专利名称：利用褐多孔菌的发酵液分离制备的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物的制备方法，特别涉及一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。本发明制备的化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)是一新的天然产物，可抑制多种植物病原真菌的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌有很好的抑制作用。
背景技术：
高等真菌包含子囊菌纲(Ascomycetes)的部分种和担子菌纲(Basidiomycetes) 真菌。由于长期协同进化作用，很多高等真菌形成了自己特有的化学防御体系。一旦受伤即启动系统分泌酶将次生代谢物转化为有活性的物质。一个有趣的现象是很多大型真菌的子实体从来不被昆虫侵袭。其中一个典型的例子是乳菇属中无活性的stearoyl velutinal受损反应后立刻转化为具有很强活性的抗生素isovelleral。此外，人们通过实验对比受伤和未受伤的子实体，发现子实体在受伤后很快产生大量的次生代谢产物，这些产物具有抗真菌、杀虫等多种活性。由此看来，高等真菌也是生物源农药研究和开发的重要资源。从高等真菌发酵物中寻找具有杀虫抑菌作用的先导化合物已引起国内外学者的极大关注。一方面是因为从大型真菌中不断发现结构新颖和具有显著生物活性的化合物， 且结构变化大。这种结构多样性对于药物(或农药)的发现有重要意义。另一方面，大型真菌不仅可以直接采来作为研究材料用，而且可以较方便地通过菌丝体或孢子发酵培养，其优点是可以进行工业化连续生产、规模大、产量高、发酵周期短、生产效益高。这为今后可能的工业化生产提供了资源保证，相对于受资源的限制植物源农药这是一个潜在的优势。改进发酵过程中的条件，促进发酵过程朝向提高目的产物的方向进行，提高产物品质，降低发酵成本，使投入产出比达到最小，是液体发酵研究的一个方向。药用真菌在液体发酵过程中，除菌丝或孢子会大量增殖外，还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物。这些物质分别对心血管、肝脏、神经系统、性器官等人体器官具有防病治病的作用，并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗溃疡等功效。人们对药用真菌的液体发酵，除获得菌丝体外，还以获取上述具有活性的次生代谢产物为目的。利用高等真菌开发农药已有商业成功的先例如德国学者从高等真菌嗜球果 KStrobilurus tenacellus)中发现了具有杀霉菌活性的先导化合物strobilurin，但该项目险些被中断，因为该化合物在田间实验中显示的活性并不强。从化学的角度讲， strobilurin含有共轭双键，不稳定，易被氧化。依此为母体合成了约10000个化合物，从中德国巴斯夫公司(BASF)开发出的一类新农药Kresoxim-methyl (商品名Brio，Allegro， Diskus, Juwe 1, Mentor等杀霉菌剂)，另一家公司kneca也一直进行类似的研究，该公司最后成功地合成了化合物ICIA5504，也具有非常好的活性，商品名为Amistar。现在这类化合物全世界每年的销售额已达到5亿多美元。这类化合物可抑制线粒体的呼吸而致效，对子囊菌、担子菌、不完全菌及卵纲菌等广范围病原菌具有杀菌效果，除水稻稻瘟病外，还对水稻纹枯病、穗枯病、叶枯病等水稻病害具有抑制效果。褐多孔菌(Z^^^or^s picipes Fr)为担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，属木腐菌， 生于阔叶树腐木上，有时也生于针叶树上，导致桦、椴、水曲柳、槭或冷杉的木质部形成白色腐朽。子实体大。盖直径4-16cm，厚2-3.5mm，扇形、肾形、近圆形至圆形，稍凸至平展，基部常下凹，粟褐色，中部色较深，有时表面全呈黑褐色，光滑，边缘薄而锐，波浪状至瓣裂。菌柄侧生或偏生，长2-5mm，粗0. 3-1. 3cm,黑色或基部黑色，初期具细绒毛后变光滑。菌肉白色或近白色，厚0.5-2mm。菌管延生，长0. 5_1. 5mm，与菌肉色相似，干后呈淡粉灰色。管口角形至近圆形，每毫米5-7个。子实层中菌丝体无色透明，菌丝粗1.2-2 μ m。孢子椭圆形至长椭圆形，一端尖狭，无色透明，平滑，5. 8-7. 5 μ mX 2. 8-3. 5 μ m。它分布于辽宁、吉林、黑龙江、河北、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、广西、福建、四川、云南、贵州、西藏等地。它能调节内分泌功能，软化血管，调节血压，溶化血栓，防治心肌梗死和脑血栓，并具有预防和延缓心脏老化，增强人体免疫功能，调节大脑神经功能，抗衰老之功效。褐多孔菌配方的心脑血管系列汤剂可治疗高心病、冠心病、风心病、肺心病、心肌炎、心肌劳损、心肌梗死以及脑梗塞、脑积水、脑震荡后遗症等。大兴安岭原始森林的褐多孔菌及其系列煎剂，旨在改善或恢复心脑血管内在的供给机制和代谢机制、溶栓和恢复胶原蛋白的活力，使血液中的甘油三脂、胆固醇等恢复正常，疗效确切。ffi^^lK [A. A. Morais, R. B. Fo, S. V. Fraiz Jr. Synthesis of three natural 1,3-diarylpropanes: Two revised structures, Phytochemistry,1989,28(1) 239-M2]和[蔡孟深，王兰明.碳苷研究一XXVI.异黑豆素类似物的合成，化学学报， 1990,48,1191-1198]仅报道了 2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮作为人工合成的中间体；但未见其作为天然产物与抗植物病原真菌活性的相关报道。申请人曾经首次报道了褐多孔菌发酵代谢物的抑菌活性初步研究(董艳红，张鞍灵，马慧妮，李晓明，高锦明，西北林学院学报， 2007,22 (2) :105-108)，但是，发酵液中抗菌活性化合物尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2， 4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的方法。为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案
