雪莲原生质体的分离和培养方法

专利名称：雪莲原生质体的分离和培养方法
技术领域：
本发明涉及新疆雪莲悬浮细胞系的建立，具体地说涉及新疆雪莲 原生质体的分离和培养方法。
背景技术：
雪莲，(Saussurea involucrata Kar. et Kir. et Maxim)属于 菊科，为国家二级濒危植物，是多年生草本植物，高15 — 25 (—35) 厘米；根状茎粗，黑褐色，基部为棕褐色；茎单生，直立，中空，直 径2—4厘米，无毛，叶密集，近革质，绿色，叶片长圆形或卵状长圆 形，长约14厘米，宽2—4厘米，先端钝或微尖，基部下延，边缘有稀 疏小锯齿，具乳头状腺毛，最上部苞13-17，膜质透明，淡黄色，边 缘具整齐的疏齿，稍被腺毛，先端钝尖，基部收縮，常超出花序2倍。 头状花序10 — 30，聚集于茎端呈球状；总苞半球形，总苞片3—4层， 近膜质，披针形，急尖，边缘黑色，彼毛；花蕊紫色，长约14毫米。 瘦果长圆形，具纵肋；冠毛2层，外层短，糙毛状，内层长，羽毛状。雪莲通常生长在高山雪线以下，在海拔下限2400米到海拔上限 4000米之间，在我国分布于西北部的高寒山地。最高月平均温度3-5 °C，最低月平均温度零下21-19°C，年降水量约800毫米，无霜期仅 有50天左右。土壤以高山草甸土为主，有机质含量为8.5—11%， 含氮量4.5—10%。由于环境条件恶劣， 一般植物难以生长，只有少 数耐寒、耐低温的苔草属Carexspp.，嵩草属 Kobresia spp.和 各种高山多年生草本植物与之伴生。雪莲种子在O'C发芽，3-5"C生长。幼苗能经受-2rc的严寒。在生长期不到两个月的环境里，高度却能超过其他植物的五到七倍，它虽然要五年才能开花，但实际生长天数只有八个月，这在生物学上也是相当独特的。雪莲也是一种高山稀有的名贵药用植物，由于过度采挖，种子发 芽率低，繁殖困难，生长缓慢等的特点，如不采取有效措施，严加保 护，将会面临灭绝的危险。因此保护雪莲种质资源，无论在科学上或 医药学上都有重要意义。所以建议在雪莲分布集中的伊犁或阿尔泰山区建立自然保护点，加以重点保护；也可用种子快速繁殖。但雪莲种 子成熟时，高寒山区已是大雪时节，不易采集种子，造成引种栽培上 的困难，建议在自然保护区中研究结实及发芽的生物学特性，并开展 雪莲引种栽培和移栽到原生境的试验。目前通过植物组织培养方法大规模人工繁育雪莲，可以不受季节 和气候的限制，加快繁殖速度，快速扩大种质资源。它是借用无菌操作 方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基 上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的 过程。因此新疆雪莲通过组织培养再生植株的措施，不仅可以保护野 生种质资源，而且为新疆雪莲规模化生产提供了新途径。在此基础上，本发明对新疆雪莲原生质体进行分离提取，因为雪 莲细胞的原生质体都含有该个体的全部遗传信息，在适当的培养条件 下具有再生成与其亲本相似个体的全能性，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的；原生质体能克服性细胞的不亲和障碍， 便于进行远缘体细胞杂交，从而获得远缘杂种；原生质体可直接摄取 外源的D N A、细胞器、病毒、质粒等，是进行遗传转化研究的理想 受体，可以获得转基因雪莲；同时原生质体培养的过程中，会产生一 些此生代谢产物，在技术成熟的条件下可以分离提取；此外在原生质 体培养再生植株过程中，往往会产生无性系变异，也可以通过理化因 素诱变得到突变体等。因此，利用原生质体培养途径进行新疆雪莲的 种质资源创新不失为一种可行且有效的途径。发明内容本发明涉及新疆雪莲原生质体的分离和培养方法，该方法由无菌 雪莲苗的培养、胚性愈伤组织的诱导及分化、原生质的分离与纯化和 原生质体培养四个步骤完成。获得雪莲无菌苗的消毒处理方法、最佳 的诱导胚性愈伤组织的培养基配方，最佳的雪莲原生质体酶解和分离 条件，以及分离、纯化后原生质体的培养基配方和培养条件，均适用 于新疆雪莲的原生质体的分离和培养，也为新疆雪莲种质资源创新和 转基因雪莲的研究奠定了基础。发明所述的新疆雪莲原生质体的分离和培养方法，由获得无菌 苗、胚性愈伤组织、原生质体的酶解、分离和培养等步骤完成，具体 操作按下列步骤进行a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2-3小时来进行表 面清洗，然后在超净工作台上先用75 %酒精浸泡10-60s ，0. 1%的升 汞灭菌l-10min， 15%的过氧化氢，处理20-40 min ，无菌水冲洗3-4 次，最后用无菌水浸泡10 min;b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23士rC，光照2500-3000 lx,时间16 h/d， 10-20d开始萌发；c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成l-2cm的片段， 接入培养基MS+ NAA 1.0-1.5 mg/L+6-BA 0. Omg/L + 2， 4-D 0. 1-0. 5 mg/L中，置于温度23± 1。C ，光照3000-4000 lx，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织的诱导和分化；d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代1-3次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml的 CPW+13。/。甘露醇溶液中，进行质壁分离，在温度25。C黑暗条件下，处 理3 — 5小时；e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中进行酶解，置于转速80rpm，温度26士2f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入3-4ml的CPW+1(F。甘露醇溶液，进行原生质体清洗，再 置于转速1000rpm条件下离心2-5min，弃上清液，保留lml洗液， 用移液枪将混有原生质体的洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml 离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，然后在转速800rpm条件下离心 5-10min，由于密度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂 浮在20%的蔗糖溶液与CPW+1(F。甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉 入管底，用200ul移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一 干净的离心管中，加入2-5ml的CPW+10。/。甘露醇溶液，进行原生质体 再次清洗，转速1000rpm离心2-5min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 ii I放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况;最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本发明原生质体的培养密 度为1Xl。5个/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26土2-C，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，大致经过1-2月后在原生质 体培养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，所述愈伤组 织诱导培养基为NT培养基或DPD培养基附加激素1.0mg/L NAA+0. 3mg/L 6-BA+0. 5mg/L 2， 4-D。
