一种peg介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别是一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002]胶孢炭疽病菌(gloeospor1ides)引起的梨炭疽病是一种世界性的植物病害，给世界农业生产造成严重的经济损失。近几年来，梨炭疽病多在我国黄河故道梨产区发生，尤其对砀山酥梨危害明显。2008年，砀山地区暴发梨炭疽病，病果率达到70%以上，给农业生产造成严重的经济损失(“梨胶胞炭疽病菌的分离、鉴定及其生物学特性”，刘邮洲等，江苏农业学报，2013，29 (1):60-64)。由于炭疽菌种类繁多，同属不同种炭疽菌在生物学特性、遗传多态性及致病机理等方面存在较大差异，至今鲜有对梨胶孢炭疽病菌的致病机理的报道，这也限制了对胶孢炭疽病菌侵染和致病机制的深入认识。
胶孢炭疽病菌的遗传转化是研究其生长发育与致病过程分子机制的基本工具，目前已有多种遗传转化技术在炭疽菌研究中得到应用，其中包括CaCl2/PEG介导的原生质体转化法(“杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达”，李思蒙等，林业科学，2013，49(5):121-127)、根癌农杆菌介导的方法(ATMT)(“The use of T-DNA tagging toisolate mutants of Colleto trichum gloeospor1ides and Colleto trichum acutatumwith reduced virulence against Hevea bras i liens is，，, Lin, Forest Pathology,2013，43:289_296)、电穿孔转化(“Genetic transformat1n with the gfp gene ofColletotrichum gloeospor1ides isolates from coffee with blister spot，，，Armestoet al, Brazilian Journal of Microb1logy，2012:1222-1229)等。ATMT 虽操作简便，但转化时间长，工作量大，适用于突变体库的构建；电穿孔转化法转化效率低，目前极少在真菌转化中应用；CaCl2/PEG是目前较为传统的转化方法，其操作步骤简便有效，可用于目的基因敲除和替换，已成为获得转化子的最普遍的转化技术。
[0003]在CaCl2/PEG转化过程中，原生质体的数量和转化质粒在胶孢炭疽病菌的转化过程中至关重要，直接影响转化效率，一是因为原生质体的数量与菌龄、菌量、酶解液的组分及酶解时间等因素密切相关；二是转化质粒与所用载体(包括启动子、报告基因和所含的抗性标记等)以及质粒浓度等密切相关。因此，目前尚未见高效、稳定的胶孢炭疽病菌遗传转化体系相关报道。
【发明内容】
[0004]针对上述内容，本发明提供一种高效、稳定的PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，本发明是这样实现的:
一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，具体步骤如下:
(A)将胶孢炭疽病菌菌丝置于盛有5ml酶解液的10ml离心管中，离心管平躺，30°C，60rpm振荡2h，以双层Miracloth (Calb1chem，USA)过滤收集胶孢炭疽病菌原生质体后置于离心管中，然后置于冷冻离心机中，于4°C，3000rpm离心lOmin ;离心后弃上清，取沉淀(即原生质体)加入1ml的STC缓冲液悬浮原生质体，于4°C，3000rpm离心5min ;再次弃上清，取沉淀(即原生质体)，加入STC缓冲液悬浮胶孢炭疽病菌原生质体，使其终浓度为10s个/ml ；
(B)将2Pg质粒DNA(5-10μ1)加入200μ1步骤(Α)获得的胶孢炭疽病菌原生质体中，混匀后室温静置25min ;然后加入lmlPTC缓冲液，混匀后室温静置25min ;然后倒入10ml含20(^g/ml博莱霉素的TB3固体培养基，混匀后倒入培养皿中，26°C，黑暗培养24h ;向培养皿中倒入10ml含40(^g/ml博莱霉素的TB3固体培养基，26°C下黑暗培养7_10d挑出转化子；
(C)将转化子加入含有40(^g/ml博莱霉素的PSA培养基中，26°C黑暗培养，连续培养3代，筛选获得性状稳定的转化子，所述性状稳定是指菌丝和分生孢子发出较强的绿色荧光且生长发育没有发生变化
所述酶解液配制方法为:取0.045g的裂解酶和0.005g的蜗牛酶，再加入0.7M NaCl溶液至5ml，用0.22um细菌过滤器过滤。
[0005](D)转化子的检测:
PCR检测:
根据转入胶孢炭疽病菌eGFP序列设计引物验证转化子，以CTAB法快速提取转化子DNA作为模板进行PCR扩增，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小。
