专利名称：龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法
技术领域：
本发明涉及酶法分离纯化原生质体及再生成植株的方法，是关于龙须菜酶离营养细胞成苗技术，具体地说是龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法。
背景技术：
原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞，由于原生质体没有细胞壁，则可以在很多方面在人工控制下进行处理，如细胞融合、细胞杂交、基因控制、遗传转化等，而且，对于经济物种来说，由原生质体再生植株也是一条经济、合理的种苗来源途径。
1960年Cocking用酶法首次分离出有活性的原生质体，1971年Takebe等首次从烟草叶片分离原生质体，经培养获得再生植株开始，原生质体的研究和应用已经进入了一个新阶段。目前，在高等植物中，有关原生质体分离及植株再生的研究报道已有很多，其技术方法也比较成熟，而关于海洋藻类，这方面的报道相对较少，虽然也有一些关于原生质体分离及形成多细胞海藻的报道，但其中大部分是有关绿藻和褐藻的，红藻的原生质体分离及再生的相关研究主要是关于紫菜的，如中国专利CN1153212A，介绍了酶法解离紫菜叶状体细胞育苗的方法，而江蓠属植物没有相关报道。江蓠属植物藻胶含量特别高，壁物质比较难去除，以往对于红藻原生质体制备的最主要的工具酶为琼胶酶，其价格比较昂贵，因此江蓠属植物原生质体制备受到限制，相关研究也比较困难。
龙须菜是红藻门江蓠属植物，在中国山东半岛沿海分布比较普遍，其藻胶含量达20％～25％，而且胶的强度也比较大，与石花菜相比还有生长快、容易采集和可以在海区大面积人工养殖的优点，所以，近年来龙须菜逐渐发展为琼胶工业的主要原料。除此之外，它还在食品、医药以及水产养殖等方面得到了广泛的应用和发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低的龙须菜原生质体分离及植株再生的方法。
为实现上述目的，本发明采用海螺酶对龙须菜孢子体营养枝细胞壁进行消化酶解，酶解后用350-400目筛绢进行揉搓、过滤收集原生质体，将分离得到的原生质体培养在固体液体双层培养基中，固体为“F/2”培养基，上层为消毒海水，将分离得到的原生质体滴加于上层的液体培养基中，于22℃-24℃，光强400lux～1000lux，光周期为12L:12D的条件下培养；一段时间后连培养皿一起放入到大体积的培养液中充气培养。
龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，1)将藻体洗净，去除杂藻和其他附属生物；2)取清洗过的藻体，剪取嫩枝部分，将其剪成约1-2mm长，清洗，加入酶液淹没藻体，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350-400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，获得龙须菜单细胞；3)将酶解获得的龙须菜单细胞培育再生成植株。
龙须菜单细胞培育再生成植株的培养方法为将收集到的原生质体悬浮液滴加到已配制好的双层培养基的上层培养液中，双层培养基中的固体培养基为“F/2”，用过滤海水配制；将滴加在固体培养基上的原生质体培养在温度22℃-24℃，光强400-1000lux，光周期为12L:12D的条件下；培养一段时间后放入到大体积的培养液中充气培养，培养液为消毒后的天然海水，培养条件同上，生成新的植株。
将揉搓过的藻体再加入之前吸出的酶解液中，酶解后再采用350-400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，重复如上过程，提高获得龙须菜单细胞的收率。所述藻体剪切后的清洗过程是指将藻体剪成约1-2mm长后放入离心管中，加入消毒海水离心，弃去上层海水达到清洗的目的。
本发明具有如下优点1)本发明采用海螺酶对龙须菜孢子体营养枝细胞壁进行消化酶解，所用工具酶为海螺酶，为粗酶提取液，成本较低，但对于龙须菜的细胞壁的消化能力极好。
2)本发明采用固体液体相结合的双层培养法，这是目前广泛应用的培养方法之一。固体培养基为F/2培养基，F/2为藻类常用培养基，其中附加有养分，养分可以逐渐地向上层液体培养液中释放，这样有利于原生质体在培养基中长时间的培养，同时，固体培养基可以使发育的幼苗有固着的地方。培养一周后，将培养的原生质体连同培养皿一同放入到大体积的水体中充气培养，一周的时间可以使具有生长活力的原生质体完全从上层的液体培养基中逐渐下沉至固体培养基表面，同时生成细胞壁，发育并固着于固体培养基上，这样在进行充气培养的时候就不至使原生质体冲离培养皿。实验的过程均在无菌条件下操作，但是藻体本身携带的菌很难全部去除，这也是藻类原生质体培养所面临的一个难题，在培养一周后将原生质体连同培养皿一同转入大体水体中充气培养，这样除了给生长的藻体提供充足的氧气外还可以造成水体的流动，就不至于在培养基表面形成菌膜而影响原生质体的生长。