步骤c中激素浓度优选为NAA 1. Omg/L +6-BA 0. 3mg/L +2， 4-D 0. lmg/L。
步骤e中酶解液为纤维素酶1.0%—2.0%，离析酶0. 1%-0. 5%，果胶酶0. 1%-0. 5%， 5mmol/L MES，溶解在CPW+109()甘露醇的溶液中， 调节pH5. 6-5.8。
本发明所述新疆雪莲原生质体分离和培养方法其优点为 首先，原生质体同细胞一样，具有全能性，且含有该个体的全部 遗传信息，在适宜的培养条件下，可再生成与其亲本相似的个体；在 同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，可作为植物生理 学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究的理想材料；原生质体融 合不经过受精过程，能够克服性细胞的不亲和障碍，创造有性杂交不 能得到的种间或属间杂种，从而扩大遗传物质基础；原生质体可以直 接摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒等各种大分子，可作为基 础研究及作物改良的理想受体材料；原生质体在培养过程中，有可能 产生体细胞无性系变异，这将可能成为作物改良上重要的遗传资源， 并可从中选择到优良的变异体应用于生产；单倍体原生质体对变异体 的筛选与诱发有很重要价值。
其次，该方法简单易于操作，所采用诱导胚性愈伤组织的培养基 配方诱导率高，方法实用，对设备和条件的要求较低，同时得到的胚 性愈伤组织生命力旺盛、再生能力强；此外，酶解的方法简单，去除 细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高、活性强易于雪莲原生质体 的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。最后，原生质体的 超低温保存对于具有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价 值。


图l为本发明高效消毒方法获得的无菌雪莲苗
图2为本发明诱导雪莲叶片获得的胚性愈伤组织
图3为本发明胚性愈伤组织悬浮培养20-30 d后的效果图
图4为本发明酶解和纯化后的雪莲原生质体图
图5为本发明用于分离原生质体的雪莲细胞6为本发明原生质体培养2-3月获得的小愈伤组织图
具体实施方式
本发明采用的新疆雪莲种子来自新疆和静县。 实施例l
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡10s ，0. 1%的升汞灭菌lmin， 15%的过氧化氢，处理20 min ，无菌水冲洗3次，最后用无菌水浸泡 10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23土rC，光照2500 lx，时间16 h/d， 10d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成lcm的片段，接 入培养基MS+ NAA l.Omg/L+6-BA 0. lmg/L +2, 4-D 0, lmg/L中，置 于温度23士rC，光照30001x，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织的 诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代1次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13% 甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25'C黑暗条件下，处理3小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26"，黑暗 条件下进行酶解，酶解12h，酶液组成纤维素酶1. 0%，离析酶0. 1%， 果胶酶O. 1%， 5mmol/LMES (2， (N—吗啡啉)一乙基磺酸)，溶解在 CPW+1(B甘露醇的溶液中，调节pH 5.6;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入3ml CPW+109&甘露醇溶液，进行原生质体清洗，置于转 速1000rpm条件下离心2min，弃上清液，保留lml洗液，用移液枪 将混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml离
9心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心5min，由于密 度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖溶 液与CPW+1(E甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200 u 1 移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，加 入2ml CPW+10y。甘露醇溶液，进行原生质体再次清洗，然后再转速 1000rpm离心2min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 u 1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红染料进行染色、制片，在同样的倍数 下观察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生 质体进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密 度为1Xl()5个/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，培养基为NT+NAA 1. Omg/L + 6-BA 0. lmg/L +2,4-D 0. lmg/L的激素，置于人工气候培养箱，温度26°C，黑暗条 件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原生质 体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过1个月后在原生质体培养基 上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织。
实施例2
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡20s ， 0. 1%的升汞灭菌3min， 15%的过氧化氢，处理25min ，无菌水冲洗4次，最后用无菌水浸泡 10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23土rC，光照28001x，时间16 h/d， 12d开始萌发;
