温度1921°C。与一般抗寒植物不同，雪莲在极端低温下通过积极的生命活动来适应严寒，在雪中能旺盛生长并且开花。具有极强的耐寒、抗辐射、抗风沙、抗缺氧的能力，是天山雪线以上的惟一大型高等植物。雪莲长年生长在极端环境下，决定了其具有许多特殊的抗逆功能基因，其表达产物可能在逆境条件下，具有更好的稳定性和更好的活性功能。我们从天山雪莲中得到了SikLTP基因，其序列为<210>1，基因全长620bp，5，非编码区有49bp，3，非编码区有19!3bp。最大开放阅读框为378bp，编码125个氨基酸。编码的氨基酸中有11个半胱氨酸，它们之间可形成多个二硫键，约占到总氨基酸数量的10%，这在LTP基因家族中较为少见。与拟南芥的LTPlike,proteaseinhibitor和seedstorage的氨基酸序列比对后发现，与他们的相似性均很差，其相似性在10.94%-17.46%之间。利用在线信号肽分析软件SignalP3.OServer分析，其中前23个氨基酸组成信号肽区域，其可能使表达蛋白分泌至胞外，涉及到细胞膜组分的改变。DNAMAN软件对sikLTP基因的氨基酸的亲水性进行了分析发现天山雪莲LTP是明显的疏水性蛋白，这与前人报道的LTP是碱性的可溶性蛋白不相吻合。将其氨基酸序列在NCBI比对，发现该基因与Blackcottonwood(Populustrichocarpa)在进化上同源性最高。构建植物表达载体，转化植物，并对植物抗寒、抗旱和抗虫效果进行评价，sikLTP基因增加了植物的抗逆性能。
发明内容本发明的一个目的是为植物抗逆育种提供有价值的脂质转移蛋白基因sikLTP，其发明的目还在于构建植物表达载体pBin438-sikLTP，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性、抗旱性和抗虫性，通过该基因的过量表达，使植物的抗逆胁迫性能得到提高，最终获得抗寒性、抗旱性和抗虫性能力明显增强的植物。本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆sikLTP基因，其序列为<210>1。本发明的从天山雪莲中克隆sikLTP基因的过程如下以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用CPl其序列为<210>2和CP2其序列为<210>3为引物进行扩增，得到目的基因；sikLTP基因植物表达载体构建构建植物表达载体pBin438-sikLTP；利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物以未转化烟草植株叶片为对照，转基因株系在模拟抗寒胁迫3小时后，与未转基因株系相比，从室温降至o°c的过程中，转基因烟草和对照烟草的电导率差异很小，仅相差0.5%左右。但当温度降至-2-4°C，转sikLTP烟草电导率明显低于对照烟草。且在-4°C时，转基因烟草的电导率比对照烟草的电导率低近一倍。这表明转基因烟草在-2-4°C时，未转基因烟草叶片细胞已经不能耐受低温，细胞膜破裂，内容物溢出，导致电导率上升，而转基因烟草叶片细胞能够耐受低温，电导率并未出现大的变化，较对照烟草表现出了极强的耐寒能力。当温度低于-4°C时，无论是转sikLTP基因烟草，还是对照烟草，其电导率均超过50%以上，此时表明细胞膜完全被破坏，细胞内容物释放出来，因而电导率迅速升高。对转sikLTP基因烟草和对照烟草的油酸和亚油酸的相对含量计算后对比分析发现从正常室温条件降至6°C的过程中，转基因烟草和对照烟草中的油酸和亚油酸的相对含量的变化趋势较为平缓，几乎没有很大的波动。转基因烟草中的油酸和亚油酸的相对含量稍高，且亚油酸的含量要高于油酸的含量。这可能因为转sikLTP基因烟草中，LTP蛋白转运磷脂使得细胞膜的膜相构成发生改变，不饱和脂肪酸的含量升高。当温度经4°C降至-3°C时，转基因烟草和对照烟草中的油酸和亚油酸的相对含量均有所增加，且在温度为0°C时，其油酸和亚油酸的含量增加到最大值，但对照烟草中两种不饱和脂肪酸的增加量不如转基因烟草明显。温度降至_4°C后，转基因烟草和对照烟草中的油酸和亚油酸的相对含量均出现回落。转sikLTP烟草在温度为4°C至_3°C时，具有较好的抗冷性。这与电导率测定得出的结果相同。转sikLTP烟草在4°C_3°C的低温范围内，具有较好的抗寒能力。转sikLTP基因烟草和对照烟草经5%的PEG6000模拟干旱胁迫3天后，其表型上观察发现，它们均出现了轻度的萎焉现象，很难发现二者有所差异。但从测定的组织相对含水量来看，对照烟草的相对含水量降低了30%左右，而转基因烟草的相对含水量仅仅降低了左右。且转基因烟草的相对含水量远高于对照烟草。表明转SikLTP基因烟草在轻度的干旱胁迫下，具有较强的抗旱能力。温室白粉虱通过刺吸烟草叶片的汁液造成烟草营养缺乏，叶片变黄，最后慢慢死去。转sikLTP基因的烟草上的白粉虱数量明显少于非转基因烟草。在非转基因的烟草叶片的正面和背面，均附着有大量的白粉虱，发病最轻的叶片当中，在约30cmX14cm大小的叶片上存在的白粉虱大约也有340只，严重时，其害虫密度达到3.89只/cm2(700只/[15cmX12cm])。而转sikLTP基因的烟草叶片上的数量明显较少。在最多的叶片上，其害虫密度也只有0.36只/cm2(80只/[25cmX9cm])，有些叶片上甚至根本没有白粉虱存在。目前，国内外对于sikLTP基因的抗虫性未有报道，烟草转sikLTP基因出现的抗温室白粉虱现象究其原因，可能是转sikLTP基因烟草的表面产生蜡质或角质使得白粉虱难以刺入。本发明不仅得到天山雪莲抗逆相关脂质转移蛋白基因sikLTP，而且将其构建成的植物表达载体，在转基因植物中研究了该基因在提高植物抗寒性、抗旱性和抗虫性性能中的重要功能。