图1为实施例1原生质体培养12天左右形成大于10个细胞的小幼苗(a为可见光，b为绿光激发的荧光照片)(×100)；图2为实施例3原生质体培养12天左右形成大于10个细胞的小幼苗(a为可见光，b为绿光激发的荧光照片)(×100)；图3为实施例1原生质体培养25天从小幼苗上开始出现分枝，长至4mm左右，肉眼隐约可见(×60)。
具体实施例方式
按文献中给出的常规方法提取海螺酶取采集的新鲜海螺约1000g，洗去杂质，于充足的海水中饥饿2-3d，用蒸馏水洗涤后放于-20℃下冷冻24h，破壳，取其消化道，消化腺，加人8倍(w/V)的冷凝水，用匀浆器匀浆。匀浆液置于4℃下油提过夜，抽提液用2mol/L的HCl调PH至4.6，冷冻离心(1000r/min)30miM弃去沉淀。上清液调PH至7.0，加入-30℃预冷的丙酮至10％浓度，离心弃去沉淀。上清液再加入冷丙酮至35％为浓度，离心收集沉淀。以上操作均在0℃以下进行。沉淀物真空冷冻干燥后，得干粉。干粉溶于pH6.5的水溶液中，离心弃去沉淀，上清液再冷冻干燥得到干粉。
原生质体的分离纯化及再生成植株过程可按如下步骤操作1)将藻体用过滤海水清洗2遍，再用脱脂棉沾消毒海水擦拭两遍，然后用脱脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻体，最后用消毒海水漂洗3-5次，以去除杂藻和其他附属生物；2)取清洗过的藻体，剪取幼嫩的分枝部分，用消毒过的剪刀将其剪成约1-2mm长，放入50ml离心管中，加入消毒海水至40ml，9000-10000×g离心5-10min，弃去上层海水，重复清洗两次(洗去剪切的破碎细胞和组织)，加入酶液至刚刚淹没藻体，黑暗中酶解过夜，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水清洗去除残余酶液，500-1000×g离心5-10min，重复3次，然后用消毒过的350-400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，然后将揉搓过的藻体再加入之前吸出的酶解液中，酶解5个小时后再采用上述办法收集原生质体，然后进行重复，酶解3小时后再进行收集，这样使由剪口处向内的细胞被逐层酶解和收集，使原生质体的得率大大提高。将收集到的原生质体悬浮液滴加到已配制好的双层培养基的上层培养液中。
3)双层培养基中的固体培养基为“F/2”，用过滤海水配制，其中琼脂浓度为1％，121℃高温灭菌20分钟，在超净工作台中放置至温度降到约50℃左右的时候倒在9cm培养皿中，培养皿需预先在121℃高温灭菌，每个培养皿中约含有这种固体培养基25ml，高度约4mm。
表1每升消毒海水中加入的营养盐的含量
4)将滴加在固体培养基上的原生质体培养在温度22℃-24℃，光强400-1000lux，光周期为12L:12D的条件下。培养一周后连培养皿一起放入到大体积的培养液中充气培养，体积约5L，培养液为消毒后的天然海水，每周更换一次，培养条件同上。
5)观察到原生质体未出现盘状体而直接发育，首先由一个细胞分裂成两个细胞，然后其中一个细胞继续分裂，横裂成四个细胞，而另一个细胞则逐渐伸长，形成细丝状，起固着作用，固着于固体培养基上；上端由一个细胞分裂成的四个细胞靠基部的两个细胞首先开始纵裂，然后上端的两个细胞也开始纵裂。培养12天左右形成大于10个细胞的小幼苗(图1、2)，培养25天后从小幼苗上开始出现分枝，长至4mm左右，肉眼隐约可见(图3)，此时将小藻体从固体培养基上挑出，于附加N、P的消毒过的天然海水中培养，温度22℃-24℃，光强1000lx左右，光周期为12L:12D，培养液2～3天更换一次。35天之后从长长的分枝上再开始出现分枝，总长度约为5mm，肉眼可见。
表2每升海水中附加N、P的量
实施例1材料来自福建养殖品种，全部为孢子体营养枝，取藻体1.5g，用过滤海水清洗2遍，再用脱脂棉沾消毒海水擦拭两遍，然后用脱脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻体，最后用消毒海水漂洗3-5次。用消毒过的剪刀将其剪成约0.2mm长，放入50ml离心管中，加入消毒海水至40ml，9000×g离心5min，弃去上层海水，重复清洗两次，加入酶液2ml，黑暗中酶解5小时，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水(消毒海水是将海水进行沉淀，砂滤，抽氧，然后再用脱脂棉过滤后100℃下煮沸两分钟以上，自然冷却即可)清洗去除残余酶液，500×g离心10min，重复3次，然后用消毒过的350目筛绢经揉搓过滤收集原生质体。将收集到的原生质体悬浮液滴加到已配制好的双层培养基的上层培养液中。培养在温度22℃-24℃，光强1000lux左右，光周期为12L:12D的条件下。培养一周后连培养皿一起放入到大体积的培养液中充气培养，体积约5升，培养液为消毒后的天然海水，每周更换一次，培养条件同上。