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成1. 5cm的片段， 接入培养基MS十NAA 1.2mg/L+6-BA 0. 3mg/L +2， 4一D 0. 2mg/L中，置于温度23±1°C，光照32001x，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代1次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml的 CPW+13。/。甘露醇溶液中，进行质壁分离，在温度25t:黑暗条件下，处 理3. 5小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26士2'C，黑 暗条件下进行酶解，时间14h，酶液组成纤维素酶1.2%，离析酶 0.2%，果胶酶0.2%， 5mmol/LMES，溶解在CPW+10。/。甘露醇的溶液中， 调节pH5. 7，；
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入4ml CPW+1(^甘露醇溶液，进行原生质体清洗，置于转 速1000rpm条件下离心2min，弃上清液，保留lml洗液，用移液枪 将混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml离 心管装3ml20y。蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心5min，由于密 度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖溶 液与CPW+l(m甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200ul 移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，加 入2ml CPW+10。/。甘露醇溶液，进行原生质体再次清洗，在转速lOOOrpm 离心2min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 u 1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花染料红进行染色、制片，在同样的倍数 下观察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生 质体进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密
ii度为1Xl()5个/ml;
h、将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，培养基为DPD+ NAA 1.2mg/L + 6-BA 0.2mg/L +2，4-D 0. 2mg/L，置于人工气候培养箱，温度26土2。C，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过35天后在原生质体培 养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织。
实施例3
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗3小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上用75 %酒精浸泡60s ，0. 1%的升汞灭菌 10min， 15。/。的过氧化氢处理30min,无菌水冲洗4次，最后用无菌水 浸泡10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到无激素的MS培养基， 温度23士rC，光照2700 lx，时间16 h/d， 15d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成2cm的片段，接 入培养基13+ NAA 1.5 mg/L+6-BA 1. Omg/L +2， 4-D 0.5 mg/L中， 置于温度23土rC，光照3800 lx，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代3次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml的 CPW+13。/。甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25'C黑暗条件下，处理5 小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26土2。C，黑 暗条件下进行酶解，时间16h，酶液组成纤维素酶2.0%，离析酶 0.5%，果胶酶O. 5%， 5mmol/LMES，溶解在CPW+10。/q甘露醇的溶液中， 调节pH5.8。f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清，加入4ml CPW+10。/。甘露醇的原生质体清洗液，置于转速1000rpm 条件下离心5min，弃上清液，保留lml洗液，用移液枪将混有原生 质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20y。蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20% 蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心10min，由于密度梯度离心作 用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖溶液与CPW+10% 甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200ul移液枪轻轻 将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，加入5ml CPW+10。/。甘露醇溶液，进行原生质体清洗，在转速1000rpm离心5min，
弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 u 1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 迸行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密度为 1Xl。5个/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，培养基为NT+NAA 1. 3mg/L + 6-BA 0. 4 mg/L +2，4-D0.5mg/L的激素，置于人工气候培养箱，温度26士2r，黑暗 条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原生 质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过40天后在原生质体培养 基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织。