图1是天山雪莲pUCM-sikLTPPCR和酶切鉴定图Figl:TheamplificationandenzymedigestionofpUCM-sikLTP图2是天山雪莲sikLTP氨基酸同源性分析Fig2:ThehomologyanalysisofaminoacidofsikLTP图3是pBin438-sikLTPPCR鉴定Fig3:PCRidentificationofpBin438_sikLTP4^pBin438-sikLTPg|^^Fig4:TheenzymedigestionofpBin438-sikLTP图5是sikLTP转化烟草PCR检测Fig5:TheamplificationoftransgenictobaccoofsikLTP图6是sikLTP转基因烟草RT-PCR分析Fig6=RT-PCRanalysisonsikLTPtransgenictobacco图7是低温胁迫下烟草电导率测定Fig7:ThemeasurementofconductivityoftobaccounderLowtempreture图8是转sikLTP烟草低温下油酸含量测定Fig8:ThecontentmeasureofoleicacidoftransgenictobaccoofsikLTPunderlowtempreture图9是转sikLTP烟草低温下亚油酸含量测定Fig9:ThecontentmeasureoflinoleicacidoftransgenictobaccoofsikLTPunderlowtempreture图10是5%PEG6000胁迫下相对含水量变化FiglO:Thechangeofrelativewatercontentunder5%PEG6000stress图11是温室白粉虱侵害状况对比Figll:ThestatusofinfringementbygreemhousewhitefIy图12是植物表达载体是pBin438-sikLTP的构建流程图图1中1,2.SikLTP(PCR)3.NegativeΜ.MarkerIII4.sikLTP(BamHI/Sall)5.Plasmid图3中1.Negative2.pBin438_sikLTPΜ.MarkerIII图4中1,2:pBin438-sikLTP(BamHI/SalI)M.MarkerII图5中1-7.pBin438-sikLTP转化烟草8.NegativeΜ·MarkerIII图6中1-5.pBin438-sikLTP转化烟草6.NegativeΜ·MarkerIII具体实施例方式实验涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Tiangen公司生产；RNA酶、Taq酶、T4-DNA连接酶(T4-DNAligase)、Marker、TRNzol总RNA提取试剂购于Tiangen公司；BamHI、SalI等限制性内切酶为i^ermentas公司原装；IPTG、X-gal及抗生素购自上海Sangon公司；其他试剂及配制MS培养基的试剂均为国产分析纯。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。实施例1天山雪莲cDNA文库单克隆质粒的提取取天山雪莲cDNA文库单克隆保存的甘油管于IOmlLB液体培养基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振荡培养过夜。蘸取菌液于LB固体培养基(Cm50μg/ml)平板上划线培养，37°C暗培养12-16hr。挑取单克隆于20mlLB液体培养基(Cm50μg/ml)中，37°C220rpm振荡培养14hr，提取质粒，具体方法如下1)将菌液分装于1.5mlEp管，12000rpm离心3min，弃上清液；2)加入400mlSTE溶液，重悬，12000rpm离心3min，弃上清液；3)沉淀用150μL碱裂解溶液I重悬，混勻；4)加入新鲜配制的300μL碱裂解溶液II，轻轻混勻，至溶液清澈；5)加入225μL碱裂解溶液III，轻轻混勻，冰上放置5min；离心(12000rpm，5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等体积三氯甲烷，充分混勻，室温放置5min；离心(10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入两倍体积无水乙醇约为850μL，_20°C放置IOmin；离心(12000rpm,5min)；8)弃去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温吹干后溶于40μLTE(含RNaseA20μg/ml)溶液中，37°C温育30min。实施例2从天山雪莲中克隆到sikLTP基因以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用LPl其序列为<210>2和LP2其序列为<210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。LP1为<210>25'GGATCCkCClATGGCGACTCACTCCATCACTT3’BamHILP2为<210>35’GTCGACTTATTCGCACTTGAAGCCTGGT3’SalIPCR反应体系(20μ1)为:10XPCRBuffer2.0μ1dNTPs(各2.5mM)0.5μ1MgCl2(25mM)1.2μ1上游引物(25μΜ)0.5μ1下游引物(25μΜ)0.5μ1模板DNA(ddH20)0.5μ1TaqDNAPolymerase(2.5U/μ1)0.3μ1ddH2014.5ulTotal20.0μ1PCR反应程序为95°C预变性4min；95°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸45s，30cycles；72°C延伸IOmin；4°C保温。如图1、2。PCR反应结束后，产物经浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Tiangen的琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书方法分别回收目的基因，得到的目的片段命名为SikLTP0实施例3构建SikLTP基因植物表达载体构建植物表达载体PBin438-sikLTP。