一种海洋解淀粉芽孢杆菌1a的分离方法与用途
【专利摘要】本发明是一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途，所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌，葡萄白腐病菌，梨链格孢菌，柑橘青霉菌。所述的海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法通过采集连云港海域海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，富集后进行细菌的分离及纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；再采用平板对峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；再采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到抑菌带宽度均大于10mm的解淀粉芽孢杆菌1A。本发明具有广泛的应用前景。
【专利说明】一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种菌株的分离方法，特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌IA的分离方法，本发明还涉及前述分离方法得到的解淀粉芽孢杆菌IA的用途。
【背景技术】
[0002]果实采后腐烂是一个全球性问题。新鲜水果在采收、分级、包装、运输、贮藏、批发、零售整个采后流通过程中都有可能腐烂损失，在世界范围内新鲜果蔬贮运过程中约有25%的产品因腐烂变质不能利用，有些易腐水果采后腐烂损失达到30%以上。目前控制果品产后病害主要依靠化学防治，然而化学农药的大量使用导致的农产品农药残留、病原菌抗药性产生、环境污染等问题已成为世界性难题。生物防治可弥补化学农药的不足，成为植物病害防治的重要手段。应用有益微生物防治果品产后病害引起广泛重视，并取得了许多成果。目前用于果品产后病害的微生物菌株主要来源于陆源微生物。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种来自海洋解淀粉芽孢杆菌IA的新的对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途。
[0004]本发明所要解决的另一技术问题是提供了解淀粉芽孢杆菌IA的分离方法。
[0005]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了海洋解淀粉芽孢杆菌IA {Bacillus对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途；所述的果品产后病原真菌为:苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides ),葡萄白腐病菌(CbflieWa 梨链格抱菌(kikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium italicum)。
[0006]本发明中涉及的海洋解淀粉`芽孢杆菌IA的分离方法步骤如下:
(I)样品的采集与富集:连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理:
海水样品:采集来的海水混匀，5mL加入到装有45mL富集培养基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ；
海泥样品:取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ；
鱼体样品:鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入装有45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25°C，180r/min的条件下摇床培养2d ；
贝类样品:取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml三角瓶中，180r/min，25°C条件下摇床培养2d ；
浒苔样品:用无菌海水冲洗浒苔样品3次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中，并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ；
螃蟹样品:用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml三角瓶中，并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ；
(2)细菌的分离及纯化:分别取ImL上述富集后的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10_4、10_5、10_6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次；观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；
(3)初筛:采用平板对 峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用；方法如下=PDA培养基平板中央接种直径为8mm果品产后病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15_处划线接种海洋细菌纯菌株，重复3次，28°C倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；所述的4种果品产后病原真菌为:苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌diplodiella)，.^链格抱菌(Alterrmria kikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium i tali cum)；
(4)复筛:将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下:接种I环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振荡培养36h，发酵液在4°C，12000 r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清液，用孔径为0.22 μ m的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液；采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到对4种果品产后病原真菌的抑菌带宽度均大于IOmm的菌株海洋解淀粉芽孢杆菌1A，该菌株分离自海水样品；
所述的富集培养基、分离培养基、种子培养基和发酵培养基均为2216E培养基。
[0007]以下对本发明进行进一步说明。
[0008]本发明方法所涉及的材料解淀粉芽孢杆菌IA (,Bacillus amyloliquefaciensstrain 1A)(下称菌株1A)已经于2013年7月I日在Genebank公开(登录号为KF112077)，网址为:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/KFl 12077? 该菌株为公知公用材料，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。
[0009]以下是发明人做的相关实验:
I材料与方法
1.1供试病原菌
炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides )葡萄白腐病舊 QConiella)、梨链格抱菌(Mtemaxi a kikuchi ana)、柑橘青霉菌(Penici I I i umi tal i--)，由中国农科院植保所提供，淮海工学院海洋学院实验室保存。
[0010]1.2样品的处理与富集
连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼等样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理:
(I)海水样品:采集来的海水混匀，5mL加入到装有50mL富集培养基的250ml的三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d。[0011](2)海泥样品:取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d。
[0012](3)鱼体样品:鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，25°C，180r/min的条件下摇床培养2d。
[0013](4)贝类样品:取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml的三角瓶中，180r/min，25°C条件下摇床培养2d。
[0014](5)浒苔样品:用无菌海水冲洗浒苔样品3次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中。并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d。
[0015](6)螃蟹样品:用剪刀剪取部分蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d。
[0016]1.3菌株的分离及纯化
取ImL处理好的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10_4、10_5、10_6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次。观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化。