实施例4
a、筛选出颗粒饱满的雪莲种子,用自来水冲洗2. 5小时进行表面 清洗，然后在超净工作台上用75 %酒精浸泡30s ，0. 1%的升汞灭菌 5min， 15%的过氧化氢，处理28 min ，无菌水冲洗4次，最后用无菌水浸泡10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23±1°C，光照26001x，时间16 h/d， 13d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成2cm的片段，接 入培养基MS十NAA 1.3 mg/L+6-BA 0. 6mg/L +2， 4-D 0.4 mg/L中， 置于温度23土rC，光照36001x，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代2次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13% 甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25"C黑暗条件下，处理3小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26士2。C，黑 暗条件下进行酶解，时间16h，酶液组成纤维素酶2.0%，离析酶 0.5%，果胶酶O. 5%， 5画1/LMES,溶解在CPW+10y。甘露醇的溶液中， 调节pH5.8;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入3. 5ml的CPW+1096甘露醇溶液，进行原生质体清洗，置 于转速1000rpm条件下离心3min,弃上清液，保留lml洗液，用移 液枪将混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml 离心管装3111120%蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心6min，由于 密度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖 溶液与CPW+10。/。甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200 w 1移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中， 加入3ml的CPW+10。/。甘露醇溶液进行原生质体再次清洗，在转速 1000rpm离心3min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100y 1放于lml的离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原
生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度。本原生质体的培养密度为 lXlOl/ml;
h、将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26士2。C，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过2月后在原生质体培养 基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，所述愈伤组织诱导 培养基为DPD+NAA 1. 3mg/L + 6-BA 0. 6mg/L +2， 4-D 0. 3mg/L。
实施例5
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上先用75 %酒精浸泡45s ，0. 1%的升汞灭菌 7min， 15%的过氧化氢，处理30 min ，无菌水冲洗4次，最后用无菌 水浸泡10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23士1。C，光照2700 lx，时间16 h/d， 14d开始萌发;
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成1. 5cm的片段， 接入培养基MS+ NAA 1. 25 mg/L+6-BA 0. 5mg/L +2， 4-D 0. 2 mg/L中， 置于温度23士rC，光照3300 lx，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代1次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13% 甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25。C黑暗条件下，处理4.5小时;
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26土2。C，黑暗条件下进行酶解，时间13h，酶液组成纤维素酶1. 25%，离析酶
0.2%，果胶酶O. 3%， 5画1/LMES，溶解在CPW+10。/o甘露醇的溶液中， 调节PH5. 7;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入3.5ml CPW+1(F。甘露醇溶液进行原生质体清洗，置于转 速1000rpm条件下离心2. 5min，弃上清液，保留lml洗液，用移液 枪将混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml 离心管装3ml20y。蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心5. 5min，由 于密度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗 糖溶液与CPW+l(m甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200 Ul移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中， 加入2. 5ml的CPW+10。/。甘露醇溶液进行原生质体再次清洗，在转速 1000rpm离心2. 5min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度。本原生质体的培养密度为 lX10,/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26土2。C，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过50天后在原生质体培 养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，愈伤组织诱导培 养基为NT+NAA 1.25mg/L + 6-BA 0. 5mg/L +2， 4-D 0. 2mg/L。