用BamHI/&ilI分别双酶切植物表达载体pBin438，获得载体片段。回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行体外连接，经鉴定正确的重组质粒分别命名为pBin438-sikLTP。在本实施方案中，我们选用烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。如图3、4。在本实施方案中，SikLTP基因和pBin438构成一个植物表达载体，用于植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pBin438之外，还可以选用其他植物表达载体。实施例4农杆菌的转化4.1农杆菌感受态的制备1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于、200rpm振荡培养48hr；2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen(50ug/ml)的LB液体培养基中活化培养至OD6tltl=0.5-0.8收集菌液，冰浴30min；3)分装菌液于1.5ml离心管，于4°C，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细胞；4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0.05mol/LCaCl2重悬，4°C，8000rpm离心5min；5)弃上清用75ul0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重悬细胞，保存于_70°C。4.2植物表达载体转化根癌农杆菌GV3101(冻融法)1)吸取10μ1上述重组载体质粒(约0.5μg/μ1)，与75μ1GV3101感受态细胞轻轻混勻，冰浴30min，然后液氮冻存5min；2)迅速置于37°C水浴anin；3)加入600μ1液体LB培养基(Rif+Gen)，28°C、200rpm振荡培养5hr；4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500μ1液体培养基，剩余100μ1重悬细胞；5)将菌液涂布在含有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml及Gen50μg/ml的固体LB培养基平板上，培养M-4ir。4.3阳性克隆筛选挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为pBin438-sikLTP-GV3101。在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化植物。实施例5烟草遗传转化及再生本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。5.1农杆菌浸染液的制备1)从_70°C保存的含有PBin438-sikLTP-GV3101的GV3101农杆菌甘油管中挑取菌块，接种于5ml附加有Kan50μg/ml,Rif50μg/ml,Gen50μg/ml的LB液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养约30h.；2)吸取200μ1菌液，再用20mlLB液体培养基(Kan50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen50μg/ml)稀释，28°C，200rpm振荡培养约4hr；3)活化的菌液培养至OD6tltl=0.4-0.6时，即为转化用的浸染液。5.2浸染1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成Icm2大小的方块，放入菌液中，振荡浸染IOmin；2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；3)在共培养基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶盘均勻地摆放在滤纸上；在暗培养条件下共培养2-3天。5.3抗性愈伤组织筛选及出芽诱导将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA2.Omg/L+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的烟草诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每15-20天转接一次，转接1-2次以后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。5.4转化植株的生根培养和移栽待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA0.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养。转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植株，去除封口膜，室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭石腐质土=21)中，26°C，16hr40μmol·πΓ2·s—1光照，70%相对湿度条件下培养，前2-3天需遮阴、避光、保湿。实施例6转基因烟草的分子检测6.1转基因烟草的PCR鉴定6.1.1烟草DNA的提取(SDS法)(1)称取植物幼嫩叶片约0.Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状。(2)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入800μ1的CTAB提取缓冲液，充分混勻，于65°C水浴20-30min。