实施例2前面的步骤与实施例1相同，与实施例1不同之处是酶解过程加入1ml酶液，然后再加入1ml消毒海水酶解9小时，350目筛绢揉搓过滤收集，然后将揉搓过的藻体再加入之前吸出的酶解液中，酶解5个小时后再采用上述办法收集原生质体，然后进行重复，酶解3小时后再进行收集，这样使由剪口处向内的细胞被逐层酶解和收集，提高原生质体得率。
实施例3材料来自连云港养殖品种，为孢子体营养枝侧枝，取藻体3g，用过滤海水清洗2遍，再用脱脂棉沾消毒海水擦拭两遍，然后用脱脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻体，最后用消毒海水漂洗3-5次。用消毒过的剪刀将其剪成约0.2mm长，放入50ml离心管中，加入消毒海水至40ml，9000×g离心5min，弃去上层海水，重复清洗两次，加入酶液2ml，消毒海水2ml，黑暗中酶解9小时，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水清洗去除残余酶液，500×g离心10min，重复3次，然后用消毒过的350目筛绢经揉搓过滤收集原生质体。将收集到的原生质体悬浮液滴加到已配制好的双层培养基的上层培养液中。培养条件同实施例1。
权利要求
1.龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，其特征在于1)将藻体洗净，去除杂藻和其他附属生物；2)取清洗过的藻体，剪取嫩枝部分，将其剪成约1-2mm长，清洗，加入酶液淹没藻体，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350-400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，获得龙须菜单细胞；3)将酶解获得的龙须菜单细胞培育再生成植株。
2.按照权利要求1所述龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，其特征在于龙须菜单细胞培育再生成植株的培养方法为，将收集到的原生质体悬浮液滴加到已配制好的双层培养基的上层培养液中，双层培养基中的固体培养基为“F/2”，用过滤海水配制；将滴加在固体培养基上的原生质体培养在温度22℃-24℃，光强400-1000lux左右，光周期为12L∶12D的条件下；培养一段时间后放入到大体积的培养液中充气培养，培养液为消毒后的天然海水，培养条件同上，生成新的植株。
3.按照权利要求1所述龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，其特征在于将揉搓过的藻体再加入之前吸出的酶解液中，酶解后再采用350-400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，重复如上过程，获得龙须菜单细胞。
4.按照权利要求1所述龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，其特征在于所述原生质体来源于龙须菜孢子体营养枝。
5.按照权利要求1所述龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，其特征在于藻体剪切后的清洗过程是指将藻体剪成约1-2mm长后放入离心管中，加入消毒海水离心，弃去上层海水达到清洗的目的。
全文摘要
本发明涉及酶法分离纯化原生质体及再生成植株的方法，是关于龙须菜酶离营养细胞成苗技术，具体地说是龙须菜原生质体的分离纯化及再生成植株的方法，1)将藻体洗净，去除杂藻和其他附属生物；2)取清洗过的藻体，剪取嫩枝部分，将其剪成约1－2mm长，清洗，加入酶液淹没藻体，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350－400目筛绢经揉搓过滤收集原生质体，获得龙须菜单细胞；3)将酶解获得的龙须菜单细胞培育再生成植株。发明采用海螺酶对龙须菜孢子体营养枝细胞壁进行消化酶解，所用工具酶为海螺酶，为粗酶提取液，成本较低，但对于龙须菜的细胞壁的消化能力极好。
文档编号A01H4/00GK1754426SQ20041005054
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者王广策, 尤丽莉, 林祥志, 曾呈奎 申请人:中国科学院海洋研究所