实施例6a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子,用自来水冲洗2. 5小时进行表面 清洗，然后在超净工作台上用75 %酒精浸泡55s ,0. 1%的升汞灭菌 9min， 15%的过氧化氢，处理38 min ，无菌水冲洗3次,最后用无菌 水浸泡10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23土rC，光照2900 lx，时间16 h/d， 18d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成2cm的片段，接 入培养基MS+ NAA 1. 0 mg/L+6-BA 0. 3mg/L +2， 4-D 0. 1 mg/L中， 置于温度23士rC，光照3900 lx，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代2次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13% 甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25'C黑暗条件下，处理4小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中，转速80rpm，温度26土2。C，黑暗条件 下进行酶解，时间14h，酶液组成纤维素酶1.65%，离析酶0.4%， 果胶酶0.25%， 5mmol/LMES，溶解在CPW+10。/。甘露醇的溶液中，调节 pH5. 6;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入3ml CPW+l(m甘露醇溶液，进行原生质体清洗，置于转 速1000rpm条件下离心4. 5min，弃上清液，保留lml洗液，用移液 枪将混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml 离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心7min，由于 密度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖 溶液与CPW+10。/。甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200
ta移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，
17加入4.5ml的CPW+10。/。甘露醇溶液，进行原生质体再次清洗，在转速 1000rpm离心4. 5min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 P 1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密度为 1Xl()5个/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26土2X:，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过55天后在原生质体培 养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，愈伤组织诱导培 养基为DPD+NAA 1. 35mg/L + 6-BA 0. 8mg/L +2， 4-D 0. 15mg/L。
实施例7
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上用75 %酒精浸泡18s ， 0.1%的升汞灭菌7min， 15%的过氧化氢，处理30 min ，无菌水冲洗4次，最后用无菌水浸泡 10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23±1°C，光照3000 lx，时间16 h/d, 17d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成2cm的片段，接 入培养基MS十廳1. 4 mg/L+6-BA 0. 7mg/L +2， 4-D 0. 3mg/L中，置 于温度23士rC，光照4000 lx，时间16 h/d，进行胚性愈伤组织的 诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代3次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13%甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25'C黑暗条件下，处理3.5小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中转速80rpm，温度26士2。C，黑暗条件下 进行酶解，时间15h，酶液组成纤维素酶1.4%，离析酶0.35%，果 胶酶0.35%， 5mmol/L MES，溶解在CPW+1(F。甘露醇的溶液中，调节 pH5. 75;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000rpm条件下离心5min，弃 上清液，加入4ml CPW+l(m甘露醇溶液进行原生质体清洗，置于转速 1000rpm条件下离心3.5min，弃上清液，保留lml洗液，用移液枪将 混有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml离心 管装3ml 20%蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心lOmin，由于密 度梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖溶 液与CPW+10。/。甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200ul
移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，加 入4.5ml CPW+10y。甘露醇溶液进行的原生质体再次清洗，在转速 1000rpm离心5min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100ul放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密度为 lX10，/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26士2i:，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过40天后在原生质体培养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，愈伤组织诱导培
养基为DPD+NAA 1.4mg/L + 6-BA 0. 7mg/L +2， 4-D 0. 3mg/L。 实施例8
a、 筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2小时进行表面清 洗，然后在超净工作台上用75 %酒精浸泡60s , 0. 1%的升汞灭菌3min， 15%的过氧化氢，处理28min ，无菌水冲洗4次，最后用无菌水浸泡 10 min;
b、 将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基上，温度 23士rC，光照26501x,时间16 h/d， 17d开始萌发；
