楸树内生真菌的原生质体的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法；所述方法包括以下步骤：步骤1，菌丝体的制备；步骤2，原生质体的制备；步骤3，原生质体纯化；步骤4，原生质体再生。本发明所述方法制备的原生质体数量较多，可达到6×107个/毫克菌丝，获得的原生质体的活力较高，再生率可达到1.2%。本发明选择培养12-24h的菌丝体，真菌处于快速生长期，生长快，细胞壁易于酶的裂解，释放出的原生质体的数量多，不易裂解，活力高。本发明选取5～30mg/ml?Glucanex复合酶作为细胞壁裂解酶液，裂解效率高，原生质体释放数量多。本发明选用KCl或NaCl作为渗透压稳定剂，保证了原生质体制备数量与原生质体的稳定。
【专利说明】楸树内生真菌的原生质体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及真菌的生物学领域，尤其是一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法。 【背景技术】
[0002]内生真菌是指那些生活在于植物组织内部并不会使植物产生明显病害的真菌。内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，具有巨大的潜在价值，可以成为新型抗癌药物的来源。本课题组已从胡桃楸里分离提取了一株具有很强抗癌活力的内生真菌，编号为FSN002，初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属，其发酵提取液对肝癌细胞有很强的抑制作用。这是一个本实验室独有的全新菌种，已经在中国专利CN101487022中公开，但其产生的生物活性物质量少、不稳定等缺点限制其进行工业化生产，通过生物转化、构建突变体等手段对其进行菌体改造，提高其抗癌活力并研究其抗癌机理，可以更好地利用该真菌资源，而构建原生质体是进行以上研究的基础和关键技术。
【发明内容】
[0003]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0005]本发明提供一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0006]步骤1，菌丝体的制备；
[0007]步骤2，原生质体的制备；
[0008]步骤3，原生质体纯化；
[0009]步骤4，原生质体再生。
[0010]优选地，所述菌丝体制备具体为:取置于_80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ 1，加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在摇床上，23~28°C摇晃培养，培养菌丝发酵，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分。
[0011]优选地，所述菌丝发酵培养条件:在温度为23~28°C，摇床的转速为lOOrpm，摇晃培养时间为12~24h。
[0012]优选地,所述原生质体制备具体为:Glucanex酶用渗透压稳定剂配制为5~30mg/ml的酶液，充分溶解进行酶解，用无菌过滤膜过滤除菌备用。
[0013]优选地，所述渗透压稳定剂为0.7~lmol/L KCl或NaCl溶液。
[0014]优选地，所述酶解的条件为:在温度为28°C，摇床的转速为lOOrpm，时间为4~8h。
[0015]优选地，所述原生质体纯化具体为:菌丝酶解后用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0016]优选地，所述STC保存液的组成为:lmol/L山梨醇、0.01mol/L Tris-HCl,
0.01mol/L氯化钙。
[0017]优选地，所述原生质体再生具体为:先在培养皿内铺一层原生质体固体再生培养基，冷凝后备用，制备PDA半固体再生培养基，置于室温下冷却至40°C，吸取IOml培养基加AlOOyL原生质体悬液，混匀，直接倒在培养皿的原有的固体再生培养基上，使之铺满平皿形成一固体薄层，待培养基凝固后置于28°C培养箱中培养2~3d，即可见再生菌落。
[0018]优选地，所述原生质体固体再生培养基为:加入0.004%的去氧胆酸钠、lmol/L甘露醇、15g/L琼脂的PDA固体培养基。
[0019]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0020]( I)本发明所述方法制备的原生质体数量较多，可达到6 X IO7个/毫克菌丝，获得的原生质体的活力较高,再生率可达到1.2%。
[0021](2)不同菌龄的菌丝细胞壁结构不同,影响原生质体制备,本发明选择培养12_24h的菌丝体，真菌处于快速生长期，生长快，细胞壁易于Glucanex酶的裂解，释放出的原生质体的数量多，不易裂解，活力高。
[0022](3)真菌细胞壁成分多、结构复杂，细胞壁裂解酶的选择对原生质体的制备影响很大，本发明选取5~30mg/ml Glucanex复合酶作为细胞壁裂解酶液，裂解效率高，原生质体释放数量多。
[0023](4)渗透压稳定剂的种类与浓度的选择对原生质体的制备、再生及原生质体的稳定非常重要，本发明选用0.7~lmol/L KCl或NaCl作为渗透压稳定剂，保证了原生质体制备数量与原生质体的稳定。
[0024](5)本发明采用加入0.004%去氧胆酸钠的双层高渗PDA再生培养基进行原生质体的再生，提高了原生质体的再生率，并且方便了单克隆菌体的挑选。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0026]图1为实施例1中所制备的原生质体的光学显微镜图像；
[0027]图2为实施例1中所制备的原生质体进行活力评估的荧光显微镜的图像，原生质体若能显示荧光则代表其有活力；
[0028]图3为采用实施例5中的方法进行原生质体再生的图片；
[0029]图4为采用对比例4中的方法进行原生质体再生的图片。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0031]实施例1[0032]本实施例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，包括如下步骤:
[0033](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养12h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0034](2)原生质体的制备:Glucanex酶用0.8mol/L KCl渗透压稳定剂配制为10mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用。将菌丝置于酶液中于28°C，IOOrpm转速摇晃酶解6h ；