一种利用褐多孔菌的发酵液进行分离制备化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II) 的方法，其特征在于，该方法采用平皿转瓶液体培养的方法，首先用去皮马铃薯、葡萄糖、蒸馏水，经灭菌制成培养基，液体培养基的PH值为7. 2 ；然后培养发酵得发酵液，用乙酸乙酯萃取发酵液得到浸膏；通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/Me0H梯度洗脱， 常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、S^hadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II )纯品。具体按下述步骤进行
1)菌株的发酵和发酵液的浓缩
从经活化的固体平板菌种(28°C，培养5 6d)取8 10 mm2大小的菌饼2 3块接入以去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蒸馏水lOOOmL，pH7. 2左右，121°C灭菌30min制成的液体PDA培养基(装液量为50mL/150mL三角瓶)内，于旋转摇床(150r/min)培养3 4 天形成菌球后以10%的接种量转接于发酵瓶中(装液量为150mL/500mL三角瓶)，发酵11 13d，共得到发酵液50L，将50L发酵液于55°C下减压浓缩减半；
2)粗提物的制备
发酵物浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯浸膏16g ；
3)选取乙酸乙酯浸膏为材料，通过有机溶剂浸提，经加压正相硅胶层析，用CHCl3/MeOH 梯度洗脱，常压柱层析采用湿法装柱和硅胶拌样上柱，根据薄层展开情况选择洗脱溶剂系统，经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及薄层制备与重结晶法进行分离，得到纯化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)。本发明的方法具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短等优点。将本发明制备的化合物2，4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)开发成抗植物病原真菌抗生素的原药，可抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌具有显著的抑制作用，能够解决2，4_ 二羟基-5-甲基-苯乙酮的原料来源问题。
图1是褐多孔菌发酵液分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)的流程图2 图11是化合物2，4_ 二羟基-5-甲基-苯乙酮的结构鉴定图，其中，图2是化合物II红外光谱图；图3是化合物II紫外光谱图；图4是化合物II的1HNMR ；图5是化合物II 的13CNMR ；图6是化合物II的HMBC ；图7是化合物II的H-HCOSY ；图8是化合物II的HSQC ； 图9是化合物II的NOESY ；图10发酵原液中化合物II的HPLC色谱图；图11化合物II抑菌曲线图。以下结合附图对本发明作进一步详细描述。
具体实施例方式申请人:首次从褐多孔菌iPolyporus发酵液中进行分离制备了化合物 2,4- 二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)并测定了它的抗病原真菌活性。EC5tl值证明，该天然产物可抑制多种植物病原真菌菌丝体的生长，对棉花枯萎病菌，玉米弯孢病菌，苹果炭疽病菌具有显著的抑制作用。已知的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的化学结构如下；
权利要求
1.利用褐多孔菌的发酵液分离制备的化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(II)用于制备植物病原真菌抗生素的药物应用。
全文摘要
本发明涉及一种利用褐多孔菌(Polyporuspicipes)的发酵液进行分离制备化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(Ⅱ)的方法，该方法采用平皿转瓶液体培养的方法，首先用去皮马铃薯，葡萄糖，蒸馏水，pH7.2左右，灭菌制成培养基；然后培养发酵得发酵液，用乙酸乙酯萃取发酵液得到浸膏，用柱层析分离，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱；经过多次正相硅胶柱层析、反相C18柱、SephadexLH-20凝胶柱层析以及重结晶法进行分离，得到纯化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(Ⅱ)。本发明可以将化合物2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮(Ⅱ)开发成为抗病原真菌抗生素的原药，并解决2，4-二羟基-5-甲基-苯乙酮的原料来源问题，具有培养条件温和、培养基配制简单易行、发酵时间短等优点。
文档编号A01P3/00GK102334476SQ20111021397
公开日2012年2月1日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者张炜玲, 张鞍灵, 李勇, 石新卫, 解思达, 高锦明 申请人:西北农林科技大学