c、 将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成2cm的片段，接 入培养基1^+ NAA 1. 45 mg/L+6-BA 0. 65mg/L +2， 4-D 0. 35mg/L中， 置于温度23士rC，光照4000 lx,时间16 h/d，进行胚性愈伤组织 的诱导和分化；
d、 将步骤c中生长迅速、颜色鲜绿，结构致密、结合松散的胚 性愈伤组织继代2次，称取lg胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13% 甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25i:黑暗条件下，处理3小时；
e、 将步骤d的质壁分离液慢慢地倒除，保留质壁分离后的胚性 愈伤组织，置于10ml酶液中转速80rpm，温度26±2匸，黑暗条件下 进行酶解，时间16h，酶液组成纤维素酶2. 0%，离析酶0. 1%，果 胶酶O. l%，5mmol/L MES，溶解在CPW+10y。甘露醇的溶液中，调节pH5. 8;
f、 将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化 的雪莲组织碎片，然后将滤液在转速1000卬m条件下离心5min，弃 上清液，加入3ml CPW+l(m甘露醇溶液进行原生质体清洗，置于转速 1000rpm条件下离心5min，弃上清液，保留lml洗液，用移液枪将混 有原生质体的lml洗液吸出，轻轻铺于20%蔗糖溶液上(5ml离心管 装3ml 20%蔗糖溶液)，在转速800rpm条件下离心10min，由于密度 梯度离心作用，生命力强、状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖溶液
20与CPW+109&甘露醇溶液之间，破碎的细胞残渣沉入管底，用200iil 移液枪轻轻将状态好的原生质体吸出，放入另一干净的离心管中，加 入5ml CPW+10。/。甘露醇溶液进行原生质体再次清洗，在转速1000rpm 离心5min，弃上清液；
g、 从步骤f分离纯化的雪莲原生质体中，取100 u 1放于lml的 离心管用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原 生质体的得率；再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观 察活细胞的情况；最后用血球计数板对生命力强、状态好的原生质体 进行计数，用于调整原生质体的培养密度，本原生质体的培养密度为 1Xl。5个/ml;
h、 将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱 导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26土2。C，黑 暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，观察原 生质体的生活情况和细胞壁再生的过程，经过2个月后在原生质体培 养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，愈伤组织诱导培 养基为DPD+NAA 1.45 mg/L+6-BA 0. 65mg/L +2， 4-D 0. 35mg/L。
权利要求
1、一种雪莲原生质体的分离和培养方法，其特征在于按下列步骤进行a、筛选出颗粒饱满的雪莲种子，用自来水冲洗2-3小时进行表面清洗，然后在超净工作台上用75％酒精浸泡10-60s，0.1％的升汞灭菌1-10min，15％的过氧化氢处理20-40min，无菌水冲洗3-4次，然后用无菌水浸泡10min；b、将步骤a中处理后的无菌雪莲种子接种到MS培养基，温度23±1℃，光照2500-3000lx，时间16h/d，10-20d开始萌发；c、将步骤b中萌发的无菌苗的子叶和真叶切成1-2cm的片段，接入培养基MS+NAA 1.0-1.5mg/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+2，4-D 0.1-0.5mg/L中，置于温度23±1℃，光照3000-4000lx，时间16h/d，进行胚性愈伤组织的诱导和分化；d、将步骤c胚性愈伤组织继代1-3次，称取1g胚性愈伤组织切碎置于10ml CPW+13％甘露醇溶液中，进行质壁分离，在25℃黑暗条件下，处理3-5小时；e、将步骤d的质壁分离液慢慢地倒出，将胚性愈伤组织置于10ml酶液中，放置于转速80rpm，温度26±2℃，黑暗条件下进行酶解，酶解时间12-16h；f、将步骤e中的酶解组织用500目的筛子过滤除去未完全消化的雪莲组织碎片，然后将滤液在1000rpm条件下离心5min，弃上清液，加入3-4ml的CPW+10％甘露醇溶液进行原生质体清洗，然后置于转速1000rpm条件下离心2-5min，弃上清液，保留1ml洗液，用移液枪将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20％蔗糖溶液上，在转速800rpm条件下离心5-10min，再用200μl移液枪轻轻将原生质体吸出，加入2-5ml的CPW+10％甘露醇溶液进行原生质体再次清洗，在转速1000rpm离心2-5min，弃上清液；g、将步骤f分离纯化后的雪莲原生质体100μl放于1ml的离心管用于镜检，用血球计数板来调整原生质体的培养密度为1×105个/ml；h、将步骤g中调整好培养密度的原生质体悬液铺于愈伤组织诱导培养基上进行浅层培养，置于人工气候培养箱，温度26±2℃，黑暗条件下培养，每隔7天添加一次培养基同时取样进行镜检，经过1-2月后在原生质体培养基上出现肉眼可见的细胞团，即形成微愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基为NT或DPD中附加激素NAA1.0-1.5mg/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+2，4-D 0.1-0.5mg/L。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中激素浓度 优选为NAA 1.0mg/L +6-BA 0. 3mg/L +2， 4-D 0. lmg/L。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中酶解液为.-纤维素酶1. 0%—2. 0%,离析酶0. 1%-0. 5%，果胶酶0. 1%-0. 5%， 5mmol/L MES，溶解在CPW+1(^甘露醇的溶液中，调节pH5.6-5.8。
全文摘要
本发明涉及新疆雪莲原生质体的分离和培养方法，该方法由无菌雪莲苗的培养、胚性愈伤组织的诱导及分化、原生质的分离与纯化和原生质体培养四个步骤完成，均适用于新疆雪莲的原生质体的分离和培养。同时本发明具有方法简单易于操作，对设备和培养条件的要求较低；此外，酶解的方法实用，去除细胞壁条件温和，分离原生质体的得率高、活性强易于雪莲原生质体的培养和植株再生，为原生质体培养和融合奠定了基础，也为新疆雪莲种质资源创新和转基因雪莲的研究奠定了基础。
文档编号C12N5/04GK101671648SQ200910113470
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者敏 刘, 康喜亮, 琴 徐, 王晓军, 袁永娴, 赵民安, 郝秀英 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所