[0017]1.4菌株对几种水果储藏病原菌的抑制作用测定
采用平板对峙法测定分离菌`株对供试4种病原真菌的抑制作用。PDA培养基平板中央接种直径为8mm病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15mm处划线接种分离菌株，重复3次，28°C倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度。抑菌作用较强的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，测定发酵液的抑菌作用。
[0018]将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下:接种I环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，280C，180r/min振荡培养36h，发酵液在4°C，12000 r/min条件下离心20min,弃沉淀，上清液，用孔径为0.22 μ m的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液。
[0019]1.5菌株对几种水果储藏病原菌的菌丝破坏作用观察
液体共培养法:病原真菌在PDA平板中培养5d后,用直径为5 mm的打孔器在培养好的病原真菌的菌落边缘打取菌苔5块，放入装有50mL海水H)培养基的250mL的三角瓶中，再向三角瓶中接种菌体浓度为1.0 X IO8个/ mL的IA菌株悬浮液lmL，在28°C、180 r/min条件下恒温震荡培养5d，显微镜下观察病原真菌的菌丝形态。
[0020]1.6菌株无菌发酵液对病原真菌孢子萌发的抑制作用
用5mL无菌水洗下培养5 d的梨供试的水果产后病原真的菌落，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，滤液在室温，4000 r/min下离心IOmin，沉淀即为分生孢子，用制备好的无菌发酵液配制孢子悬浮液，浓度为IO6个孢子/mL，取20 μ L孢子悬浮液滴加在无菌玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，28°C下恒温保湿培养，分别于2，4，6，8，IOh观察孢子萌发情况，测定芽管长度，计算孢子萌发率和抑制率。
[0021]孢子萌发率(％)=(萌发孢子数/观察孢子总数)X 100%。[0022]抑制率(％)=(对照孢子萌发率或芽管长度-孢子萌发率或芽管长度)/对照孢子萌发率或芽管长度X100%
1.7菌株无菌发酵液对几种水果防腐作用测定
取无病无伤、大小和成熟度相似的新鲜苹果、梨、柑橘，用2 %的NaClO溶液表面消毒后，清水洗净晾干。在果实腰部9cm2的区域用无菌针刺成微孔，进行如下处理:
(1)涂抹接种100μ L的菌株IA菌悬液，2 h后接种病原菌孢子悬液100 μ L ;
(2)先接种病原菌的孢子悬液100μ L，2 h后涂抹100 μ L的菌株IA菌悬液；
(3)单纯接种病原菌的孢子悬液100μ L ;
(4)只涂抹接种IOOyL的菌株IA菌悬液。处理后的果实放到保湿缸内，保持95%的湿度，在25 1:条件下恒温保湿培养，7 d后统计果实的发病率和病斑直径，每个处理10个果实。
[0023]葡萄的处理:取健康无病葡萄果实50粒，75%酒精表面消毒2min，无菌水冲洗3次进行如下处理:
(O从葡萄的基部涂抹菌株IA发酵液20 μ L，干燥后接种葡萄白腐病菌的菌悬液10μ L ；
(2 )从葡萄的基部接种葡萄白腐病菌的菌悬液10 μ L，2 h后涂抹菌株IA发酵液20 μ L ;
(3)只接种菌株IA菌悬液20μ L ;
(4)只接种葡萄白腐病菌菌悬液10μ L，25 °C条件下保湿培养，观察果实始病时间，计算果腐率。试验重复3次。
[0024]抑制率(％)=(对照发病面积或果腐率-处理发病面积或果腐率)/对照发病面积或果腐率X 100%
1.8菌株的鉴定
1.8.1形态学观察
对分离到有较强抗菌作用的菌株接种于LB培养基平板上，28°C恒温培养24h，观察记录菌落形态，测定菌体大小，并进行革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色。
[0025]1.8.2生理生化鉴定
生理生化试验参考文献方法，测定吲哚试验、M.R.试验、V.P.试验、硫化氢试验、油脂水解试验、石蕊牛奶试验、接触酶试验、糖醇发酵试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、半固体琼脂穿刺试验、好氧性和明胶液化等生理生化指标。
[0026]1.8.3 16SrDNA序列的扩增分析
采用CTAB法提取不同菌株的基因组DNA，应用细菌16SrDNA基因通用引物:27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R: 5’ -GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’ 扩增 16SrDNA 序列，PCR 反应体系见表 I。
[0027]表1菌株16SrDNA序列扩增PCR反应体系
【权利要求】
1.一种海洋解淀粉芽孢杆菌IA (Bacillus amyloliquefaciens)对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途；所述的果品产后病原真菌为:苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides )，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella),梨链格抱菌(Alternariakikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium italicum)。
2.一种如权利要求1所述用途中涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌IA的分离方法，其特征在于，其步骤如下: (1)样品的采集与富集:连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理: 海水样品:采集来的海水混匀，5mL加入到装有45mL富集培养基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ； 海泥样品:取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ； 鱼体样品:鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入装有45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25°C，180r/min的条件下摇床培养2d ； 贝类样品:取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml三角瓶中，180r/min，25°C条件下摇床培养2d ； 浒苔样品:用无菌海水冲洗浒苔样品3次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中，并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ； 螃蟹样品:用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml三角瓶中，并于25°C、180r/min的条件下摇床培养2d ； (2)细菌的分离及纯化:分别取ImL上述富集后的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10_4、10_5、10_6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次；观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株； (3)初筛:采用平板对峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用；方法如下=PDA培养基平板中央接种直径为8mm果品产后病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15_处划线接种海洋细菌纯菌株，重复3次，28°C倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；所述的4种果品产后病原真菌为:苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella),梨链格抱菌(Alternaria kikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium i tali cum)； (4)复筛:将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下:接种I环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28°C，180r/min振荡培养36h，发酵液在4°C，12000 r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清液，用孔径为0.22 μ m的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液；采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到对4种果品产后病原真菌的抑菌带宽度均大于IOmm的菌株海洋解淀粉芽孢杆菌1A，该菌株分离自海水样品； 所述的富集培养基、`分离培养基、种子培养基和发酵培养基均为2216E培养基。
【文档编号】A23B7/155GK103695360SQ201410013742
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】马桂珍, 暴增海, 王淑芳 申请人:淮海工学院