[0035](3)原生质体纯化:菌丝酶解6h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存，见图1本实施例原生质体的光学显微镜图像。图2为本实施例所制备的原生质体进行活力评估的荧光显微镜的图像，原生质体若能显示荧光则代表其有活力；由图1中可以看出原生质体数量多,大小相差不大,质量比较高。
[0036]本实施例方法得到的原生质体数量达到6X IO7个/毫克菌丝。
[0037]实施例2
[0038] 本实施例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备与再生方法的操作步骤如下:
[0039](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养24h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0040](2)原生质体制备:Glucanex酶用0.7mol/L NaCl渗透压稳定液配制为5mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用。将菌丝置于酶液中于28°C，IOOrpm转速摇晃酶解6h ；
[0041](3)原生质体纯化:菌丝酶解6h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0042]本实施例方法得到的原生质体数量达到2X IO7个/毫克菌丝。
[0043]实施例3
[0044]本实施例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备，包括如下步骤:
[0045](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养菌丝发酵，培养18h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0046](2)原生质体制备:Glucanex酶用lmol/L NaCl渗透压稳定液配制为20mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用，将菌丝置于酶液中于28 V，IOOrpm转速摇晃酶解2h ；
[0047](3)原生质体纯化:菌丝酶解2h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0048]本实施例方法得到的原生质体数量达到1.5X IO7个/毫克菌丝。
[0049]实施例4
[0050]本实施例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备，包括如下步骤:
[0051](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养14h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分。
[0052](2)原生质体制备:Glucanex酶用0.8mol/L KCl渗透压稳定液配制为30mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用。将菌丝置于酶液中于28°C，IOOrpm转速摇晃酶解8h。
[0053](3)原生质体纯化:菌丝酶解8h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0054]本实施例方法得到原生质体数量达到5X IO7个/毫克菌丝。
[0055]实施例5
[0056]本实施例涉及前述1-4制备的楸树内生真菌的原生质体的再生方法，具体为:`[0057]先在培养皿内铺一层原生质体(实施例1~4得到的原生质体)固体再生培养基，冷凝后备用，制备PDA半固体再生培养基(加入0.004%的去氧胆酸钠、lmol/L甘露醇、15g/L琼脂的PDA固体培养基)，置于室温下冷却至40°C，吸取IOml培养基加入100 μ L原生质体悬液，混匀，直接倒在培养皿的原有的固体再生培养基上，使之铺满平皿形成一固体薄层。待培养基凝固后置于28°C培养箱中培养2d。
[0058]本实施例楸树内生真菌的原生质体的再生率为1.2%，见图3原生质体再生的图片。
[0059]对比例I
[0060]本对比例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，包括如下步骤:
[0061](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养10h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0062](2)原生质体制备:Glucanex酶用0.8mol/L KCl渗透压稳定液配制为lmg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用，将菌丝置于酶液中于28 V，IOOrpm转速摇晃酶解4h。
[0063](3)原生质体纯化:菌丝酶解4h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0064]本对比例I得到的原生质体数量只有1.5X IO5个/毫克菌丝。
[0065]对比例2
[0066]本对比例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，包括如下步骤:[0067](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养12h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0068](2)原生质体制备:Glucanex酶用0.8mol/L甘露醇渗透压稳定液配制为4mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用。将菌丝置于酶液中于28°C，IOOrpm转速摇晃酶解6h。
[0069](3)原生质体纯化:菌丝酶解6h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0070]本对比例2得到的原生质体数量只有1.3X IO5个/毫克菌丝。