(3)将离心管冷却至室温后，加入400μ1的氯仿，充分混勻后，于10，OOOrpm离心5min。(4)吸取上清至另一离心管，加入1/10V的10%的CTAB和600μ1的氯仿，充分混勻后，10，OOOrpm离心5min。(重复一次)(5)吸取上层液体至另一离心管，加入1/10V的NaAC(pH5.2)和2V的预冷的无水乙醇，在_20°C沉淀IOmin。(6)10，OOOrpm离心IOmin后，倒掉液体，可在离心管底部看到白色胶状物质即为DNA。(7)用70%的乙醇洗沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入40μ1的ddH20溶解。6.1.2转基因烟草的PCR鉴定以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用LPl其序列为<210>2和LP2其序列为<210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施例2。如图5。6.2转基因烟草的RT-PCR检测6.2.1待检测植株总RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草总RNA1)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均使用0.1%的DEPC处理，高压灭菌；2)取植物幼嫩叶片约0.Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状；3)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入Iml的TRNzol提取试剂，充分快速混勻，室温放置3-5min。4)10000rpm，4°C离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200μ1氯仿，剧烈振荡混勻；5)10000rpm，4°C离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600μ1预冷的异丙醇，于_20°C沉淀30min；6)IOOOOrpm,4°C离心IOmin后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为总RNA。7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30μ1ddH20(DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。6.2.2cDNA第一链的合成在DEPC处理的0.2ml离心管中加入RNA2μ1，dNTP(2.5mM)1μ1，OligodT1μLddH2O5μ1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在离心管中加入foiaseInhibitor0.5μ1，AMV反转录酶0.5μ1，42°C0.5hr,95°C5min后，冷却至4°C。6.2.3cDNA第二链的合成及扩增在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1μl，5XTaqbuffer4μ1，MgCl2(25mM)1.0μ1，dNTP(2.5mM)0.5μ1，上下游引物(25ymol)各0.5μ1，ddH20补足至20μ1，反应条件同实施例2。如图6。实施例7转基因植株的模拟寒害处理及叶片质膜透性测定转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)。用打孔器打取已检测的阳性转基因烟草和非转基因的烟草植株的叶片各10片，放入装有IOml的去离子水的玻璃试管中。分别在10°C、0°C、-2°C、-3°C、、-4V、-5°C、-6V和-7V低温培养箱处理3h。如图7。实施例8转基因植株的模拟寒害处理叶片不饱和脂肪酸含量测定将对照和转LTP基因烟草整株分别放置于10°C、6°C、4°C低温培养箱处理12h，在0°C、-2°C、-3°C、和-4°C低温培养箱各处理证。用剪刀剪取叶片后，天平称量，提取不饱和脂肪酸，具体提取方法如下(1)称取植物叶片0.lg，放入装有700μ1提取液的2ml离心管当中，于80°C水浴处理3h。(2)将离心管取出，冷却至室温后，加入500μ1的去离子水，Iml正己烷，缓慢充分混勻。(3)分层后，吸上清至一新的离心管，自然干燥。(4)待上机测定时，加入50μ1正己烷，充分溶解。用岛津GC-2010气相色谱仪测定其油酸和亚油酸的含量，以标准品做出峰参照。气相色谱条件色谱柱为DB-l，30mX0.25umX0.25mm;分流比为501；进样温度为2900C；进样量为Iul；柱温为120°C；界面温度为270°C；柱流速为0.3ml/min；载气为氮气/空气。如图8、9。实施例9转基因植株的抗旱性分析浓度为5%的pEG6000，浇注于新移栽的转基因烟草(处于相同含水量条件的蛭石当中)的营养钵中。如图10。约胁迫3天后，剪取叶片，称重，测定组织含水量，具体测定方法如下(1)称取组织鲜重A后，然后将样品浸入蒸馏水中12h，使组织吸水达饱和状态。(2)取出用吸水纸吸去表面的水分，称重B。(3)将组织叶片放入80°C烘干，称重C。0150](4)计算相对含水量=(A-C)/(B-C)X100%0151]序列表0152]<110>石河子大学0153]<120>天山雪莲SikLTP基因在培育抗逆植物中的应用0154]<160>30155]<210>10156]<211>6200157]<212>DNA0158]<213>天山雪莲(Saurrea.involucrataKar.etKir.)0159]<220>0160]<221>5，UTP0161]<222>(1)...(49)0162]<220>0163]<221>CDS0164]<222>(50)...