[0006]焚光显微镜观察:
将PCR检测到GFP片段的转化子菌丝和孢子分别制成临时玻片，用Nikon荧光显微镜观察，转化成功的转化子发出强的绿色荧光。
[0007]进一步，本发明中，步骤(A)所述胶孢炭疽病菌菌丝是这样获得的:
(1)将胶孢炭疽病菌菌丝块接种到PSA培养基上，26°C黑暗培养10d，过滤收集孢子；
(2)将步骤(1)收集的孢子接种到50ml的CM液体培养基中，26°C，150rpm振荡培养
24h ；
(3)向步骤(2)的培养基中再添加50ml新的CM液体培养基，26°C，150rpm继续振荡培养24h后，过滤收集菌丝，即获得所述胶孢炭疽病菌菌丝；
进一步，本发明中，步骤(A)中孢炭疽病菌菌丝与酶解液的加入比例为每5ml酶解液中加入0.25g孢炭疽病菌菌丝。
[0008]进一步，本发明中，步骤(B)所述质粒为pYFll质粒。
[0009]所述CM 液体培养基是这样获得的:20XNitrate salts 20ml, Vitamin solut1nlml, Trace elements lml，D-Glucose 10g，加 ddH20 定容至 1L ;
其中，20 XNitrate salts 配方为:NaN03 120g，KC1 10.4g，MgS04.7H20 10.4g，KH2P0430.4g，加 ddH20 定容至 1L ；
Vitamin solut1n 配方为:B1tin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA 0.01g，Nicotnic acid 0.01g，加 ddH20 定容至 1L。
[0010]本发明实现了 PEG介导的胶孢炭疽病菌原生质体的遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株。本发明通过改进转化条件包括菌龄、菌量、酶解时间、质粒加入量及抗性筛选浓度，成功获得了具强荧光表达的转化子，转化效率达到20-22个转化子/ug DNA (以单位质量的DNA计)；另外，本发明转化所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子RP27，有效提高了转化菌株的荧光强度。
【附图说明】
[0011]图1为实施例中胶孢炭疽病菌对博莱霉素的抗性检测结果示意图。
[0012]图2为实施例中酶解液酶解原生质体2h后显微镜下效果图。
[0013]图3为实施例中GFP转化子图片。
[0014]图4为实施例中转化子绿色荧光蛋白基因的PCR扩增电泳图谱；
图中:泳道M:DNA Marker ;泳道1_9:不同转化子扩增eGFP基因部分片段；泳道10:野生型对照。
[0015]图5为实施例中转化子荧光显微检测结果图。
【具体实施方式】
[0016]为了更详细的理解本发明方法，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
[0017]实施例中涉及的培养基配方:
50%鹿糖溶液:鹿糖50g，补水至100ml，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0018]PSA培养基:取马铃薯200g洗净去皮后切成小块，加水煮烂，用四层纱布过滤，向滤液中加入20g鹿糖，补ddH20至1L，加入琼脂粉15 g，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0019]酶解液:取0.045g的裂解酶(Lysing enzyme，购自美国sigma-aldrich公司)和
0.005g的蜗牛酶(Snailase，购自索莱宝Solarb1公司)加入0.7M NaCl溶液至5ml，充分溶解后，用0.22um细菌过滤器过滤除菌后获得。
[0020]STC 缓冲液:蔗糖 50g，0.5M Tris_HCl(pH=8.0)25ml，CaCl2.2Η20 1.838g，用 ddH20充分溶解后定容至250ml，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0021]PTC缓冲液:取PEG4000 60g溶于STC缓冲液中，定容至100ml，65°C水浴锅加热完全溶解后，用0.22um细菌过滤器过滤除菌。
[0022]TB3培养基:取酵母提取物(Yeast extract)3.0g，酸水解酪蛋白3.0g，鹿糖200g，充分溶解后补ddH20至1L，121°C高压蒸汽灭菌20min。
[0023]CM 液体培养基:20XNitrate salts 20ml，Vitamin solut1n 1ml，Traceelements lml，D-Glucose 10g，加 ddH20 定容至 1L ;
其中，20 XNitrate salts 配方为:NaN03 120g，KC1 10.4g，MgS04.7H20 10.4g，KH2P0430.4g，加 ddH20 定容至 1L ；
Vitamin solut1n 配方为:B1tin 0.01g，Pyri