毛竹原生质体培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及林木生物技术和细胞工程育种领域，特别涉及到毛竹原生质体培养。
【背景技术】
[0002]作为植物细胞工程的重要组成部分，原生质体培养技术兴起于上世纪六七十年代，几十年来被广泛应用于植物的遗传和育种学研究领域。随着基因工程的发展，原生质体系统同时也成为基因表达及细胞内定位的重要工具，在生物技术领域发挥着重要的功能。
[0003]1960年，Cocking采用酶法分离原生质体获得成功，提供了一种大量制备有活力的原生质体的方法，开创了植物原生质体培养和细胞杂交的研究领域(参考文献I)。
[0004]1971年，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉原生质体获得完整的再生细胞，极大地推动了这方面的研究(参考文献2)；
[0005]1972年，Carlson用NaNO3做融合剂将两种烟草的原生质体融合，培养出世界上第一株体细胞杂种(参考文献3)；
[0006]原生质体培养技术的突破，促使人们期望通过体细胞杂交来转移目标性状进而实现植物的遗传改良，成为遗传育种学研究的新手段，随着培养技术的不断进步，原生质体培养技术相继在禾本科植物上取得成功，成为禾本科作物育种的重要途径。
[0007]1995年，Spangenberg等通过原生质体培养实现了多花黑麦草与高羊茅的体细胞杂交，将后者的CMS转移到前者(参考文献4);
[0008]1998年，Kisaka et al.获得水稻与大麦的族间体细胞杂种的再生植株并结实(参考文献5)；
[0009]2003年，Xia et al.利用小麦与高冰草获得可育杂种植株，并将高冰草的优质、耐盐等目标性状转入小麦(参考文献6)。这些研究工作极大地鼓舞了其他植物的原生质体培养热情，推动着这一繁琐而又复杂的培养体系不断地发展进步。
[0010]关于竹类植物原生质体培养的研究，报道甚少。1990年Huang et al.利用蓬莱竹Bambusa multiplex和绿竹Bambusa oIdhamii的愈伤组织，在I %的纤维素酶(Cellulysin)、2 % 的崩溃酶(Driselase)和 I % 的果胶酶(Pectolysase)上，于 12°C、80rmp酶解16h，获得原生质体；然后在附加BSA、arpinine HCUMES以及0.6M mannitol的培养基上，蓬莱竹原生质体成活率达60%，绿竹达40%，但未见植株再生(参考文献7)。
[0011]1994年阙国宁等以Dendrocalamus membranceus莖段为材料诱导出愈伤组织，然后在添加4%纤维素酶(Cellulase) R_10、2 %离析酶(Macerozyme)和0.25%果胶酶(Pectinase)的培养基上，在40_50rpm、28°C的黑暗条件下酶解6h，过滤、离心及纯化后获得了活力80%以上的原生质体，其产量达到了每克鲜重2.5 X 15个原生质体，但未见原生质体继代培养及植株再生(参考文献8)。
[0012]竹类植物原生质体培养的滞后，主要归咎于其再生体系的不够完善。竹是无形成层的特殊木本植物，其再生技术不同于普通的木本植物和草本植物，离体再生难度大，尽管国内外已有较多竹子愈伤组织再生的报道，但是多数研究存在重复性差、再生效率低等缺点，特别是制备再生原生质体的最佳材料-胚状体系统匮乏，阻碍了其原生质体培养的研究。虽然同为禾本科植物，但是竹子不如农业作物的经济价值高，因此相应的研究投入和重视度都不够，最终形成了竹类植物几无原生质体成功再生的现状。
[0013]鉴于竹类植物由于开花结实习性特殊导致的种质创新困难、育种技术匮乏等问题，本发明提供了毛竹原生质体培养的方法，从而为毛竹的细胞工程、基因工程以及分子生物学的研究提供技术平台，具有一定的理论研究价值，也能推动竹子的种质资源创新工作，具有重要的生产实践意义。
[0014]主要参考文献
[0015]1.Cocking EC(1960)A method for the isolat1n of plant protoplasts andvacuoles.1960，Nature 187，962-963 ;do1:10.1038/187962a0
[0016]2.Nagata T，Takebe I (1970)Cell wall regenerat1n and cell divis1n inisolated tobacco mesophyll protoplasts.Planta，92(4):301-308
[0017]3.Carlson PS，Smith HH(1972)Dearing RD.Parasexual interspecific planthybridizat1n.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences，69 (8):2292-2294
[0018]4.Spangenberg G，Wang Z Y，Wu X L，et al.(1995) Transgenic tallfescue (Festuca arundinacea)and red rescue (F.rubra)plants from microprojectilebombardment of embryogenic suspens1n cells.Journal of Plant Phys1logy，145(5):693-701.
[0019]5.Kisaka H，Kisaka M，Kanno A，et al.(1998)Intergeneric somatichybridizat1n of rice(Oryza sativa L.) and barley(Hordeum vulgare L.) byprotoplast fus1n.Plant cell reports，17 (5):362-367.
[0020]6.Xia GM(2009)Progress of chromosome engineering mediated by asymmetricsomatic hybridizat1n.Journal of Genetic Genomics 36:547-556
[0021]7.Huang L C，Huang B L，Chen ff L.(1990)Tissue culture investigat1ns ofbambo0.V.Recovery of callus from protoplasts of suspens1n-cultured Bambusacells.Bot Bull Acad Sin，31:29-34.
[0022]8.阙国宁，诸葛强(1994)黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离.林业科学研究，7(1):44-47
[0023]本发明的特点
[0024]纵观国内外对竹类植物原生质体培养的研究现状可知，当前仅有个别竹种被尝试应用于开展原生质体的培养，且研究局限于原生质体的分离阶段，尚未有实现植株再生的报道。作为我国和世界上最常见、最重要的竹种之一，目前尚未见关于毛竹原生质体培养的报道。对于开花结实习性特殊的竹类植物而言，原生质体培养体系的构建可以避开开花结实等常规育种途径的限制，通过细胞途径实现种质创新，显著推动其遗传学和育种学领域的深入研究，具有重要的理论和实践价值。经过开展大量研究和实验，并对同类研究进行了重要改进，发明人掌握了毛竹原生质体培养的关键技术，在国际上首次公开毛竹原生质体培养的方法。
【发明内容】
[0025]毛竹Phyllostachys edulis原生质体培养的方法，其特征包括:胚性愈伤组织的酶解，原生质体的分离与纯化，原生质体的培养，愈伤组织的分化，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下:
[0026](I)胚性愈伤组织的酶解:选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，将其放置在愈伤组织增殖培养基上，26°C暗培养7-15d，边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织，愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基础，添加l-3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉；然后将刚长出的白色较疏松的胚性愈伤组织分离，放入装有酶解液的培养皿中，并将培养皿置于70rpm的摇床上进行避光酶解3_5h，酶解液由2 %的cellulase、1.5 %的macerozyme、0.I %的MES、0.7M 的 manitol、0.1% 的 CaCl2.2H20、I % 的 BSA 组成，pH = 5.80 ；