(427)0165]<220>0166]<221>3，UTP0167]<222>(428)...(620)0168]<400>10169]TranslationofLTP(50-427)0170]Vertebratemitochodrialcode0171]Totalaminoacidnumber:126,MW=216000172]MaxORFstartsatAApos16(maybeDNApos49)for126AA(378bases),MW=14193120gettgtAlaCys180tgccctCysRro240gtggttValVal300gaagtcGluVal360gtccca0173]1acctcacatttgaagaacccatagctacaatctttgtctctcactagctatggcgactcac0174]1MetAlaHirHis70809010011061tccateacttgtatettcatttcctttctcatettcaccgtcacatattct21SerlieIhrCysliePhelieSerPheLeuliePheHirValHirTyrSer130140150160170121ggttcgtgcatgccaacaccattaccacctaagggtCCCCCggcgaatccc41GlySerCysMetProIhrProLeuProRroLysGlyRroRroAlaAsnRro190200210220230181agggacgcattgaagttaggagtttgtgccgatgttCtgggtCtggtcaat61ArgAspAlaLeuLysLeuGlyValCysAlaAspValLeuGlyLeuValAsn250260270280290241ggaaccccaacateaageaaatgttgtgcactacttgagggtttggttgat81GlyIhrProIhrserSerLysCysCysAlaLeuLeuGluGlyLeuValAsp31032033034035030gcagettgtCtttgcactgccateaaggetaacgtcttgggaateaacctcgatAspttcPhegtaValttgLeuaac0189]101AlaAlaCysLeuCysThrAlalieLysAlaAsnValLeuGlylieAsnLeuAsnValRro0190]3703803904004104200191]361ateacattaagettgttgctcagtgettgtggcaagaccgttccaccaggcttcaagtgc0192]121lieThrLeuSerLeuLeuLeuSerAlaCysGlyLysThrValRroRroGlyPheLysCys0193]4304404504604704800194]421gaataaatatgcagtttgatagaaacttataaccctttcgtttaattcatecatcatgtt0195]141Glu-k-k-k0196]4905005105205300197]481catcaaatgggtatttattgcccacaaaatgagcatgaaaagtattaaaacgaatggatt0198]541ataatttttataaatatttaaattgtgaatttgttaagggggctcttgattggggtttta0199]601tttgtaacatgcttgtgat0200]<210>20201]<211>310202]<212>DNA0203]<213>人工序列0204]<400>20205]ggatccaccatggcgactcactccatcactt0206]<210>30207]<211>280208]<212>DNA0209]<213>人工序列0210]<400>30211]gtcgacttattcgcacttgaagcctgg权利要求1.一种从天山雪莲中克隆SikLTP基因，其特征在于该基因全长620bp，其序列为<210>1，在5，非编码区有49bp，3’非编码区有193bp，最大开放阅读框为378bp，编码125个氨基酸，有11个半胱氨酸，可形成多个二硫键，占到总氨基酸数量的10%，在LTP基因家族中较为少见。在线信号肽分析软件SignalP3.(Server分析，其前23个氨基酸组成信号肽区域，其可能使表达蛋白分泌至胞外，涉及到细胞膜组分的改变。2.一种利用上述基因sikLTP基因构建的植物表达载体。3.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗寒转基因植物。4.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗旱转基因植物。5.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sikLTP基因的用途，其特征在于利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗虫转基因植物。全文摘要本发明涉及一种天山雪莲sikLTP基因在培育抗寒、抗旱和抗虫植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆sikLTP基因，利用上述基因构建植物表达载体，遗传转化获得抗逆转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆sikLTP基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒、抗旱和抗虫性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫、抗旱和抗虫性能得到提高，最终获得抗逆能力明显增强的植物。文档编号C12N15/84GK102041261SQ20091011359公开日2011年5月4日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者刘红玲,张煜星,沈海涛,王爱英,祝建波申请人:石河子大学