[0071]对比例3
[0072]本对比例涉及一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，包括如下步骤:
[0073](I)菌丝体制备:取置于-80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ I加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在IOOrpm摇床上，25°C摇晃培养，培养10h，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；
[0074](2)原生质体制备:Glucanex酶用0.6mol/L KCl渗透压稳定液配制为3mg/ml的酶液，充分溶解后用无菌过滤膜过滤除菌备用。将菌丝置于酶液中于28°C，IOOrpm转速摇晃酶解6h ；`
[0075](3)原生质体纯化:菌丝酶解6h后，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
[0076]本对比例3得到的原生质体数量只有I X IO4个/毫克菌丝。
[0077]对比例4
[0078]本对比例涉及前述对比例I~3楸树内生真菌的原生质体再生方法，具体为:
[0079]原生质体再生:吸取100 μ I稀释好的原生质体(对比例I~3得到的原生质体)溶液于PDA固体再生培养基平板，直接用涂布棒轻轻涂布均匀，将培养皿置于28°C培养箱中培养2~3d左右。
[0080]本对比例4得到的原生质体的再生率只有0.1%，如图4原生质体再生的图片。
[0081]综上所述:本发明所述方法制备的原生质体数量较多，可达到6 X IO7个/毫克菌丝，获得的原生质体的活力较高，再生率可达到1.2%。选择不同菌龄的菌丝细胞壁结构不同，影响原生质体制备，本发明选择培养12-24h的菌丝体，真菌处于快速生长期，生长快，细胞壁易于Glucanex酶的裂解,释放出的原生质体的数量多，不易裂解,活力高。真菌细胞壁成分多、结构复杂，细胞壁裂解酶的选择对原生质体的制备影响很大，本发明选取5~30mg/ml Glucanex复合酶作为细胞壁裂解酶液，裂解效率高，原生质体释放数量多。渗透压稳定剂的种类与浓度的选择对原生质体的制备、再生及原生质体的稳定非常重要，本发明选用0.7~lmol/L KCl或NaCl作为渗透压稳定剂，保证了原生质体制备数量与原生质体的稳定。本发明采用加入0.004%去氧胆酸钠的双层高渗PDA再生培养基进行原生质体的再生，提高了原生质体的再生率，并且方便了单克隆菌体的挑选。
[0082]由图1中可以看出原生质体数量多，大小相差不大，质量比较高，与图2相比较看出大部分原生质体稳定,活力高；
[0083]由图3、图4两者比较可以看出采用本发明的再生方法的原生质体再生率高，菌落不易重叠易于分离鉴定。
[0084]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的 实质内容。
【权利要求】
1.一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤I，菌丝体的制备； 步骤2，原生质体的制备； 步骤3，原生质体纯化； 步骤4，原生质体再生。
2.如权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述菌丝体制备具体为:取置于_80°C保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200 μ 1，加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在摇床上，23~28°C摇晃培养，培养菌丝发酵，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分。
3.根据权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法,其特征在于，所述菌丝发酵培养条件:在温度为23~28°C，摇床的转速为lOOrpm，摇晃培养时间为12~24h。
4.如权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述原生质体制备具体为:Glucanex酶用渗透压稳定剂配制为5~30mg/ml的酶液,充分溶解进行酶解，用无菌过滤膜过滤除菌备用。
5.根据权利要求4所述的楸树内生真菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，所述渗透压稳定剂为0.7~ lmol/L KCl或NaCl溶液。
6.根据权利要求4所述的楸树内生真菌原生质体制备与再生方法，其特征在于，所述酶解的条件为:在温度为28°C，摇床的转速为lOOrpm，时间为4~8h。
7.如权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述原生质体纯化具体为:菌丝酶解后用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心lOmin，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。
8.如权利要求7所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述STC保存液的组成为:lmol/L山梨醇、0.01mol/L Tris_HCl、0.01mol/L氯化钙。
9.如权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述原生质体再生具体为:先在培养皿内铺一层原生质体固体再生培养基，冷凝后备用，制备PDA半固体再生培养基，置于室温下冷却至40°C,吸取IOml培养基加入100 μ L原生质体悬液,混匀，直接倒在培养皿的原有的固体再生培养基上，使之铺满平皿形成一固体薄层，待培养基凝固后置于28°C培养箱中培养2~3d，即可见再生菌落。
10.如权利要求1所述的楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述原生质体固体再生培养基为:加入0.004%的去氧胆酸钠、lmol/L甘露醇、15g/L琼脂的PDA固体培养基。
【文档编号】C12N1/14GK103756917SQ201410016834
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】苗志奇, 陈榕华, 朱闪烁, 于湘莉, 唐克轩 申请人:上海交通大学